Xây dựng plasmid biểu hiện và phát hiện các protein dung hợp 159 4. Tách chiết các protein dung hợp để sản xuất kháng thể 160[r]
(1)MỤC LỤC
Trang
LỜI NÓI ĐẦU
Chƣơng CÁC ENZYME DÙNG TRONG TẠO DÒNG
PHÂN TỬ 2
I Các enzyme hạn chế
1.Các endonuclease hạn chế type II
2 Gắn đầu tận bị cắt enzyme hạn chế
3 Isochizomer
4 Methyl hóa
5 Cắt DNA enzyme hạn chế
II Các enzyme trùng hợp
1 DNA polymerase
2 RNA polymerase 12
3 Enzyme phiên mã ngược 13
4 Terminal transferase 14
III Các enzyme gắn 15
1 Bacteriophage T4 DNA ligase 15
2 Bacteriophage T4 RNA ligase 16
3 Bacteriophage T4 polynucleotide kinase 16
4 Alkaline phosphatase 17
IV Các enzyme phân cắt 18
1 Deoxyribonuclease I 18
2 Nuclease S1 19
3 Exonuclease III 20
4 Ribonuclease 21
5 RNase H 21
(2)Tài liệu tham khảo/đọc thêm 22
Chƣơng ĐIỆN DI NUCLEIC ACID 24
I Nguyên lý chung 24
II Điện di agarose gel 24
agarose gel
26 29
3 Quy trình điện di 33
II Điện di polyacrylamide gel 35
1 Điện di nucleic acid 36
2 Điện di protein 43
Tài liệu tham khảo/đọc thêm 48
Chƣơng KHUẾCH ĐẠI IN VITRO DNA BẰNG PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE
49
I Nguyên tắc PCR 49
II Quy trình PCR 52
1 Thành phần phản 52
2 Thực phản ứng 53
III Tối ưu hóa điều kiện cho PCR 56
56 56
3 Magnesium 57
57
5 Enzyme Taq pol 57
pol 58
(3)58
10 Khởi động nóng PCR 59
IV Thiết kế primer 60
60 61
3 Tm 62
V Kỹ thuật RT-PCR 62
VI Real-time PCR 63
1 Giới thiệu chung 63
2 Phân tích tổng quát phản ứng real-time PCR 63 Một số ứng dụng real-time PCR 65
VII Một số ứng dụng PCR 65
1 Sử dụng PCR để tạo nhanh gen tổng hợp 66
2 Taọ dòng cDNA PCR 66
3 Ứng dụng di truyền 69
4 Ứng dụng chẩn đoán lâm sàng 70
Tài liệu tham khảo/đọc thêm 70
Chƣơng CÁC HỆ THỐNG VECTOR 70
I Plasmid vector 73
1 Đặc điểm plasmid 73
2 Tạo dòng plasmid 78
II Bacteriophage vector 84
1 Đặc điểm bacteriophage 85
2 Tạo dòng bacteriophage 86
III Cosmid vector 90
1 Đặc điểm cosmid 90
(4)1 Đặc điểm bacteriophage M13 93
2 Tạo dòng bacteriophage M13 93
V BAC vector 95
1 Đặc điểm BAC 95
2 Tạo dòng BAC 96
VI YAC vector 98
1 Đặc điểm YAC 98
2 Tạo dòng YAC 99
Tài liệu tham khảo/đọc thêm 101
Chƣơng TẠO DÒNG GENOMIC DNA CỦA EUKARYOTE VÀ XÂY DỰNG THƢ VIỆN GENOMIC DNA
102
102 II Tạo dòng đoạn DNA để xây dựng thư viện genome 104 104
vector 105
106
4 Các BAC vector 106
5 Các YAC vector 106
III Đóng gói in vitro DNA tái tổ hợp xâm nhiễm vào tế bào vật chủ
107 IV Phân tích genomic DNA lai Southern 108 agarose gel
109 111 113
V Sàng lọc thư viện genomic DNA 116
(5)1 Đánh dấu đuôi 118
2 Đánh dấu dịch chuyển điểm đứt 119
3 Đánh dấu kéo dài đoạn mồi 119
VII Ứng dụng thư viện genomic DNA 121
VIII Phân tích trình tự đoạn DNA tạo dịng 122
1 Phương pháp hóa học Maxam-Gilbert 122
2 Phương pháp enzyme Sanger 124
3 Xác định trình tự nucleotide máy tự động 124
Tài liệu tham khảo/đọc thêm 128
Chƣơng TẠO DÒNG VÀ XÂY DỰNG THƢ VIỆN cDNA 129 I Tách chiết, tinh phân tích RNA 129
1 Tách chiết tinh RNA 129
2 Phân tích RNA 131
II Tổng hợp cDNA 132
1 Tổng hợp sợi cDNA thứ 133
2 Tổng hợp sợi cDNA thứ hai 134
3 Cắt vịng cặp tóc nhờ nuclease S1 136
III Tạo dịng phân tử cDNA sợi đơi 136
1 Đuôi đồng trùng hợp 136
2 Các linker adapter nhân tạo 137
IV Các phương pháp tạo dòng cDNA khác 140
1 Tạo dòng mRNA-cDNA 140
2 Bổ sung linker khác 141
3 Tạo dòng cDNA primer-adapter 141 V Các bacteriophage vector dùng tạo dòng cDNA 143 Các bacteriophage vector dùng phổ biến 143
(6)VI Nhận dạng dòng cDNA quan tâm 147
1 Các phương pháp sàng lọc 147
2 Các phương pháp xác nhận dòng cDNA 150 VII Xây dựng thư viện cDNA bacteriophage vector 151
1 Chọn lọc kích thước cDNA 151
2 Gắn cDNA với nhánh bacteriophage 151
3 Phân tích đoạn chèn cDNA 152
4 Tạo thư viện cDNA hoàn chỉnh 152
5 Khuếch đại thư viện cDNA 153
Tài liệu tham khảo/đọc thêm 153
Chƣơng ỆN GEN TÁI TỔ HỢP TRONG
Escherichia coli
155
I Sản xuất protein dung hợp 156
1 Protein dung hợp 156
2 Các hệ thống vector biểu gen dung hợp với gen lacZ 157 Xây dựng plasmid biểu phát protein dung hợp 159 Tách chiết protein dung hợp để sản xuất kháng thể 160
II Sản xuất protein nguyên thể 160
1 Promoter PL bacteriophage λ 161
2 Promoter trp-lac 163
3 Promoter bacteriophage T7 164
III Xác định mức độ biểu gen tạo dòng 166
1 Western blot 167
2 ELISA 168
IV Tăng mức độ biểu gen tạo dòng 170
V Tinh protein 170
1 Thể vùi phương pháp hòa tan thể vùi 170
(7)Tài liệu tham khảo/đọc thêm 175
Phụ lục MỘT SỐ THUẬT NGỮ CƠ BẢN 176
Tài liệu tham khảo 203