PHẠM HÙNG VÂN PCR real-time PCR Các vấn ñề áp dụng thường gặp NHÀ XUẤT BẢN Y HỌC Chi Nhánh Thành Phố Hồ Chí Minh 2009 Lời nói ñầu Cách ñây 14 năm, TS Nguyễn Đức Thái, ñó ch nhi m chương trình nghiên cứu gene thiên ñầu thống glaucoma) UCSF, thăm báo cáo kỹ thuật PCR với mong ước kỹ thuật ñược ứng dụng chẩn ñoán - nghiên cứu y học Việt Nam, nơi bắt ñầu Đại Học Y Dược TP Hồ Chí Minh Trong phần thảo luận sôi hôm ñó, có nhiều ý kiến phấn kích ứng dụng tuyệt vời PCR, có tiếng nói hòai nghi cho kỹ thuật khó áp dụng ñược cách rộng rãi Việt Nam chưa thể thoát ñược ñiều kiện hạn chế quốc gia có thu nhập thấp, tảng khoa học kỹ thuật chưa sẵn sàng cho kỹ thuật cao cấp Tuy nhiên, thời gian ngắn không hai năm sau ñó, năm với ñộng viên GS Đỗ Đình Hồ khuyến khích tạo ñiều kiện Ban Giám Hiệu nhà trường thời ñó, ñơn vị sinh học phân tử y khoa ñã ñời với ứng dụng PCR ñầu tiên ñược triển khai PCR phát M tuberculosis bệnh phẩm khác Một trường hợp xét nghiệm PCR thành công mà quên ñược ñã giúp chẩn ñoán xác ñịnh mẹ Phó Giám Đốc Bệnh Viện TP HCM bị lao thận ung thư thận chẩn ñoán lâm sàng, nhờ vài tháng sau ñiều trị, mẹ anh ñã hết hẳn tiểu máu, chịu liệu pháp phẩu thuật nặng nề mà không trúng ñích Tiếp tục từ thành công PCR chẩn ñoán lao này, ñã triển khai thành công PCR phát HBV ñến tác nhân khó HCV Thành công xây dựng phát triến kỹ thuật RT-PCR phát HCV vào năm ñã củng cố thêm niềm tin chúng tôi, ñó nắm kỹ thuật, tìm ñược nguồn hóa chất cần thiết, có ñược mẫu thử, có tâm kỹ thuật dù có khó RT-PCR ñưa vào ứng dụng thành công chẩn ñoán Từ mầm ban ñầu mà ñơn vị sinh học phân tử y khoa trường Đại Học Y Dược TP HCM ñã g lĩnh vực y khoa, PCR chí real-time PCR ọi qPCR), ñã ñược nhiều nhà nghiên cứu nhà lâm sàng Việt Nam biết ñến cho ñịnh xét nghiệm ñể phục vụ cho mục ñích chẩn ñoán hay theo dõi ñiều trị Ngoài ra, lĩnh vực chăn nuôi thú y nuôi trồng thủy sản, yêu cầu kiểm soát phát tác nhân gây dịch bệnh, PCR ñược sử dụng nhiều phòng thí nghiệm không viện nghiên cứu lớn trung ương mà ñịa phương Có thể nói so sánh với nước khu vực Thái Lan, Malaysia, Philippine, Indonesia l nh vực áp dụng PCR qPCR chẩn ñóan, Việt Nam không thua Chỉ có khác biệt Thái lan, y khoa chẳng hạn, ñịnh xét nghiệm PCR/qPCR ñược thực bệnh viện hay trung tâm lớn ña số xét nghiệm ñược thực hệ thống kín Cobas Taqman, hay Amplicor Roche Trong ñó Việt Nam, xét nghiệm ñược thực nhiều bệnh viện lớn kể vài bệnh viện tuyến tỉnh hay chí số bệnh viện tư nhân, trung tâm/phòng xét nghiệm tư nhân Lý vậ ñã khai thác kỹ thuật PCR/qPCR kỹ thuật mở Chính yếu nhờ , cần thiết bị luân nhiệt thích hợp máy PCR real-time PCR mà giá không cao ngất ngưỡng nữa) số thiết bị thông thường khác có phòng thí nghiệm là xét nghiệm PCR với thuốc thử tự chế mồi me-brews) hay vài công ty nước sản xuất dựa imers) hay ñọan dò tự thiết kế hay ñã ñược phổ biến tạp chí Tình hình phát triển có lợi mà có cần chấn chỉnh Lợi kỹ thuật phổ biến ñược nhà lâm sàng có thêm phương tiện xét nghiệm ñể phát bệnh, ñể theo dõi ñiều trị với giá thành vừa phải làm ñược nhiều nơi Nhưng vấn ñề cần phải chấn chỉnh ñó làm ñể kiểm sóat ñược chất lượng xét nghiệm PCR qPCR ñược thực nơi Kiểm sóat chất lượng ñây theo phải có certificate từ quan nhà nước thật chưa có quan nhà nước thực vấn ñề kiểm sóat chất lượng xét nghiệm này, nghĩ có ñi certificate có giá trị mẫu ñược kiểm tra Do vậy, theo ñó thân người làm xét nghiệm nhà chế tạo kit phải nhận diện cho ñược xét nghiệm PCR/qPCR, ñiểm khâu thực xét nghiệm phải ñược kiểm sóat ñể kết xét nghiệm ñúng với chất lượng ñược người sản xuất thông báo hay người làm xét nghiệm mong muốn Để làm ñược vậy, hiểu biết vấn ñề xét nghiệm PCR/qPCR ñối với người làm xét nghiệm người nhận kết xét nghiệm hay sử dụng xét nghiệm cần thiết Đây lý viết sách với ước mong ñóng góp phần kiến thức hạn chế cho nghiệp phát triển ứng dụng công nghệ sinh học phân tử y học sinh học nước nhà Mục lục Lời nói ñầu Mục lục Polymerase Chain Reaction Các vấn ñề PCR Nguyên tắc PCR Lịch sử phát minh PCR Các chìa khóa kỹ thuật ñã giúp hoàn thiện PCR 11 Phát sản xuất ñược enzyme polymerase chịu nhiệt 11 Chế tạo ñược máy luân nhiệt hoạt ñộng hiệu 11 Tìm ñược phương pháp lọai trừ ngoại nhiễm sản phẩm khuếch ñại 13 Vai trò mồi (primers) 14 Cách pha PCR mix 16 Kiểm tra ñộ nhạy PCR mix ñã pha 19 Các PCR thường ñược sử dụng chẩn ñoán phát tác nhân nhiễm trùng 20 PCR ñơn mồi (monoplex PCR) 21 PCR ña mồi (multiplex PCR) 21 PCR tổ (nested PCR) 21 PCR tổ không dừng (non-stop nested PCR) 22 Touch-down PCR 23 RT-PCR 24 PCR ứng dụng y sinh học 28 PCR công nghệ gene 28 PCR pháp y 31 PCR chẩn ñoán sàng lọc bệnh lý di truyền 31 PCR phát tác nhân vi sinh vật gây bệnh nhiễm trùng 32 PCR ñòn bẩy thúc ñẩy nhanh công nghệ giải trình tự 32 Real-time PCR Các vấn ñề 34 Real-time PCR gì? 34 Các vấn ñề kỹ thuật cần biết real-time PCR 34 Biểu ñồ khuếch ñại real-time PCR 34 Biểu ñồ chuẩn real-time PCR 36 Máy real-time PCR 41 Sử dụng nguồn sáng kích thích ñèn tungstene dùng kính lọc ñể chiếu nguồn sáng có ñộ dài sóng ñịnh lên toàn giếng chứa tube phản ứng 41 Thiết bị real-time dùng sợi quang học (fiber optic cables) ñể ñưa nguồn sáng kích thích ñến tube phản ứng 42 Thiết bị real-time dùng ñèn led làm nguồn sáng kích thích 42 Hóa chất thuốc thử cho real-time PCR 43 Chất phát huỳnh quang loại màu huỳnh quang chèn vào sợi ñôi DNA 43 Real-time PCR sử dụng probe làm chất phát huỳnh quang 51 Các ứng dụng real-time PCR 60 Định lượng tác nhân ñích có mẫu thử 60 Xác ñịnh tỷ lệ biến ñổi gene (GMO, Gene Modified Organism) có mẫu 66 Phát khác biệt SNP xác ñịnh kiểu di truyền 67 PCR dấu vân tay DNA 70 Lịch sử 70 Các loại xét nghiệm dấu vân tay DNA 70 Các tiểu vệ tinh (minisatellite) 71 Các vi vệ tinh (microsatellite) 73 Trình tự vòng D ty thể 79 Kết luận 80 PCR giải trình t 81 Giải trình tự gì? 81 Các phương pháp giải trình tự gene 81 Phương pháp hóa học giải trình tự DNA 81 Phương pháp enzyme giải trình tự DNA 83 Giải trình tự máy tự ñộng (automated sequencer) 85 PCR công cụ giúp hoàn thiện mở rộng phổ áp dụng kỹ thuật giải trình tự 88 Giải trình tự gene người 88 Làm giải trình tự gene người 88 Kết giải trình tự gene người 90 Giải trình tự gene người – ñua chưa kết thúc 92 Việt Nam tham gia vào ñua không? 94 Ứng dụng công nghệ giải trình tự phòng thí nghiệm NK-Biotek 95 Ứng dụng kỹ thuật PCR giải trình tự ñể ñịnh danh vi khuẩn 95 Ứng dụng kỹ thuật PCR giải trình tự ñể ñịnh danh vi nấm 104 Ứng dụng PCR-giải trình tự ñể phát hiện, ñịnh lượng xác ñịnh genotype HCV 106 Áp dụng PCR-giải trình tự ñể phát ñột biến kháng thuốc HBV 109 Áp dụng PCR-giải trình tự phát ñột biến precore/ promoter genotype HBV 111 PCR-giải trình tự phát ñột biến kháng rifampicine INH M tuberculosis 112 Nh ng vấn ñề kỹ thu t cần ñ c quan tâm áp dụng PCR real-time PCR phòng thí nghiệm ch n ñoán 115 Sự khác biệt phòng thí nghiệm chẩn ñoán phòng thí nghiệm nghiên cứu 115 Các vấn ñề kỹ thuật cần quan tâm áp dụng PCR real-time PCR chẩn ñoán 116 Tiến trình xét nghiệm PCR real-time PCR 116 Xây dựng phòng thí nghiệm PCR/real-time PCR chẩn ñoán 140 Phòng tách chiết nucleic acid 140 Phòng ñặt máy PCR real-time PCR 141 Phòng ñiện di ñọc kết 141 Phòng pha chế thuốc thử PCR real-time PCR 142 Kinh nghiệm xây dựng phát triển PCR/real-time PCR số kỹ thu t sinh học phân tử khác nghiên cứu ch n oán 146 Từ yêu cầu thực tế phải tiếp cận y học ñại chẩn ñoán ñiều trị 146 Cần giải pháp toàn diện chẩn ñoán sinh học phân tử bệnh viêm gan virus B viêm gan virus C mạn tính 146 Cần xét nghiệm kịp thời nhạy cảm ñể chẩn ñoán phát tác nhân vi sinh gây bệnh mà phương tiên vi sinh hay miễn dịch không hữu hiệu 150 Đến thực tế triển khai kỹ thuật PCR, real-time PCR 154 Các rào cản 154 Thử nghiệm PCR real-time PCR có thật khó thực ñược cách chuẩn mực phòng thí nghiệm lâm sàng? 155 Thử nghiệm PCR real-time PCR có thật ñắt tiền không? 157 Thực tế triển khai PCR real-time PCR 158 Và thực tế triển khai kỹ thuật kỹ thuật sinh học phân tử khác 165 Kết luận 166 ng dụng sinh học phân tử ch n óan viêm gan siêu vi - Các câu h i th ng g p 167 Viêm gan siêu vi B 167 Viêm gan siêu vi C 173 Các ph ng pháp chu n b m u cho PCR real-time PCR 178 Các phương pháp chuẩn bị mẫu trước tách chiết 178 Thuần lọai trừ tạp nhiễm cho mẫu ñàm 178 Phương pháp lọai bỏ sáp paraffin cho mẫu cắt sinh thiết 179 Phương pháp thủy giải mẫu proteinase K 180 Các phương pháp tách chiết nucleic acid 181 Phương pháp BOOM ñể tách chiết DNA 181 Phương pháp tách chiết DNA dùng CTAB 182 Phương pháp tách chiết DNA dùng phenol chloroform 184 Phương pháp tách chiết DNA gene bạch cầu 186 Phương pháp tách chiết thô DNA mẫu thử tôm cá 187 Phương pháp tách chiết RNA tòan phần 189 Phương pháp phiên mã ngược RNA ñể tổng hợp cDNA 191 ài liệu có liên quan Sách tham khảo 192 Tạp chí ñăng kết nghiên cứu có liên quan 192 ác giả 197