NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP TÁCH, CHIẾT VÀ ĐỊNH LƢỢNG CÁC CHẤT CHỐNG OXY HÓA

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - VŨ THỊ TRANG NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP TÁCH, CHIẾT VÀ ĐỊNH LƢỢNG CÁC CHẤT CHỐNG OXY HÓA TRONG MỘT SỐ LOẠI RAU, CỦ, QUẢ Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 9440112.03 DỰ THẢO TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội - 2019 Cơng trình đƣợc hồn thành Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia – Bộ Y tế Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo PGS.TS Nguyễn Xuân Trung Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ Họp vào hồi .giờ, ngày .tháng .năm 2019 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm thông tin - thư viện Đại học Quốc gia Hà Nội MỞ ĐẦU Tính cấp thiết, mục tiêu nội dung luận án “Stress oxy hóa” tượng xuất thể sinh vật có cân việc sản xuất gốc tự hoạt động chất chống oxy hóa Hiện tượng nguyên nhân nhiều bệnh nguy hiểm, có ung thư, bệnh tim mạch, bệnh suy giảm hệ thần kinh (Alzheimer, Parkinson) lão hóa sớm Các nhà khoa học tồn xã hội quan tâm đến tác hại gốc tự do, xu hướng tìm kiếm chất chống oxy hố góp phần q trình giảm stress oxy hóa tập trung nghiên cứu Các hợp chất polyphenol có mặt khắp nơi tự nhiên thường tìm thấy cấu trúc phức tạp Anthocyanin số nhiều hợp chất thuộc nhóm polyphenol flavonoid bật với vai trị tạo màu sắc đỏ tươi, xanh lam tím thực vật Một vai trò quan trọng phát gần hợp chất anthocyanin khả chống oxy hóa chúng Các thử nghiệm invivo, invitro cho thấy tác dụng tích cực anthocyanin việc phòng chống ung thư, bệnh tim mạch béo phì Mức tiêu thụ hàng ngày anthocyanin Mỹ trung bình 12,5mg/người/ngày, Châu Âu 20 mg/người/ngày cao số nước Phần Lan 82 mg/người/ngày Hàm lượng anthocyanin sử dụng số đánh giá chất lượng số sản phẩm Các lý thúc đẩy phát triển kỹ thuật phân tích để nhận biết định lượng anthocyanin sản phẩm tự nhiên, nghiên cứu tác dụng chúng thể Anthocyanin tìm thấy tự nhiên dạng aglycon (anthocyanidin) liên kết với gốc đường (glycosid) Các nhà khoa học dự đốn có khoảng 1000 loại anthocyanin có khoảng 600 anthocyanin phát nhận danh cấu trúc Mặc dù số lượng anthocyanin lớn chúng tạo thành 23 loại anthocyanidin tự nhiên, sáu loại anthocyanidin phổ biến bao gồm: cyanidin, delphinidin, pelargonidin, peonidin, petunidin malvidin Các aglycon glycosid có hoạt tính sinh học khác nhau, đó, biết thành phần anthocyanin thực vật cung cấp thông tin độ bền, hoạt tính sinh học lợi ích chúng người Mỗi loài thực vật ẩn chứa thông tin cấu trúc độc đáo anthocyanin chúng tiếp tục nghiên cứu, khám phá Sự đa dạng phức tạp cấu trúc anthocyanin thách thức lớn việc nhận biết định lượng chúng Để có thơng tin xác, cần thiết phải có kết hợp kỹ thuật phân tích khác Sắc ký lỏng hiệu cao với detector chuỗi diod (DAD) công cụ sử dụng phổ biến để xác định anthocyanin anthocyanidin Bên cạnh đó, nhận biết anthocyanin để khẳng định loại anthocyanin, kỹ thuật cao như: detector khối phổ (MS) sử dụng với chế độ ion hóa phun điện tử (ESI), chế độ bẫy ion (IT) hay sử dụng khả phân giải cao khối phổ thời gian bay (TOF) Tại Việt nam nay, quy trình phân tích cơng bố áp dụng chủ yếu sử dụng phương pháp pH vi phân kết hợp với quang phổ UV-Vis xác định lượng tổng anthocyanin quy theo cyanidin-3-glucoside Do hạn chế nguồn chất chuẩn để đơn giản hóa q trình định lượng, anthocyanin thường thủy phân, cắt mạch để chuyển dạng anthocyanidin Tuy nhiên, điều kiện thủy phân công bố khác có số tác giả thủy phân khơng hồn tồn dẫn đến tồn dạng anthocyanin anthocyanidin dung dịch mẫu Điều gây sai số lớn cho việc định lượng chất phân tích Để có sở liệu đầy đủ thành phần hàm lượng anthocyanin hay anthocyanidin thực vật, cần thiết phải nghiên cứu xây dựng phương pháp chiết, tách xác định chất chống oxy hóa nhóm anthocyanin, làm sở để lựa chọn nguồn nguyên liệu có hàm lượng hoạt tính sinh học cao Xuất phát từ vấn đề nêu tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu phƣơng pháp tách, chiết định lƣợng chất chống oxy hóa số loại rau, củ, quả” với ba mục tiêu: Nghiên cứu phát triển phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao với detector DAD (HPLC-DAD) để xác định đồng thời anthocyanin anthocyanidin Nghiên cứu xây dựng quy trình xử lý mẫu để tách, chiết anthocyanin anthocyanidin Áp dụng phương pháp để nhận biết định lượng anthocyanin anthocyanidin số loại rau, củ, Việt nam Với mục tiêu trên, nội dung luận án bao gồm: - Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện HPLC-DAD xác định đồng thời anthocyanin anthocyanidin kết hợp sử dụng UPLC-MS/MS để nhận biết chúng - Nghiên cứu sử dụng phương pháp quy hoạch hóa thực nghiệm bậc để tìm điều kiện tối ưu cho trình tách sắc ký xử lý mẫu - Thẩm định phương pháp xác định đồng thời anthocyanidin HPLC-DAD - Áp dụng phương pháp nhận biết, định lượng bước đầu thử hoạt tính chống oxy hóa anthocyanin anthocyanidin số mẫu rau, củ, Những đóng góp mặt khoa học thực tiễn luận án  Về mặt khoa học - Đề tài sử dụng phương pháp quy hoạch hóa thực nghiệm bậc hai để tìm điều kiện tối ưu cho trình tách sắc ký lỏng xác định đồng thời sáu anthocyanin anthocyanidin Kết tách anthocyanin anthocyanidin tối ưu so với cơng trình cơng bố sử dụng phương pháp đơn biến Việc xác định đồng thời anthocyanin anthocyanidin cho phép nhận biết định lượng hai dạng lần phân tích, giúp đánh giá hiệu suất trình thủy phân, đảm bảo kết định lượng xác chất phân tích - Quá trình tách, chiết anthocyanidin mẫu rau, củ, tối ưu hóa sử dụng phương pháp quy hoạch hóa thực nghiệm bậc hai Kết nghiên cứu giải khác điều kiện thủy phân cơng trình cơng bố sử dụng phương pháp đơn biến  Về mặt thực tiễn - Các thông số tối ưu HPLC-DAD tách xác định đồng thời anthocyanin anthocyanidin ứng dụng phịng thí nghiệm để đánh giá hiệu suất trình chiết thủy phân cho mẫu cụ thể, đặc biệt nguồn chất chuẩn anthocyanin khơng sẵn có - Kết phân tích 31 mẫu rau, củ, nhận biết định lượng thành phần anthocyanidin, đồng thời sơ thử nghiệm hoạt tính số mẫu thực phẩm sở để lựa chọn nguồn nguyên liệu có hàm lượng hoạt tính sinh học cao Bố cục luận án Luận án gồm năm phần là: mở đầu, chương 1: tổng quan, chương 2: nội dung phương pháp nghiên cứu, chương 3: kết thảo luận, kết luận Trong phần có hình ảnh bảng biểu minh họa tương ứng, phù hợp Ngoài luận án gồm đầy đủ phần: mục lục, danh mục ký hiệu chữ viết tắt, danh mục bảng, danh mục hình, danh mục cơng trình khoa học tác giả liên quan đến luận án, tài liệu tham khảo tiếng Việt, tiếng Anh phụ lục liên quan Chƣơng TỔNG QUAN Tổng quan anthocyanin anthocyanidin Anthocyanin glycosid gốc đường glucose, galactose, rutinose kết hợp với gốc aglycon có màu Các anthocyanin tách hết nhóm đường gọi anthocyanidin hay aglycon Sự đa dạng cấu trúc tạo số lượng lớn anthocyanin mà đến ghi nhận khoảng 600 loại Đến nay, có 23 anthocyanidin tìm thấy, có anthocyanidin phổ biến là: cyanidin, delphinidin, pelargonidin, peonidin, malvidin petunidin Trong thực vật, anthocyanin có tính kháng khuẩn, kháng nấm giúp thực vật tránh số bệnh nấm cây, có màu sắc sặc sỡ thu hút động vật, chim trùng nên thúc đẩy q trình thụ phấn phát tán phấn hoa Trong lĩnh vực thực phẩm, với khả chống oxy hóa cao, anthocyanin sử dụng để bảo quản thực phẩm, kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa cho thực phẩm Ngồi vai trị sinh lý thực vật, vai trò phụ gia sản xuất thực phẩm, hợp chất anthocyanin chứng minh mang lại nhiều lợi ích sức khỏe người với hoạt tính sinh học q: chống oxy hóa, tác dụng tích cực phòng điều trị bệnh tim mạch, ung thư Với tác dụng quan trọng trên, anthocyanin ngày quan tâm, nghiên cứu, khai thác ứng dụng nhiều lĩnh vực đời sống Các phƣơng pháp xác định anthocyanin anthocyanidin Một số phương pháp quang phổ, cộng hưởng từ hạt nhân, sắc ký khí, sắc ký lỏng, điện di mao quản khối phổ công bố để nhận biết định lượng anthocyanin Phương pháp sắc kí lỏng sử dụng phổ biến để xác định anthocyanin, anthocyanidin với detector chuỗi diod (DAD) khối phổ MS Hệ thiết bị sắc ký lỏng ghép nối tiếp detector DAD detector MS (LC-DAD-MS) khai thác rộng rãi để phân tích anthocyanin Phương pháp đặc biệt hiệu số lượng chất chuẩn anthocyanin khơng sẵn có, việc nhận biết chất dựa thứ tự rửa giải, phổ UV-Vis thông tin phổ khối Detector quang diod sử dụng rộng rãi phân tích thường quy, đặc biệt ứng dụng phịng thí nghiệm kiểm soát chất lượng thực phẩm để xác định anthocyanin mẫu khác nhau, hầu hết sử dụng bước sóng hấp thụ cực đại anthocyanin khoảng 520nm Sự tồn số lượng lớn anthocyanin tự nhiên với cấu trúc vô phong phú phức tạp khiến việc tách định lượng chúng khó khăn thiếu chất chuẩn trùng thời gian lưu Để đơn giản trình phân tích, cần tiến hành thủy phân để cắt tồn gốc đường chuyển thành anthocyanidin Quá trình thủy phân anthocyanin bị ảnh hưởng yếu tố: nhiệt độ, nồng độ acid thời gian Điều kiện chiết thủy phân ảnh hưởng lớn đến dạng tồn anthocyanin anthocyanidin Quá trình chiết thực mơi trường acid, môi trường acid mạnh thủy phân anthocyanin thành anthocyanidin, q trình thủy phân khơng hồn tồn khơng thủy phân hết anthocyanin thành anthocyanidin Do đó, mẫu sau thủy phân, tồn dạng anthocyanin anthocyanidin Để giải vấn đề này, cần thiết phải tìm điều kiện tối ưu để chiết thủy phân anthocyanin thành anthocyanidin với việc khảo sát ảnh hưởng đồng thời yếu tố tác động tương hỗ chúng, đồng thời để đánh giá hiệu suất chuyển hóa anthocyanin thành anthocyandin sử dụng chất chuẩn anthocyanin bổ sung vào mẫu để chất chuẩn thủy phân dạng tồn chất phân tích mẫu Việc đánh giá hoạt tính chống oxy hóa anthocyanin mẫu chứa anthocyanin thực theo nhiều phương pháp khác nhau, đó, phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử sử dụng phản ứng khử gốc tự DPPH sử dụng phổ biến phương pháp nhanh, đơn giản có độ xác cao CHƢƠNG NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu Đối tượng mẫu phân tích loại rau, củ, mua địa bàn Hà Nội, Đà Lạt, Bắc Giang, Quảng Ninh (bắp cải tím, đỗ đen, đậu bắp tím, ngơ tím, bụp giấm, khoai lang tím, hành tây tím, rau chua, nho tím, nho đen, mai, táo đỏ, mận, long, dâu tây, củ dền…) Đối tượng chất phân tích anthocyanidin phổ biến nhất, bao gồm: cyanidin, delphinidin, pelargonidin, petunidin, peonidin, malvidin dạng mono-3-glucoside chúng, bao gồm: cyanidin-3-O-glucoside, delphinidin3-O-glucoside, pelargonidin-3-O-glucoside, petunidin-3-O-glucoside, peonidin-3-O-glucoside, malvidin-3-O-glucoside Phƣơng pháp nghiên cứu Trong nghiên cứu này, sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm theo mơ hình bậc hai tâm xoay để tìm điều kiện tối ưu cho trình tách sắc ký xử lý mẫu; phương pháp HPLC-DAD UPLC-MS/MS để nhận biết định lượng chất phân tích; phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis dựa phản ứng khử gốc tự DPPH để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa chất phân tích mẫu nghiên cứu Phương pháp mặt mục tiêu theo mơ hình bậc hai tâm xoay tìm điều kiện HPLC tối ưu xác định đồng thời sáu anthocyanin sáu anthocyanidin Cần tìm điều kiện HPLC mà pic tách khỏi hồn tồn, có nghĩa độ phân giải chúng phải đủ lớn (thường ≥ 2) Để tìm điều kiện tối ưu này, mơ hình bậc hai tâm xoay sử dụng với yếu tố độc lập bao gồm: nồng độ acid formic pha động (X1), tỉ lệ ban đầu ACN chương trình gradient (X2) tốc độ dịng (X3) Các hàm mục tiêu lựa chọn độ phân giải cặp pic khó tách nhất, bao gồm: độ phân giải pelar-3G với Del (Y1), độ phân giải Del với Peo-3G (Y2), độ phân giải Peo-3G với Mal-3G (Y3) độ phân giải Peo với Mal (Y4) Phương pháp LC-MS/MS xác định đồng thời anthocyanin anthocyanidin Khảo sát điều kiện MS: mảnh mẹ, mảnh con, lượng bắn Khảo sát điều kiện LC: tốc độ dịng, chương trình gradient, nồng độ acid Phương pháp mặt mục tiêu theo mơ hình bậc hai tâm xoay tìm điều kiện tối ưu chiết, tách anthocyanin thủy phân thành anthocyanidin Tối ưu hóa điều kiện chiết anthocyanin từ mẫu rau, củ, Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả chiết dung môi chiết, thời gian chiết, khối lượng mẫu chiết, nhiệt độ chiết Khảo sát điều kiện thủy phân anthocyanin thành anthocyanidin Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả thủy phân nồng độ HCl, nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân Tối ưu quy trình chiết thủy phân anthocyanidin trực tiếp từ mẫu phương pháp mặt mục tiêu sử dụng mơ hình bậc hai tâm xoay Các điều kiện tối ưu công bố khác có ba yếu tố ảnh hưởng nhiệt độ, thời gian nồng độ acid HCl dung môi MeOH Khảo sát ảnh hưởng đồng thời yếu tố: nhiệt độ, thời gian nồng độ acid HCl dung môi MeOH đến hàm mục tiêu hàm lượng tổng anthocyanidin (Y1) Sử dụng phương pháp qui hoạch thực nghiệm theo mơ hình bậc tâm xoay Phương pháp đánh giá hiệu suất thủy phân Thêm trực tiếp hỗn hợp chất chuẩn 3-glucoside anthocyanidin (bao gồm cyanidin - - O - glucoside, pelargondin - - O – glucoside, malvidin - - O – glucoside, petunidin – 3- O- glucoside, Peonidin – 3- O – glucoside, delphinidin – - O - glucoside) vào dịch chiết anthocyanin tiến hành thủy phân theo điều kiện tối ưu Phương pháp xử lý số liệu mơ hình thực nghiệm Thiết kế thí nghiệm phân tích liệu thực sử dụng phần mềm Design-Expert phiên 10.0.7 (Stat-Ease Inc., Minneapolis, MN, USA) Đánh giá tính có nghĩa yếu tố theo phân tích phương sai (ANOVA) Đánh giá phương pháp phân tích Thẩm định phương pháp với thống số: đường chuẩn, LOD, LOQ, độ lặp lại, độ thu hồi Thiết bị hóa chất Hệ thống thiết bị sắc kí lỏng hiệu cao HPLC (LC 20AD) hãng Shimadzu trang bị detector chuỗi diod DAD Hệ thống sắc kí lỏng siêu hiệu detector khối phổ (UPLC-MS/MS) bao gồm: hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu UPLC hệ thống khối phổ Xevo TQD hãng Waters Các chất chuẩn từ Sigma Chromadex CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Nghiên cứu tối ƣu hóa điều kiện HPLC xác định đồng thời anthocyanin anthocyanidin Khảo sát sơ số điều kiện HPLC xác định đồng thời anthocyanin anthocyanidin Khả tách, xác định anthocyanin anthocyanidin HPLC phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: bước sóng phát hiện, loại cột tách, thành phần pha động, chương trình gradient, tốc độ dịng… Khảo sát bước sóng phát Các anthocyanin anthocyanidin hợp chất mang màu, hấp thụ ánh sáng vùng UV-Vis Do đó, lựa chọn detector DAD để phát định lượng chất Để lựa chọn bước sóng thích hợp, tiến hành qt phổ chất chuẩn anthocyanidin anthocyanin dải phổ từ 190 – 800 nm Bước sóng cực đại hấp thụ chung lựa chọn 520nm Khảo sát thành phần pha động Hệ dung môi khảo sát có thành phần kênh B ACN, kênh A acid TFA 0,1% Với hệ dung môi này, nhiều chương trình gradient khảo sát để tách anthocyanin anthocyanidin Tuy nhiên, TFA với lực ion lớn tỏ hiệu việc tách anthocyanidin chúng rửa giải chậm khó khăn để tách anthocyanin chúng rửa giải sớm Các anthocyanin rửa giải trước 15 phút với pic Peo – 3G, Mal – 3G Del tách hoàn toàn Các anthocyanindin rửa giải khoảng 15 – 40 phút với Del rửa giải 15 phút chất lại rửa giải sau 25 phút Hệ dung môi khảo sát thứ hai có thành phần kênh B ACN, kênh A acid FA 0,1% cho thấy: pic anthocyanin không nhọn, khả tách cao, tất anthocyanin tách hoàn toàn Do số lượng chất phân tích lớn, thuộc hai nhóm chất có độ phân cực khác nên việc tách chúng HPLC sử dụng phương pháp đơn biến dẫn đến số lượng thực nghiệm lớn khơng tìm điều kiện tối ưu Để giải vấn đề này, mơ hình mặt mục tiêu lựa chọn để tìm điều kiện tối ưu tách anthocyanin anthocyanidin Tối ưu hóa điều kiện HPLC xác định đồng thời anthocyanin anthocyanidin theo phương pháp mặt mục tiêu RSM Bảng 3.1: Mức sở khoảng biến thiên yếu tố theo mơ hình bậc hai tâm xoay tối ưu điều kiện tách HPLC Khoảng Các mức Yếu tố Mã hóa biến -1 +1 thiên Nồng độ FA (% X1 10 15 v/v) Tỉ lệ ACN X2 6,5 12 5,5 10 (%) Tốc độ dòng X3 0,6 0,8 1,0 0,2 (mL/min) Bảng 3.3: Kết thực nghiệm theo mơ hình bậc hai tâm xoay Thứ tự STT thí nghiêm 19 15 4 10 20 10 11 11 12 14 13 12 14 13 15 16 16 17 18 18 19 17 20 Các biến Các hàm X1 X2 X3 Y1 Y2 Y3 Y4 10 5,0 10 15 1,6 5,0 15 18,4 5,0 10 15 10 10 10 10 5,0 10 10 15 10 6,5 12 6,5 12 6,5 1,0 12 6,5 12 6,5 1,0 0,0 6,5 15,7 6,5 1,0 6,5 6,5 1,0 6,5 0,8 0,6 0,8 0,6 0,8 0,6 1,0 0,8 1,0 0,8 1,0 0,8 1,1 0,8 0,5 1,0 0,8 0,8 0,6 0,8 2,641 5,044 2,637 1,838 1,589 1,229 2,271 0,685 4,479 2,641 1,527 1,250 2,663 4,560 2,669 0,000 2,630 2,639 1,436 2,625 3,483 0,468 3,609 1,566 0,729 0,000 2,272 3,040 0,611 3,483 3,010 0,832 3,500 0,000 1,271 1,673 3,438 3,430 0,877 3,462 2,344 4,525 2,381 3,206 3,227 0,548 2,988 3,345 3,522 2,344 2,593 0,717 2,143 3,878 1,817 0,997 2,325 2,326 1,382 2,338 2,696 2,394 2,717 3,415 1,601 0,140 3,122 3,549 2,579 2,696 3,438 2,495 2,405 3,639 0,943 1,932 2,717 2,695 2,427 2,713 Y1: Các yếu tố X3, X2X3, X22, X32 có giá trị P > 0,05 cho thấy độ phân giải Pelar-3G Del không bị ảnh hưởng bởi: yếu tố bậc nhất, bậc hai tốc độ dòng (X3, X32); tương tác tốc độ dòng tỉ lệ ACN (X2X3) yếu tố bậc hai tỉ lệ ACN (X22) Y2: Yếu tố X1X2 có giá trị P > 0,05 cho thấy độ phân giải Del Peo3G không bị ảnh hưởng tương tác tương hỗ nồng độ FA tỉ lệ ACN bị ảnh hưởng tất yếu tố lại Y3: Các yếu tố X1, X22 có giá trị P > 0,05 cho thấy độ phân giải Peo3G Mal-3G không bị ảnh hưởng bởi: yếu tố bậc nồng độ FA (X 1); yếu tố bậc hai tỉ lệ ACN (X22) Y4: Yếu tố X12 có giá trị P > 0,05 cho thấy độ phân giải Peo Mal không bị ảnh hưởng yếu tố bậc hai tốc độ dòng bị ảnh hưởng tất yếu tố cịn lại 11 Phương trình hồi quy mơ tả ảnh hưởng yếu tố tác động tương hỗ chúng đến hàm mục tiêu phù hợp phương trình thể bảng 3.12 Bảng 3.12: Phương trình hồi quy độ xác mơ hình Hàm a Phương trình hồi quy C.V (%)b R2 hiệu chỉnh R2 dự đoán Độ xác phù hợp (Adeq precision) Y1c Y1 = 2.72 – 0.38X1 + 1.10X2 - 0.094X3 0.89X1X2 + 0.29X1X3 - 0.54X12 9,22 0,9707 0,9286 37,040 Y2 Y2 = 3.49 + 0.65X1 – 0.15X2 + 0.62X3 + 0.13X1X3 - 0.37X2X3 - 0.59X12 -1.11X22 0.42X32 7,35 0,9878 0,9628 34,651 Y3c Y3 = 2.32 + 0.057X1 + 1.03X2 + 0.072X3 – 0.54 X1X2+ 0.19X1X3 - 0.36X2X3 + 0.32X12 -0.14X32 4,12 0,9904 0,9705 57,652 Y4 Y4 = 2.67 + 0.63X1 + 0.40X2 + 0.38X3 – 0.28 X1X2 - 0.16X1X3 - 0.36X2X3 + 0.13X22 -0.36X32 4,44 0,9830 0,9433 46,720 Trong nghiên cứu này, việc kiểm tra tính đầy đủ mơ hình thực cách sử dụng cơng cụ thống kê độ xác phù hợp (Adequate Precision) Độ xác phù hợp đo tỉ lệ tín hiệu/nhiễu (signal to noise ratios) Các giá trị độ xác phù hợp phương trình 37,040, 34,651, 57,652 46,720 (đều > 4) cho thấy tín hiệu đầy đủ mơ hình phù hợp Bên cạnh đó, tương thích mơ hình cịn đánh giá thơng qua hệ số R2 Các giá trị R2 dự đoán R2 hiệu chỉnh > 0,92 (đảm bảo yêu cầu giới hạn  0,80) cho thấy liệu phù hợp với phương trình bậc hai Các giá trị hệ số biến thiên khoảng 4,12 – 9,22% (đảm bảo u cầu 0,3g hàm lượng giảm dần lượng dung mơi khơng đủ để chiết tồn lượng anthocyanin mẫu Vì vậy, chọn tỉ lệ dung mơi : khối lượng 100 : (v/w) tỉ lệ chiết tối ưu Khảo sát nhiệt độ chiết Hàm lượng anthocyanin chiết tăng dần từ 60oC đến 100oC giảm 120oC Như vậy, hiệu suất chiết anthocyanin tăng dần theo nhiệt độ đến 100oC, vượt qua 100oC bị phân hủy phần Tại 100oC, hàm lượng anthocyanin chiết cao nên nhiệt độ tối ưu Nhƣ vậy, điều kiện tối ƣu để chiết anthocyanin là: - Dung môi chiết: MeOH - Thời gian chiết: 30 phút - Nhiệt độ chiết: 100oC - Tỉ lệ dung môi : mẫu = 100 : (v/w) Khảo sát điều kiện tối ưu để thủy phân anthocyanin thành anthocyanidin 15 Khảo sát nồng độ HCl Tổng hàm lượng anthocyanidin tăng dần từ nồng độ HCl 0,9 M đến 2,4 M giảm xuống M Vì vậy, nồng độ 2,4 M tối ưu để thủy phân anthocyanin thành anthocyanidin Khảo sát nhiệt độ Hàm lượng anthocyanidin tăng thủy phân 60oC đến 90 oC giảm 100oC Như vậy, nhiệt độ thấp, hiệu suất thủy phân tăng dần theo nhiệt độ đến 90oC giảm dần bị phân hủy phần Vì vậy, 90 oC nhiệt độ tối ưu để thủy phân anthocyanin thành anthocyanidin Khảo sát thời gian thủy phân Hàm lượng anthocyanidin tăng dần từ 15 phút đến 60 phút giảm dần phân hủy phần Vì vậy, 60 phút thời gian tối ưu để thủy phân anthocyanin thành anthocyanidin Nhƣ vậy, điều kiện tối ƣu để thủy phân anthocyanin thành anthocyanidin là: - Nồng độ HCl MeOH: 2,4M - Thời gian thủy phân: 60 phút - Nhiệt độ thủy phân: 90 oC Tối ưu hóa điều kiện xử lý mẫu xác định anthocyanidin theo phương pháp mặt mục tiêu RSM Khảo sát ảnh hưởng khối lượng mẫu Khi cân lượng mẫu khoảng 0,1g chất có hàm lượng thấp Pelargonidin, Peonidin Malvin khơng phát nên tổng hàm lượng chất bị giảm Khối lượng mẫu cân khoảng 0,5g 1g cho hàm lượng tổng anthocyanidin cao tương đương, tất chất phân tích có mẫu định lượng Khi tăng khối lượng cân khoảng 2g lượng dung mơi chiết khơng đủ để chiết hồn tồn chất có hàm lượng cao Cyanidin Delphinidin Mặc dù, Peonidin Malvidin định lượng tổng hàm lượng anthocyanidin bị giảm dần Do đó, để tăng tính đồng đại diện cho anthocyanidin khối lượng mẫu cân khoảng 1g sử dụng để khảo sát mơ hình hóa thực nghiệm Khảo sát ảnh hưởng đồng thời yếu tố đến trình chiết anthocyanidin theo phương pháp RSM Bảng 3.21: Mức sở khoảng biến thiên yếu tố theo mơ hình bậc hai tâm xoay tối ưu hóa q trình chiết anthocyanidin Yếu tố Mã hóa Mức dƣới (- 1) Mức gốc (0) Mức (+ 1) Khoảng biến thiên () Thời gian (phút) x1 60 90 120 30 Các mức 16 Nhiệt độ x2 50 75 100 25 (0C) Nồng độ x3 HCl (M) Bảng 3.22: Tổng hàm lượng anthocyanidin theo mơ hình bậc hai tâm xoay HL Thứ tự Thời Nhiệt Nồng Antho STT thực gian độ độ HCl mg/100g nghiệm (phút) (0C) (M) Y 13 90 75 0.32 47,01 19 90 75 83,79 120 100 72,54 120 100 80,05 120 50 31,87 6 120 50 39,89 11 90 32,9552 18,12 16 90 75 89,04 20 90 75 81,83 10 10 140,454 75 79,53 11 60 100 70,87 12 60 100 69,16 13 39,5462 75 67 12 14 90 117,045 72,42 18 15 90 75 92,03 14 16 90 75 3.68179 65,69 17 17 90 75 83,72 18 60 50 26,02 19 60 50 35,04 15 20 90 75 81,83 Khi so sánh yếu tố độc lập với nhau, nhận thấy nhiệt độ nồng độ acid methanol ảnh hưởng nhiều thời gian thủy phân Quá trình thủy phân anthocyanin thành anthocyanidin trình cắt mạch liên kết aglycon (anthocyanidin) với gốc đường Do đó, cần phải có tác nhân H +, nồng độ acid HCl có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất thủy phân Ngược lại, ảnh hưởng tương hỗ thời gian nhiệt độ (X1.X2), thời gian nồng độ acid (X1.X3), nhiệt độ nồng độ acid (X2.X3) không đáng kể (trị số P > 0,05), nên bỏ qua q trình tính tốn Bằng phương pháp qui hoạch hóa thực nghiệm mơ hình bậc hai tâm xoay tìm phương trình mơ tả mối quan hệ hàm lượng anthocyanidin phụ thuộc vào yếu tố sau: Y = – 210,7 + 1,111.X1 +4,314.X2 + 47,95.X3 – 0,00557X12 – 0,02386.X22 – 10,99.X32 (2) 17 Bảng 3.25: Sự phù hợp phương trình hồi quy Độ xác phù R2 hiệu C.V (%) R dự đoán hợp (Adeq chỉnh precision) 6,67 0,9645 0,9258 28,797 Giá trị độ xác phù hợp phương trình 28,797 (> 4) cho thấy tín hiệu đầy đủ mơ hình phù hợp Bên cạnh đó, tương thích mơ hình cịn đánh giá thơng qua hệ số R2 Các giá trị R2 dự đoán R2 hiệu chỉnh > 0,92 (đảm bảo yêu cầu giới hạn  0,80) cho thấy liệu phù hợp với phương trình bậc hai Giá trị hệ số biến thiên 6,67% (đảm bảo yêu cầu cyandin, cyanidin-3-glucoside > pelargonidin-3,5-diglucoside Cyanidin, cyanidin-3-glucoside delphinidin có hoạt tính cao chút so với chất đối chứng dương vitamin C 21 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN [1] Lê Việt Ngân, Vũ Thị Trang, Lê Thị Hồng Hảo, Nguyễn Xuân Trung, Lê Đình Chi (2016), Xây dựng quy trình định lượng đồng thời anthocyanidin số loại rau, củ, kỹ thuật HPLC, Tạp chí Dược học, số 484, trang 26-30 [2] Vũ Thị Trang, Lê Thị Hồng Hảo, Nguyễn Xuân Trung, Tăng Thị Phương (2016), Xác định đồng thời anthocyanidin số loại rau, củ, phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS, Tạp chí Khoa học Đại học quốc gia hà nội, tập 32, số 4, trang 305-309 [3] Vũ Thị Trang, Chu Thị Thanh, Lê Thị Hồng Hảo, Nguyễn Xuân Trung (2018), Tối ưu hóa điều kiện thủy phân anthocyanin đỗ đen Việt nam sử dụng phương pháp mặt mục tiêu, Tạp chí phân tích Hóa lý sinh học, T23, số 2, trang 42-48 [4] Vũ Thị Trang, Lê Thị Hồng Hảo, Nguyễn Đức Hảo, Nguyễn Hoài Thu, Lê Hoàng Đức, Nguyễn Xuân Trung (2018), Xác định tính chống oxy hóa số anthocyanin anthocyanidin phương pháp đo quang sử dụng phản ứng với 2,2’-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), Tạp chí phân tích hóa, lý sinh học, tập 23, số 5, trang 33-38 [5] Chu Thị Thanh, Nguyễn Thị Hồng Hạnh, Nguyễn Thị Hoàng Lan, Vũ Thị Trang, Lê Thị Thúy (2018), Nghiên cứu trình chiết rung siêu âm chất màu thực phẩm anthocyanin từ đỗ đen, Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nông thôn, tháng 12/2018, trang 83-88 [6] Vu Thi Trang, Le Hoang Duc, Nguyen Thi Hoai Thu, Le Thi Hong Hao, Nguyen Xuan Trung, Multiseparation of anthocyanins and anthocyanidins by high performance liquid chromatography combined with response surface methodology, Health risk analysis, xác nhận đăng số 03/19 ngày 17/7/2019 22 ... hóa KẾT LUẬN Trên sở kết thực nghiệm nghiên cứu phương pháp tách, chiết xác định chất chống oxy hóa số loại rau, củ, phương pháp sắc ký, thu kết sau: 1) Tối ƣu hóa đƣợc điều kiện sắc ký lỏng hiệu... Parkinson) lão hóa sớm Các nhà khoa học tồn xã hội quan tâm đến tác hại gốc tự do, xu hướng tìm kiếm chất chống oxy hố góp phần q trình giảm stress oxy hóa tập trung nghiên cứu Các hợp chất polyphenol... oxy hóa nhóm anthocyanin, làm sở để lựa chọn nguồn nguyên liệu có hàm lượng hoạt tính sinh học cao Xuất phát từ vấn đề nêu tiến hành thực đề tài: ? ?Nghiên cứu phƣơng pháp tách, chiết định lƣợng chất