Trong khi các dẫn chất benzimidazol-2-thion thể hiện nhiều tác dụng sinh học tốt thì các dẫn chất có gắn nhóm methoxy trên vị trí carbon số 5 của nó vẫn chưa được nghiên cứu nhiều. Do đó, chúng tôi chọn hướng nghiên cứu tổng hợp các dẫn chất 5-methoxy-benzimidazol-2-thion và sàng lọc những chất có hoạt tính tốt trong việc gây độc trên một số dòng tế bào ung thư nhưng không được gây độc trên dòng tế bào thường
Nghiên cứu Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số * 2020 TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT 5-METHOXYBENZIMIDAZOL-2-THION Trương Phương*, Lê Thị Thùy Trang*, Ngô Duy Túy Hà** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Trong dẫn chất benzimidazol-2-thion thể nhiều tác dụng sinh học tốt dẫn chất có gắn nhóm methoxy vị trí carbon số chưa nghiên cứu nhiều Do đó, chúng tơi chọn hướng nghiên cứu tổng hợp dẫn chất 5-methoxy-benzimidazol-2-thion sàng lọc chất có hoạt tính tốt việc gây độc số dòng tế bào ung thư khơng gây độc dịng tế bào thường Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Tổng hợp 5-methoxybenzimidazol-2-thion phương pháp Thiocarbanilid từ nguyên liệu 4-methoxyorthophenylendiamin (chất khử hóa từ 4-methoxy-2nitroanilin) CS2, alkyl hóa 5-methoxybenzimidazol-2-thion môi trường hỗn hợp dung môi DCM: TEA (10:1) acyl hóa 5-methoxybenzimidazol-2-thion mơi trường pyridin Xác định cấu trúc phổ UV, IR, 1H-NMR, 13C-NMR MS Thử độc tính tế bào dịng tế bào ung thư HEPG2, RD MDA dòng tế bào thường LLCPK1 Kết quả: Tổng hợp xác định cấu trúc chín hợp chất (1-9) dẫn chất 5-methoxybenzimidazol-2-thion Hoạt tính gây độc tế bào không đồng dẫn chất Chỉ có 2/9 dẫn chât thử nghiệm (5) (6) ức chế dòng tế bào ung thư HEPG2, dịng tế bào RD bị ức chế 7/9 chất thử nghiệm (1), (2), (4), (5), (6) (7) Dòng tế bào MDA bị ức chế 5/9 chất thử nghiệm (1), (4), (5), (6) (7) Các chất thử nghiệm (4), (5) (7) ảnh hưởng dòng tế bào thường Kết luận: Sử dụng hỗn hợp dung mơi DCM: TEA (10:1) để alkyl hóa 5-methoxybenzimidazol-2-thion thu hỗn hợp đồng phân, sản phẩm tinh khiết tách sắc ký cột Các sản phẩm alkyl 1:1 S Phản ứng acyl hóa 5-methoxybenzimidazol-2-thion thu sản phẩm N Trong dòng tế bào ung thư HEPG2 bị ức chế 2/9 dẫn chât thử nghiệm, dòng tế bào MDA bị ức chế 5/9 chất thử nghiệm dịng tế bào RD bị ức chế 7/9 chất thử nghiệm có chất thử nghiệm gây ảnh hưởng dịng tế bào thường Từ khóa: 5-methoxybenzimidazol-2-thion, dẫn chất acyl, dẫn chất alkyl, gây độc tế bào, tác dụng gây độc tế bào ABSTRACT SYNTHESIS AND EVALUATION THE CYTOTOXIC EFFECTS OF 5-METHOXYBENZIMIDAZOLE-2-THIONE’S DERIVATIVES Truong Phuong, Le Thi Thuy Trang, Ngo Duy Tuy Ha * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol 24 - No - 2020: 32 - 40 Background: While the benzimidazole-2-thione derivatives were demonstrated about their lots of good biological effects, the other derivatives with a methoxy group that attached to fifth position have not been studied much Therefore, we chose to synthesis of 5-methoxy-benzimidazole-2-thione derivatives and screened these substances that have good activity in toxicity on some cancer cell lines but not on normal cell lines Materials and methods: 5-methoxybenzimidazole-2-thione was synthesized from 4-methoxy-2-nitroaniline and CS2 with thiocarbanilide method Thereafter, this substance was alkylated in the solvent mixture of DCM: TEA (10:1) or was acylated in pyridine solvent All of synthesized derivatives structures were determined by UV, Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Trường Cao đẳng Y Tế Lâm Đồng Tác giả liên lạc: PGS.TS Trương Phương ĐT: 0938525157 * ** 32 Email: nguyetphuong1234@gmail.com B - Khoa học Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số * 2020 Nghiên cứu IR, 1H-NMR, 13C-NMR and MS spectra The antitumor effects were tested on HEPG2, RD and MDA cancer cell strains and LLCPK1 normal cell strain Results: Nine new compounds (1-9) of 5-methoxybenzimidazole-2-thione were synthesized and determined their structures The result of this research showed that derivatives ((5) and (6)) have good affect on MDA, derivatives ((1), (2), (4), (5), (6) and (7)) inhibited the RD cancer cell strain, derivatives ((1), (4), (5), (6) and (7)) inhibited the MDA cancer cell strain Three derivatives ((4), (5) and (7)) endamaged on a normal tested cell strain Conclusion: The DCM: TEA (10: 1) solvent mixture was used in the 5-methoxybenzimidazole-2-thione alkylization in order to obtain a mixture of the two new isomers, the pure products were separated by the column chromatography The 5-methoxybenzimidazole-2-thione was alkylated at S position with ratio 1:1 The 5-methoxybenzimidazole-2-thione acylation reaction created the products which substituted in N positions While the HEPG2 cancer cell strain was inhibited by 2/9 tested compounds, the MDA cancer cell strain was inhibited by 5/9 tested substances, the RD cancer cell strain was inhibited by 7/9 test substances, there were three experimental substances that have influenced the tested normal cell strain Key words: 5-methoxybenzimidazole-2-thione, acyl derivatives, alkyl derivatives, cytotoxicity, cytotoxic effects fluorobenzyl clorid, anhydrid acetic, kali ĐẶT VẤNĐỀ hydroxyd tinh thể, than hoạt tính, dung dịch Hóa trị liệu phương pháp điều trị ung acid hydrocloric đậm đặc thư sử dụng nhiều thuốc kháng ung thư - gây độc tế bào Đây phần phác đồ trị liệu ung thư chuẩn Vì vậy, việc tìm lựa chọn loại thuốc hóa trị khơng có độc tính lên tế bào bình thường lại có tác dụng tốt tế bào ung thư có ý nghĩa Các dẫn xuất benzimidazol-2-thion nhóm dẫn xuất quan trọng dị vịng benzimidazol Đây nhóm hợp chất chứng minh có hoạt tính sinh học phong phú kháng khuẩn(1), kháng nấm(2), kháng histamin, giảm đau(2), kháng virus(3), đặc biệt tác dụng gây độc tế bào ung thư(4,5) Với mục tiêu nghiên cứu tổng hợp sàng lọc chất có hoạt tính gây độc tế bào tốt dựa kết đạt được, chọn hướng nghiên cứu tổng hợp dẫn chất 5-methoxy-benzimidazol-2-thion, hướng biến đổi triển vọng khung dẫn chất để tiếp tục sàng lọc thêm nhiều chất có tác dụng sinh học tốt ĐỐI TƯỢNG– PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU Bản mỏng tráng sẵn Kieselgel 60 F254 Merck Các hệ dung môi A cloroform : aceton (19:1) B toluen : ethyl acetat (2:1) C n-hexan : aceton (2:1) D n-hexan : ethyl acetat (1:1) E toluen : ethyl acetat (3:1) F n-hexan : ethyl acetat (2:1) Nguyên liệu thử độc tế bào Dòng tế bào HEPG2 (tế bào ung thư gan người), RD (tế bào ung thư vân người), MDA-MB-231 (tế bào ung thư vú người), LLC-PK1 (tế bào thận heo) hoạt hóa ni cấy viện Pasteur TP Hồ Chí Minh Hóa chất Mơi trường EMEM, mơi trường DMEM, Nguyên liệu huyết bào thai bê (FCS), trypsin-EDTA; 4-methoxy-2-nitroanilin, carbon disulfid, allyl bromid, benzyl clorid, 2-clorobenzyl clorid, 2-methylbenzyl clorid, 2-fluorobenzyl clorid, 4- L-glutamin, B - Khoa học Dược penicilin-streptomycin (Gibco, Mỹ); PBS, trypan blue, MTT (Sigma-Aldrich, Mỹ); isopropanol (Merck, Đức) 33 Nghiên cứu Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số * 2020 Nuôi cấy tế bào Tỷ lệ tế bào sống xác định nhờ hoạt tính enzym succinat dehydrogenase (SDH) có ty thể tế bào sống SDH chuyển MTT [3(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5diphenyl tetrazolium bromid)] thành formazan tan isopropanol acid hóa tạo dung dịch tím, đo OD 570 nm; giá trị OD phản ánh số lượng tế bào sống mẫu thử Tế bào HEPG2, LLC-PK1 nuôi môi trường EMEM; tế bào RD, MDA-MB-231 nuôi môi trường DMEM; bổ sung vào môi trường nuôi cấy 10% FCS, mM L-glutamin, 100 IU/ml penicilin, 100 µg/ml streptomycin, ủ 37 oC, 5% CO2 Khi đạt độ phủ 70 - 80%, thu đếm tế bào sống với trypan blue, cấy chuyển chia vào đĩa nuôi cấy Xử lý tế bào Dung dịch mẹ mẫu thử pha DMSO chiếu UV bảo quản -20 oC Tế bào chia vào đĩa nuôi cấy 96 giếng mật độ thích hợp Sau ủ tế bào 24 37 oC, 5% CO2, xử lý tế bào với mẫu thử nồng độ khác (12,5 – 100 µM), nồng độ cuối DMSO môi trường nuôi cấy 1% (tt/tt) Paclitaxel dùng làm chất đối chứng dương Đánh giá tỉ lệ tế bào sống phương pháp MTT Dụng cụ trang thiết bị Tổng hợp tinh chế sản phẩm: Máy khuấy từ gia nhiệt Stuart SB162, cá từ, bếp nung Alma, máy hút chân không, phễu Buchner, máy cô quay Stuart, cột sắc ký Kiểm nghiệm sản phẩm: Sắc ký mỏng GF254, bình triển khai sắc ký, buồng soi UV VilberLourmat, ống mao quản, máy đo điểm chảy Stuart SMP10; máy đo phổ hồng ngoại IR: FTIR 8201 PC (SHIMADZU); máy đo khối phổ MSQ Plus – Thermo; máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân AV500 Bruker (500 MHz) Phương pháp nghiên cứu Tổng hợp chất theo Hình sau: Hình Sơ đồ tổng hợp dẫn chất alkyl hóa acyl hóa 5-methoxybenzimidazol-2-thion 34 B - Khoa học Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số * 2020 KẾT QUẢ Tổng hợp 5-methoxybenzimidazol-2-thion (1) Giai đoạn Khử hóa 4-methoxy-2-nitroanilin Trong bình cầu cổ 250 ml, cho 20 g 4-methoxy-2-nitroanilin (117 mmol), 40 ml ethanol tuyệt đối, 12 ml KOH 30% (6 mmol) Đặt bình phản ứng lên bếp từ, thau nước đá gắn với sinh hàn hồi lưu Khuấy hỗn hợp bình tan hết Cho phần g bột kẽm vào bình cầu, khuấy đều, tổng lượng kẽm sử dụng 32 g (492 mmol) Sau giờ, lọc hỗn hợp dịch phản ứng qua phễu Buchner với ethanol tuyệt đối Dịch lọc thu thêm 0,72 g natri dithionit (4 mmol) Lưu ý: phản ứng khử xảy mãnh liệt cần giữ nhiệt độ phản ứng khoảng 15 °C Giai đoạn Đóng vịng benzimidazol Trong bình cầu, cho tồn dịch lọc thu giai đoạn khử hóa, 2,5 g KOH tinh thể (45 mmol), 12 ml carbondisulfid (199 mmol) khuấy Đun hồi lưu hỗn hợp Cô quay hỗn hợp phản ứng khoảng 40 ml Để nguội, thêm từ từ 100 ml nước cất, khuấy kỹ thấy tủa xuất Lọc lấy tủa phễu Buchner, rửa tủa với 100 ml nước cất thu sản phẩm thô Sản phẩm thô tinh chế phương pháp kết tinh lại hỗn hợp ethanol: nước (1:2), lọc sấy 45 – 50 °C Thu 8,28 g sản phẩm tinh khiết (46 mmol), hiệu suất đạt 39,3% Chất (1): 5-methoxybenzimidazol-2-thion C8H8N2OS P.t.l: 180,23 Bột kết tinh màu vàng, tan cloroform, ethanol, methanol, aceton, nhiệt độ nóng chảy 261 °C; SKLM: Rf (hệ dung môi): A (0,4), C (0,2), D (0,3); IR (cm-1): 3296,35 ( N – H amin); 3064,89 ( C – H nhân thơm); 1H- NMR (500 MHz, DMSO, δ ppm): 12,376 (s, 1H, H3); 12,336 (s, 1H, H1); 7,034-7,017 B - Khoa học Dược Nghiên cứu (d, J = Hz, 1H, H7); 6,731-6,708 (dd, J1 = Hz, J2 = Hz, 1H, H6); 6,671-6,667 (d, J = Hz, 1H, H4); 3,740 (s, 3H, H10); 13C-NMR (125 MHz, DMSO, δ ppm): 167,75 (C2); 155,69 (C5); 133,00 (C9); 126,32 (C7); 109,89 (C8); 109,65 (C6); 94,41 (C4); 55,50 (C10); MS: Giá trị tính tốn cho [M+H]+ (C8H9N2OS) + = 181,0436; [M-H](C8H7N2OS) - = 179,0279, giá trị đo 181,0506 179,0675 Tổng hợp dẫn chất alkyl methoxybenzimidazol-2-thion (2,3,4,5,6,7) 5- Tr on g bìn h c ầ u 100 ml, ch o g 5-methoxybenzimidazol-2-thion (3) (5 mmol), 11 ml hỗn hợp dung môi DCM: TEA (10:1), ml benzyl bromid (8,5 mmol) Khuấy đun hồi lưu nhiệt độ 40 oC Hỗn hợp sau phản ứng chuyển sang cốc có mỏ khuấy trực tiếp bếp từ có gia nhiệt đuổi dung mơi Ngừng gia nhiệt bay lên không làm xanh giấy quỳ ẩm, hỗn hợp phản ứng rắn lại Hòa tan rắn lượng tối thiểu ethanol tuyệt đối (10ml), thêm từ từ dung dịch HCl 10% bắt đầu xuất tủa Thêm dần 100 ml nước cất vào hỗn hợp Lọc qua phễu Buchner thu tủa, rửa tủa với 100 ml nước cất thu sản phẩm thô Sản phẩm thô kết tinh lại ethanol dung dịch HCl 10%, lọc sấy 45 – 50 °C Thu 1,15 g sản phẩm (4,3 mmol), hiệu suất đạt 85% Sản phẩm thu sau phản ứng gồm chất có Rf khác tách phương pháp kết tinh lại dung mơi Do đó, sử dụng phương pháp sắc ký cột để tách tinh chế sản phẩm Các phản ứng với dẫn chất alkyl clorid khác tiến hành tương tự phản ứng với benzyl bromid Hiệu suất phản ứng dao động từ 30 - 85% (Bảng 1) Chất (2): 2-(benzylthio)-5-methoxybenzimidazol C15H14N2OS P.t.l: 270,35 Bột kết tinh màu trắng, tan cloroform, ethanol, methanol, aceton, nhiệt độ nóng chảy 192 °C; SKLM: Rf (hệ dung mơi): B (0,61), C (0,38), D (0,53); IR 35 Nghiên cứu Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số * 2020 (cm-1): 3317,56 ( N – H amin); 3003,17 ( C – H nhân thơm); 1496,76 ( C = C nhân thơm); 1HNMR (500 MHz, DMSO, δ ppm): 7,542-7,524 (d, J = Hz, 1H, H7); 7,468-7,451 (d, J = 8,5 Hz, 2H, H2’, H6’); 7,329-7,299 (dd, J1 = 6,5 Hz, J2 = 8,5 Hz, 2H, H3’, H5’); 7,276-7,261 (d, J = 7,5 Hz, 1H, H4’); 7,103-7,098 (d, J = Hz, 1H, H4); 7,015-6,992 (dd, J1 = Hz, J2 = Hz, 1H, H6); Bảng Phản ứng alkyl hóa tạo dẫn chất alkyl Chất R 4,777 (s, 2H, H11); 3,815 (s, 3H, H10); 13C-NMR (125 MHz, DMSO, δ ppm): 157,10 (C5); 147,79 (C2); 136,22 (C9); 134,77 (C1’); 128,84 (C8); 128,66 (C3’ & C5’); 128,47 (C2’ & C6’); 127,83 (C4’); 114,15 (C7); 113,92 (C6); 96,04 (C4); 55,74 (C10); 36,44 (C11); MS: Giá trị tính toán cho [M+H]+ (C15H15N2OS) + = 271,0905; giá trị đo 271,0939 Cấu tạo Hiệu suất 85 % 43 % 42 % 46 % 32 % 36 B - Khoa học Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số * 2020 Chất (3): 2-((2-chlorobenzyl) methoxybenzimidazol thio)-5- C15H13ClN2OS P.t.l: 304,79 Bột màu trắng, tan ethanol, methanol, aceton, cloroform, tan nước, nhiệt độ nóng chảy 194 °C; SKLM: Rf (hệ dung môi): B (0,55), C (0,33), D (0,43); IR (cm-1): 2991,59 ( C – H alkan); 3064,89 ( C – H nhân thơm); 1506,41 ( C = C nhân thơm); 1H- NMR (500 MHz, DMSO, δ ppm): 8,453-8,435 (dd, J1 = Hz, J2 = Hz, 1H, H3’); 8,402-8,385 (d, J = Hz, 1H, H7); 8,334-8,315 (dd, J1 = Hz, J2 = Hz, 1H, H6’); 8,186-8,152 (td, 1H, H4’); 8,124-8,092 (td, 1H, H5’); 7,954-7,950 (d, J = Hz, 1H, H4); 7,882-7,859 (dd, J1 = Hz, J2 = Hz, 1H, H6); 5,678 (s, 2H, H11); 4,657 (s, 3H, H10); C-NMR (125 MHz, DMSO, δ 13 ppm): 157,33 (C5); 146,94 (C2); 134,52 (C1’); 133,63 (C9); 133,25 (C8); 131,20 (C2’); 130,10 (C3’); 129,75 (C4’); 128,15 (C6’); 127,61 (C7); 114,40 (C5’); 114,25 (C 6); 96,00 (C4); 55,79 (C10); 35,07 (C11); MS: Giá trị tính toán cho [M+H]+ (C15H14ClN2OS)+ = 305,0515; giá trị đo 305,0490 Chất (4): 1,3-di(2-chlorobenzyl)-5-methoxybenzimidazol-2-thion C22H18Cl2N2OS P.t.l: 429,36 Tinh thể hình kim, màu nâu nhạt tan cloroform, aceton, tan nước, ethanol, có nhiệt độ nóng chảy 178 °C; SKLM: Rf (hệ dung môi): C (0,74), E (0,8), F (0,85); IR (cm-1): 2991,59 ( C – H alkan); 3064,89 ( C - H nhân thơm); 1496,76 ( C = C nhân thơm); 1H- NMR (500 MHz, DMSO, δ ppm): 7,569-7,544 (m, 2H, H3’, H3”); 7,359-7,321 (m, 2H, H4’, H4”); 7,286-7,244 (m, 2H, H5’, H5”); 7,207-7,190 (d, J = Hz, 1H, H7); 6,995-6,991 (d, J = Hz, 1H, H4); 6,857-6,835 (dd, J1 = Hz, J2 = Hz, 1H, H6); 6,800-6.765 (m, 2H, H6’, H6”); 5,684 (s, 2H, H11); 5,661 (s, 2H, H12); 3,721 (s, 3H, H10); 13C-NMR (125 MHz, DMSO, δ ppm): 169,83 (C2); 156,65 (C5); 133,10 (C9); 133,02 (C2’); 132,53 (C2’’); 131,77 (C8); 131,73 (C6’ & C6”); 129,54 (C1’); 129,08 (C3’ & C3”); 129,03 (C1’’); B - Khoa học Dược Nghiên cứu 127,46 (C5’); 127,35 (C5”); 127,28 (C4’); 125,60 (C4’’); 110,44 (C7); 110,41 (C6); 95,47 (C4); 55,78 (C10); 45,38 (C11); 45,34 (C12), MS: Giá trị tính tốn cho [M+H]+ (C22H19Cl2N2OS)+ = 429,0595; giá trị đo 429,0593 Chất (5): 2-((2-methylbenzyl) methoxybenzimidazol thio) -5- C16H16N2OS P.t.l: 284,38 Bột kết tinh màu trắng, tan cloroform, ethanol, methanol, aceton; có độ nóng chảy 189 °C SKLM: Rf (hệ dung môi): B (0,58), C (0,3), D (0,25) UV (λmax) (nm): IR (cm-1): 3377,36 ( N – H amin); 2937,59 ( C – H alkan); 1458,18 ( C = C nhân thơm); 1HNMR (500 MHz, DMSO, δ ppm): 7,579-7,561 (d, J = Hz, 1H, H7); 7,370-7.356 (d, J = Hz, 1H, H3’); 7,234-7,188 (m, 2H, H5’, H6’); 7,128-7,124 (d, J = Hz, 1H, H4); 7,113-7,095 (dd, J1 = 1,5 Hz, J2 = Hz, 1H, H4’); 7,060-7,037 (dd, J1 = Hz, J2 = Hz, 1H, H6); 4,794 (s, 2H, H11); 3,833 (s, 3H, H10); 2,411 (s, 3H, H12); 13C-NMR (125 MHz, DMSO, δ ppm): 157,32 (C5); 147,58 (C2); 136,93 (C1’); 133,21 (C9); 130,60 (C2’); 129,67 (C8 & C3’); 128,35 (C6’ & C4’); 126,20 (C5’); 114,32 (C7); 114,14 (C6); 95,98 (C4); 55,79 (C10); 35,47 (C11); 18,72 (C12); MS: Giá trị tính tốn cho [M+H]+ (C16H17N2OS) + = 285,1061; giá trị đo 285,1010 Chất (6): 1,3-di(2-methylbenzyl)-5methoxybenzimidazol-2-thion C24H24N2OS P.t.l: 388,53 Bột kết tinh màu nâu, tan cloroform, aceton, tan ethanol, nước; có nhiệt độ nóng chảy 173 °C; SKLM: Rf (hệ dung môi): C (0,8), E (0,9), F (0,78); IR (cm-1): 3020,53 ( C – H nhân thơm); 1458,18 ( C = C nhân thơm); 2920,23 ( C – H alkan); 1HNMR (400 MHz, DMSO, δ ppm): 7,27 – 7,24 (m, 2H, H4 & H7); 7,20 – 7,16 (tdd, J1 = Hz, J2 = 3, J3 = 7,5, J4 = 7,5), 2H, H3’ & H5’); 7,12 – 7,08 (m, 3H, H5’’, H3’’ & H6’); 6,85 – 6,84 (d, J=2, 1H, H6’’); 6,81 – 6,78 (dd, J1=2, J2 = 8,75 1H, H6); 6,63 – 6,60 (dd, J1=1, J2 = 3, J3 = 7,5, 2H, H4’ &4’’); 5,59 (s, 2H, H11); 5,58 (s, 2H, H12); 3,68 (s, 3H, H10); 2,43 (s, 3H, H13); 2,42 (s, 3H, H14); 13C-NMR (125 MHz, DMSO, δ ppm): 170,20 (C2); 156,86 (C5); 37 Nghiên cứu Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số * 2020 135,94 (C9); 135,92 (C1’ & C1”); 134,25 (C8); 133,15 (C2’ & C2”); 130,81 (C3’ & C3”); 127,57 (C7); 126,43 (C4’ & C4”); 126,33 (C5’); 125,77 (C6’); 125,66 (C5’’); 111,09 (C6’’); 110,42 (C6); 96,17 (C4); 56,23 (C10); 46,23 (C11); 46,18 (C12); 19,35 (C13 & C14) MS: Giá trị tính tốn cho [M+H]+ (C24H25N2OS) + = 389,1687; giá trị đo 389,1581 Chất (7): 2-((4-fluorobenzyl) methoxybenzimidazol thio)-5- C15H13FN2OS P.t.l: 288,34 Bột kết tinh màu trắng tan cloroform, ethanol, methanol, aceton, có nhiệt độ nóng chảy 185 °C; SKLM: Rf (hệ dung môi): B (0,7), C (0,42), D (0,6); IR (cm-1): 3415,93 ( N – H amin); 1456,26 ( C = C nhân thơm) 1H- NMR (500 MHz, DMSO, δ ppm): 7,567-7,549 (d, J = Hz, 1H, H7); 7,532-7,503 (m, 2H, H2’ & H6’); 7,165-7,129 (m, 2H, H3’ & H5’); 7,118-7,113 (d, J = Hz, 1H, H4); 7,050-7,027 (dd, J1 = Hz, J2 = Hz, 1H, H6); 4,798 (s, 2H, H11); 3,824 (s, 3H, H10); 13C-NMR (125 MHz, DMSO, δ ppm): 162,61 (C4’); 160,67 (C5); 157,35 (C2); 147,53 (C9); 134,20 (C1’); 132,46 (C8); 131,01 (C2’); 130,94 (C6’); 127,77 (C7); 115,63 (C3’); 115,45 (C5’); 114,39 (C6); 95,94 (C4); 55,79 (C10); 35,75 (C11); MS: Giá trị tính tốn cho [M+H]+ (C15H14FN2OS) + = 289,0810; giá trị đo 289,0794 Kết cho thấy sản phẩm (2,3,4,5,6,7) có cấu trúc phù hợp với cấu trúc dự kiến Tổng hợp dẫn chất 5-methoxybenzimidazol-2-thion acyl Trong bình cầu 100 ml, cho 1g 5methoxybenzimidazol-2-thiol (5 mmol), ml pyridin, ml anhydrid acetic (55 mmol) (trong tổng hợp sản phẩm (8)) ml benzoyl clorid (26 mmol) (trong tổng hợp sản phẩm (9)) Khuấy đun hồi lưu nhiệt độ 70 - 80 oC Hỗn hợp sau phản ứng để nguội, thêm từ từ 100 ml nước cất, khuấy kỹ thấy tủa xuất Lọc thu tủa qua phễu Buchner, rửa tủa với 100 ml nước cất thu sản phẩm thô Sản phẩm thô tinh chế phương pháp kết tinh lại hỗn hợp 38 ethanol: nước (1:2), lọc sấy 45-50°C Thu 1,04 g sản phẩm tinh khiết (4,7 mmol), hiệu suất đạt 85% (sản phẩm 8) 1,76 g sản phẩm tinh khiết (4mmol), hiệu suất đạt 82% (sản phẩm 9) Chất (8): thion 1-acetyl-5-methoxy-benzimidazol-2- C10H10N2O2S P.t.l: 222,26 Bột kết tinh màu nâu sậm, tan cloroform, ethanol, methanol, aceton, có nhiệt độ nóng chảy 186,5 °C; SKLM: Rf (hệ dung mơi): B (0,6), C (0,35), D (0,5); IR (cm-1): 1678,07 ( C = O amid); 3020,53 ( C – H nhân thơm); 1402,25 ( C = C nhân thơm); 1H- NMR (500 MHz, DMSO, δ ppm): 13,192 (s, 1H, H3); 7,9057,887 (d, J = Hz, 1H, H7); 6,810-6,787 (dd, J1 = Hz, J2 = Hz, 1H, H6); 6,671-6,666 (d, J = Hz, 1H, H4); 3,774 (s, 3H, H10); 2,973 (s, 3H, H12); 13C-NMR (125 MHz, DMSO, δ ppm): 171,58 (C11); 169,95 (C2); 157,20 (C5); 131,97 (C9); 124,68 (C8); 116,4 (C7); 109,92(C6); 94,15 (C4); 55,44 (C10); 27,77 (C12); MS: Giá trị tính tốn cho [M+H] + (C10H11N2O2S)+ = 223,0541; [M-H]- (C10H9N2O2S) = 221,0384; giá trị đo 223,0440 221,0392 Chất (9): 1,3-dibenzoyl-5-methoxybenzimidazol2-thion C22H16N2O3S P.t.l: 388,44 Bột kết tinh màu vàng, tan cloroform, ethanol, methanol, aceton, có nhiệt độ nóng chảy 160 oC; SKLM: Rf (hệ dung môi): C (0,7), D (0,75), E (0,85); IR (cm1): 1598,99 ( C = O amid); 3064,89 ( C – H nhân thơm); 1492,90 ( C = C nhân thơm); 1H- NMR (500 MHz, CDCl3, δ ppm): 7,924-7,885 (m, 4H, H2”, H6”, H2’, H6’); 7,657-7,610 (m, 2H, H4’, H4”); 7,509-7,465 (m, 4H, H3”, H5”, H3’, H5’); 7,304-7,286 (d, J = Hz, 1H, H7); 6,902-6,897 (d, J = Hz, 1H, H4); 6,864-6,841 (dd, J1 = Hz, J2 = Hz, 1H, H6); 3,796 (s, 3H, H10); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3, δ ppm): 170,19 (C2); 168,98 (C11); 168,91 (C12); 157,94 (C5); 134,57 (C9); 132,53 (C1”); 132,36 (C1’); 132,28 (C2” & C6”); 130,71 (C2’ & C6’); 130,61 (C3’ & C5’); 128,91 (C3” &C5”); 128,81 (C9); 127,75 (C4’ &4’’); 125,44 (C7); 112,83 (C8); 112,08 (C6); 97,14 (C4); 55,98 (C10); MS: Giá trị tính tốn cho [M+H]+ (C22H17N2O3S)+ = 389,0959; giá trị đo 389,0935 B - Khoa học Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số * 2020 Nghiên cứu Bảng Kết thử tính gây độc tế bào Mẫu (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) HEPG2 IC50 (µM) > 100 > 100 > 100 > 100 27.70 48.48 > 100 > 100 > 100 SD 0.55 1.54 TB UNG THƯ RD IC50 (µM) SD 27.29 38.15 > 100 23.88 21.30 10.71 53.01 > 100 > 100 BÀNLUẬN Phản ứng tạo 5-methoxybenzimidazol-2-thion từ nguyên liệu ban đầu 4-methoxy-2-nitroanilin theo phương pháp thiocarbanilid dễ thực hiện, cho sản phẩm tinh khiết Đây gần phương pháp tối ưu để tổng hợp hợp chất chứa dị vòng benzimidazol-2-thion Tuy nhiên việc thực phản ứng với CS2 phải cẩn thận CS2 dễ cháy nổ Phản ứng alkyl hóa 5-methoxybenzimidazol-2thion với alkyl halid hỗn hợp dung môi DCM: TEA (10:1) thu sản phẩm tinh khiết sau tách sắc ký cột, dễ thực Điều giúp việc nghiên cứu tổng hợp thêm nhiều hoạt chất với alkyl halid khác trở nên dễ dàng Phản ứng acyl hóa 5-methoxybenzimidazol-2thion với anhydrid acetic hay benzoyl clorid dung môi pyridin thu sản phẩm dễ dàng, đạt hiệu suất cao Tất sản phẩm 1:1 S, điều cho thấy vị trí S ưu tiên gắn nhóm vị trí N; nhiên, hai nhóm lại khơng vào S, chứng phổ cho thấy di alkyl lại vào vị trí N, N Điều suy đốn lúc đầu, nhóm alkyl ưu tiên vào S, sau nhóm alkyl gắn vào N, sản phẩm bị chi phối động học, tự động chuyển thành đồng phân có độ bền cao (tạo thành sản phẩm bền động học), nhóm đẩy cực mạnh, tự chuyển sang B - Khoa học Dược MDA IC50 (µM) 1.33 0.93 0.64 0.25 0.34 1.44 43.05 > 100 > 100 31.75 18.66 21.56 80.45 > 100 > 100 SD 1.35 0.23 1.05 0.48 2.10 TB THƯỜNG LLCPK1 IC50 SD > 100 > 100 > 100 58.30 97.56 88.57 > 100 > 100 > 100 nối N,N để giảm sức căng nội phân tử, tạo sản phẩm bền Đặc biệt nhóm có gắn thêm – CH3 –Cl nằm gần có độ bền nhiệt động học Ở chênh lệch độ bền gây chuyển vị chưa đủ (khơng phải hổ biến) Hoạt tính gây độc tế bào không đồng dẫn chất Chỉ có dẫn chât thử nghiệm (5) (6) ức chế dòng tế bào ung thư HEPG2 Dòng tế bào RD bị ức chế chất thử nghiệm (1), (2), (4), (5), (6) (7) Dòng tế bào MDA bị ức chế chất thử nghiệm (1), (4), (5), (6) (7) Các chất thử nghiệm (4), (5) (7) ảnh hưởng dòng tế bào thường KẾT LUẬN Phản ứng alkyl hóa 5-methoxybenzimidazol2-thion với alkyl halid hỗn hợp dung môi DCM: TEA (10:1), sau tách hỗn hợp sản phẩm sắc ký cột thu sản phẩm tinh khiết Phản ứng acyl hóa 5methoxybenzimidazol-2-thion thu sản phẩm dễ dàng Tất sản phẩm alkyl 1:1 S, điều cho thấy vị trí S ưu tiên gắn nhóm alkyl vị trí N Trong lúc dòng tế bào ung thư bị ức chế từ đến dẫn chất tổng hợp chất số có ảnh hưởng lên dòng tế bào thường TÀI LIỆU THAM KHẢO Gurrala S, Babu YR, Rao GV, Latha BM (2011) Symmetrical coupling of 2-mercapto benzimidazole derivatives and their antimicrobial activity Int J Pharma Pharma Sci, 3(2):217-220 39 Nghiên cứu 40 Singh GS, Mmolotsi BJ (2005) Synthesis of 2-azetidinones from 2-diazo-1,2-diarylethanones and N-(2thienylidene)imines as possible antimicrobial agents Il Farmaco, 60(9):727-730 Asif H, Varshney MM, Rashid M, Ravinesh M, Afroz A (2011) Benzimidazole: A valuable insight into the recent advances and biological activities Journal of Pharmacy Research, 4(2):413-419 Rao A, Chimirri A, De Clercq E, Monforte AM, Monforte P, Pannecouque C, Zappala M (2002) Synthesis and anti-HIV activity of 1-(2,6-difluorophenyl)-1H,3H-thiazolo[3,4- Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số * 2020 a]benzimidazole structurally-related of 1,2substitutedbenzimidazoles Il Farmaco, 57(10):819-823 Banik BK, Becker FF, Banik I (2004) Synthesis of anticancer beta-lactams: mechanism of action Bioorganic & Medicinal Chemistry, 12(10):2523-2528 Ngày nhận báo: 05/02/2020 Ngày phản biện nhận xét báo: Ngày báo đăng: 24/04/2020 20/07/2020 B - Khoa học Dược ... độ bền gây chuyển vị chưa đủ (không phải hổ biến) Hoạt tính gây độc tế bào khơng đồng dẫn chất Chỉ có dẫn chât thử nghiệm (5) (6) ức chế dòng tế bào ung thư HEPG2 Dòng tế bào RD bị ức chế chất. .. (2:1) Nguyên liệu thử độc tế bào Dòng tế bào HEPG2 (tế bào ung thư gan người), RD (tế bào ung thư vân người), MDA-MB-231 (tế bào ung thư vú người), LLC-PK1 (tế bào thận heo) hoạt hóa ni cấy viện... hợp sàng lọc chất có hoạt tính gây độc tế bào tốt dựa kết đạt được, chọn hướng nghiên cứu tổng hợp dẫn chất 5-methoxy-benzimidazol-2-thion, hướng biến đổi triển vọng khung dẫn chất để tiếp tục sàng