Tối ưu hóa các điều kiện sản xuất vaccine bất hoạt phòng bệnh gan thận mủ cho cá tra

Nghiên cứu này được thực hiện nhằm tối ưu hóa các điều kiện sản xuất vaccine sốc nhiệt bất hoạt phòng bệnh gan thận mủ trên cá tra. Chủng vi khuẩn dùng làm vaccine được phân lập và chọn lọc từ mẫu cá tra bệnh gan thận mủ thu tại các tỉnh Tiền Giang, Đồng Tháp và An Giang. Với phương pháp sốc nhiệt và kiểm tra protein sốc nhiệt bằng phản ứng SDS-PAGE và Western Blot cho thấy ở điều kiện gây sốc 41o C trong 30 phút E. ictaluri sinh lượng heat shock nhiều hơn so với các điều kiện thử nghiệm khác.

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN STUDY OF TRANSMISSION OF INFECTIOU HYPERDERMAL AND HEMATOPIETIC NECROSIS VIRUS (IHHNV) IN BLACK TIGER SHRIMP (PENEUS MONODON) Cao Thanh Trung1, Pham Cong Nguyen1, Nguyen Van Hao2 ABSTRACT The infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus (IHHNV) also called Penaeus stylirostris densovirus (PstDNV) has been identified high mortality Penaeus stylirostris in the Americas It has been reported to cause Runt deformity syndrome (RDS) in Penaeus vannamei which is a chronic, non-lethal disease At present, there is no established experimental model of infection in Penaeus monodon under laboratory conditions Transmission of IHHNV have been experimented by the horizontal and vertical routes Horizontal transmission were performed with trials which are fed with the infected shrimps, co-habitant, combine with feeding and cohabitant The vertical transmission from infected females to offspring have been demonstrated The IHHNV infection was monitored by PCR assay Result of experiments were showed that IHHNV vertical transmission from infected females were clearly proved All life stages that produced from infected females were presented the IHHNV by PCR assay In horizontal transmission, the free IHHNV of P monodon in all trials that were positive with the IHHNV at 14 days and 28 days after the infection In the trial of cohabiting IHHNV infected P mondon was 60.0% and 86.7%; feeding with IHHNV infected P mondon was 46.7% and 60.0%; combine feeding and cohabitan was 66.7% and 76.7% In infection with difference of species trials The percent of infected IHHNV of P monodon of cohabitant trial was 43.3% and 66.7% after infected at 14 days and 28 days; feeding trial was 13.3% and 40.0%; and the combine feeding and cohabitant trial was 26.7% and 80.0% Experimental infection could be used to study the P monodon pathogen further in order to prevent and control of virus infected in shrimps Keywords: IHHNV, Penaeus monodon, transmission Người phản biện: TS Lê Hồng Phước Ngày nhận bài: 10/02/2014 Ngày thông qua phản biện: 28/02/2014 Ngày duyệt đăng: 30/3/2014 Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment and Epidemic, Research Institute for Aquaculture No2 Email: thanhtrung77@yahoo.com Research Institute for Aquaculture No2 110 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 6/2014 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN TỐI ƯU HÓA CÁC ĐIỀU KIỆN SẢN XUẤT VACCINE BẤT HOẠT PHÒNG BỆNH GAN THẬN MỦ CHO CÁ TRA Lê Hồng Phước1, Võ Hồng Phượng1, Nguyễn Thị Hiền1, Ngơ Thị Bích Phượng1, Nguyễn Phạm Hồng Huy1, Chung Minh Lợi1 TÓM TẮT Nghiên cứu thực nhằm tối ưu hóa điều kiện sản xuất vaccine sốc nhiệt bất hoạt phòng bệnh gan thận mủ cá tra Chủng vi khuẩn dùng làm vaccine phân lập chọn lọc từ mẫu cá tra bệnh gan thận mủ thu tỉnh Tiền Giang, Đồng Tháp An Giang Với phương pháp sốc nhiệt kiểm tra protein sốc nhiệt phản ứng SDS-PAGE Western Blot cho thấy điều kiện gây sốc 41oC 30 phút E ictaluri sinh lượng heat shock nhiều so với điều kiện thử nghiệm khác Thử nghiệm bốn loại môi trường canh dinh dưỡng Brain Heart Infusion Broth (BHIB), Nutrient Broth (NB), Tryptic Soy Broth (TSB) Hottinger cho thấy E ictaluri phát triển tốt môi trường BHIB pH thích hợp cho chủng vi khuẩn phát triển trì độc lực 7,0 Khảo sát điều kiện phát triển nồi lên men cho thấy điều kiện tốc độ khuấy 200 vòng /phút, lượng khí thổi vào lít/phút thời gian thu hoạch vi khuẩn sau 36 tăng sinh cho hiệu kích thích sinh miễn dịch tốt Vaccine sản xuất khơng có tính độc cá tra, liều vaccine x 109 CFU/cá có khả kích thích sinh miễn dịch bảo hộ cho cá với số RPS = 53% Có khác biệt có ý nghĩa thống kê tỷ lệ chết sau gây nhiễm nhóm cá đối chứng nhóm tiêm vaccine (p < 0,05) Từ khóa: Cá tra, vaccine, Edwarsiella ictaluri I ĐẶT VẤN ĐỀ Trong năm gần đây, cá tra xem đối tượng nuôi chủ lực nước tập trung chủ yếu khu vực Đồng sông Cửu Long Hiện số tỉnh có diện tích sản lượng cá tra lớn nước như: Đồng Tháp, Tiền Giang, Bến Tre, An Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long, Hậu Giang Theo thống kê Tổng Cục Thủy Sản, tình hình ni cá tra gặp nhiều khó khăn giá thị trường tiêu thụ tháng đầu năm 2013 Ngoài ra, dịch bệnh cá tra tránh khỏi làm ảnh hưởng phần đến sản lượng thu hoạch Bệnh gan thận mủ xem bệnh thường xuất nguy hiểm cá tra Bệnh xuất hầu hết giai đoạn nuôi thường nặng thời điểm giao mùa mưa nhiều làm nhiệt độ nước giảm thấp 28oC Người nuôi can thiệp nhiều biện pháp khác đáng kể việc sử dụng kháng sinh Kháng sinh phịng trị bệnh nhiễm khuẩn gây nhiều hậu đáng kể việc kháng thuốc dư lượng kháng sinh thịt cá Trên giới, việc phòng bệnh vaccine áp dụng nhiều mang lại hiệu cá hồi Ngồi có nhiều cơng trình nghiên cứu ứng dụng vaccine loài cá khác rô phi, cá chép Các loại vaccine thử nghiệm bao gồm vaccine vô hoạt, vaccine nhược độc vaccine tái tổ hợp Trong nghiên cứu vaccine bất hoạt sản xuất theo hướng sốc nhiệt nhằm mục đích mong muốn làm tăng hiệu vaccine Qua nghiên cứu cho thấy protein sốc nhiệt (heat shock Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo Mơi trường Phịng ngừa Dịch bệnh Thủy sản Khu vực Nam bộ, Viện Nghiên cứu Ni trồng Thủy sản Email: lehongphuoc@yahoo.com TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 6/2014 111 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN protein: HSP) làm tăng cường đáp ứng miễn dịch đối tượng thủy sản Cụ thể ấu trùng Artemia nuôi 28°C gây sốc 37°C 30 phút 6h hồi phục cho thấy khả đề kháng với vi khuẩn gây bệnh Vibrio campbellii Tỷ lệ sống tăng gấp đơi nhóm gây sốc nhiệt so với nhóm đối chứng chứng tỏ HSP70 có vai trị bảo vệ Artemia tác nhân gây bệnh (Yeong ctv, 2007, 2008) Hsp60 Hsp70 chiết xuất từ Escherichia coli có khả kích thích tăng hàm lượng kháng thể cá hồi sau tiêm Hsp70 Vì Hsp xem chất làm tăng cường hiệu vaccine (Plant ctv, 2009) Ở Việt Nam thời điểm có cơng ty TNHH PHARMAQ đăng ký sản phẩm vaccine cá tra bước đầu Ngồi có vài nghiên cứu vaccine phòng bệnh gan thận mủ cá tra dạng đề tài nghiên cứu thực Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản hay trường Đại Học Trong nghiên cứu quy trình sản xuất vaccine tối ưu hóa mơi trường tăng sinh vi khuẩn, lượng khí thổi vào, tốc độ khuấy thời gian thu hoạch vi khuẩn thích hợp II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Vật liệu: Chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (Gly 09M) phân lập từ cá tra bệnh thu ĐBSCL sử dụng làm nguồn nguyên liệu tạo vaccine, cá tra (20-25g/con khỏe mạnh, không bị nhiễm vi khuẩn E ictaluri) Thiết bị: Nồi lên men (10 lít), máy trộn mẫu, máy quang phổ đo OD, máy ly tâm, tủ ấm, tủ cấy vi sinh, tủ mát 40C, tủ lạnh -20oC, -70oC, cân điện tử, kim tiêm 1ml, kim tiêm tự động, ống nghiệm, eppendorf, đĩa petri, bể composite 1m3, bể kính (80 lít), … Hóa chất mơi trường: - Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: Brain Heart Infusion Broth (BHIB), Nutrient Broth 112 (NB), Tryptic Soy Broth (TSB), Hottinger môi trường thạch máu Blood Agar (BA) với 5% máu cừu - Dung dịch formaline bất hoạt vi khuẩn, thuốc gây mê số hóa chất thơng dụng khác gồm: nước muối 0,85% NaCl, thuốc tím, Chlorine, … 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy, phân lập định danh vi khuẩn Dùng môi trường: Blood agar, BrainHeart Infusion Agar cho phân lập vi khuẩn Sử dụng test kit API 20E để test sinh hóa định danh vi khuẩn theo khóa phân loại Bergey (1996) Ngồi cịn xác định E ictaluri phương pháp PCR 2.2.2 Gây bệnh thực nghiệm phương pháp tiêm Gây mê cá thí nghiệm EGME (Ethylene Glycol Monophenyl Ether, Merck) 0,2 ppt (1 ml EGME lít nước) 3-5 phút Sử dụng kim tiêm bán tự động (Socorex) với chiều dài mũi kim tiêm mm dùng cho cá 10-40 g để đảm bảo an tồn cho cá thí nghiệm 2.2.3 Phương pháp đánh giá hiệu lực vaccine Đánh giá hiệu lực vaccine qua giá trị RPS relative percent survival (tỷ lệ sống tương đối) theo công thức Amend (1981): Tỷ lệ % số cá vaccine chết RPS (%) = (1- -) x 100 Tỷ lệ % số cá đối chứng chết 2.3 Bố trí thí nghiệm: Kiểm tra mơi trường thích hợp cho E Ictaluri Thí nghiệm 1: Theo dõi phát triển vi khuẩn 04 loại môi trường Sau 36-40h nuôi cấy E ictaluri thạch máu tiến hành thu khuẩn lạc tạo dịch huyền phù nước muối sinh lý Đo mật độ quang (OD550) tính tốn mật độ vi khuẩn ban đầu để TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 6/2014 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN cho vào loại môi trường thử nghiệm (NB, BHIB, TSB Hottinger) Mật độ vi khuẩn ban đầu thí nghiệm 103 CFU/ml ủ 28oC điều kiện ni cấy động (tủ ấm lắc, 150 vịng/phút) Sau 3h thu mẫu đo mật độ quang cấy môi trường NA để xác định tổng số vi khuẩn Thí nghiệm 2: Theo dõi phát triển E ictaluri mơi trường BHIB NB Thí nghiệm bố trí tương tự thí nghiệm Tuy nhiên có loại mơi trường sử dụng BHIB NB với mục đích kiểm chứng mơi trường ni cấy thích hợp Thí nghiệm 3: Khảo sát phát triển vi khuẩn giá trị pH 4, 5, 6, 7, Sử dụng mơi trường ni cấy BHIB, thể tích nuôi cấy 50 ml, điều kiện nuôi cấy lắc 150 vòng/phút, nhiệt độ 28-30°C Mật độ vi khuẩn E icttaluri lúc bắt đầu nuôi cấy 106 CFU/ml Theo dõi mật độ vi khuẩn cách đo OD bước sóng 550nm vịng 48 (lấy mẫu giờ/lần) Thí nghiệm 4: Khảo sát phát triển vi khuẩn giá trị pH gồm pH = 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 8,0 Sử dụng môi trường nuôi cấy BHIB, thể tích ni cấy 50 ml, điều kiện ni cấy lắc 150 vịng/phút, nhiệt độ 28-30°C Mật độ vi khuẩn E ictaluri lúc bắt đầu nuôi cấy 106 CFU/ml Theo dõi mật độ vi khuẩn cách đo OD bước sóng 550nm vịng 48 (lấy mẫu giờ/lần) Thí nghiệm 5: Khảo sát phát triển E ictaluri môi trường BHIB pH = 6, Ở thí nghiệm cịn có phần kiểm tra độc lực vi khuẩn sau tăng sinh điểm pH khảo sát Vì thời điểm 18 sau tăng sinh tiến hành thu sinh khối vi khuẩn phát triển môi trường BHIB giá trị pH 6, 8, pha loãng để nồng độ gây nhiễm đồng x104 CFU/cá Bố trí thí nghiệm gây nhiễm, pH mơi trường tiêm cho 10 cá, lặp lại lần, nghiệm thức đối chứng tiêm với nước muối sinh lý gồm 10 cá lặp lại lần Theo dõi cá ghi nhận số cá chết tuần sau tiêm vi khuẩn Thí nghiệm 6: Bước đầu khảo sát tốc độ khuấy đảo 150, 200 250 vòng/phút nồi lên men LiFlus GX (Tăngil, Ấn Độ) Nhiệt độ nuôi cấy nồi lên men ổn định 28°C Lưu lượng khí thổi vào lần khảo sát tốc độ khuấy đảo L/phút Mật độ vi khuẩn E ictaluri ban đầu 103 CFU/ml thể tích ni cấy L môi trường BHI (pH = 7) Thu mẫu lần vòng 48 để đo OD550nm trải đĩa xác định mật độ tương đối vi khuẩn Thí nghiệm 7: Căn kết thí nghiệm xác định tốc độ khuấy thích hợp (200 vịng/phút) sau tiến hành bố trí thí nghiệm mức lượng khí thổi vào 2, 4, lít/phút Thu mẫu kiểm tra OD cấy trãi đĩa xác định mật độ vi khuẩn sau 3, 6,…48 ni cấy nồi lên men Thí nghiệm 8: Kiểm tra tính sinh miễn dịch Nhân sinh khối E.ictaluri (GlyM09) điều kiện pH 7.0 nhiệt độ 280C tốc độ khuấy 150 vòng/ phút, 200 vòng/phút đồng thời lượng khí thổi vào lít/phút cho tốc độ khuấy Tiến hành thu vi khuẩn thời điểm 33 giờ, 36 giờ, 39 sau tiến hành sốc nhiệt vi khuẩn nhiệt độ 410C 30 phút (điều kiện tối ưu), bất hoạt vi khuẩn formalin 0,4% trước thử nghiệm vaccine để đánh giá thời gian thu vi khuẩn để sản xuất vaccine tốt thông qua tỷ lệ bảo hộ nghiệm thức Sau kiểm tra tính vơ trùng an tồn vaccine, tiêm vaccine cho cá tra thí nghiệm (20-25g/con) theo quy trình tiêm vaccine lần lần với liều sử dụng 3x109 CFU/cá cách 14 ngày, sau thời gian tuần từ lúc tiêm vaccine lần tiến hành công vi khuẩn mật độ 1,5x104CFU/cá Mỗi nghiệm thức gồm 90 cá (30 cá/bể x bể) TAÏP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 6/2014 113 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN III KẾT QUẢ 3.1 Theo dõi phát triển E ictaluri 04 loại môi trường Kết nuôi cấy cho thấy vi khuẩn phát triển nhanh môi trường BHIB NB Với mật độ vi khuẩn bắt đầu thấp (103 CFU/ml) pha lag dài Ở 12h sau tăng sinh vi khuẩn OD550 thấp (đồ thị 1) Kết đồ thị cho thấy khác biệt tốc độ phát triển vi khuẩn loại môi trường khác 3.2 Theo dõi phát triển E ictaluri môi trường BHIB NB Ở thí nghiệm có loại mơi trường khảo sát BHIB NB nhằm để lặp lại thí nghiệm làm sở để định môi trường dùng để tăng sinh vi khuẩn cho nội dung Kết thí nghiệm đồ thị tương tự đồ thị Kể từ sau 18 nuôi cấy môi trường BHIB cho thấy mức độ phát triển vi khuẩn môi trường cao nhiều so với môi trường NB tất thời điểm thu mẫu 21-48 giờ) 3.3 Khảo sát ảnh hưởng pH lên phát triển E ictaluri Thí nghiệm 3: Ở thí nghiệm giá trị pH = 4, 5, 6, 7, môi trường BHIB dùng để đánh giá tác động pH lên phát triển E ictaluri Ở thứ 24, giá trị OD550nm bắt đầu tăng mạnh từ thấp 114 Đồ thị Mật độ quang Edwardsiella ictaluri môi trường BHIB NB đến cao mơi trường có pH = 7, Tuy nhiên từ thứ 30 thứ 48, mức pH 6, 7, có thứ tự giá trị OD550nm từ thấp đến cao pH 8, Các mức pH khác cho thấy vi khuẩn phát triển không tốt (đồ thị 4) TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 6/2014 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN Thí nghiệm 4: Mục đích thí nghiệm khảo sát khoảng pH hẹp so với thí nghiệm Kết thí nghiệm cho thấy pH thấp cao vi khuẩn khơng thích nghi Vì thí nghiệm mơi trường BHIB với giá trị pH = 6, 6.5, 7, 7.5 khảo sát Kết cho thấy có tác động rõ rệt lên phát triển vi khuẩn E ictaluri Từ thứ 24 đến thứ 48, pH mơi trường thấp ngược lại giá trị OD550nm cao Như môi trường BHI, E ictaluri phát triển mạnh pH = phát triển giảm dần pH = 6.5, 7, 7.5 (đồ thị 5) Kết kiểm tra độc lực trình bày đồ thị Sau gây nhiễm, tỉ lệ chết cộng dồn cá tiêm với vi khuẩn nuôi môi trường BHIB pH = 37% pH = tỉ lệ chết cộng dồn 77% 73% Điều cho thấy pH môi trường ni cấy có ảnh hưởng đáng kể đến độc lực E ictaluri Vi khuẩn phát triển mơi trường BHI với pH = có độc lực cao cá tra Độc lực vi khuẩn cá tra giảm mạnh vi khuẩn phát triển mơi trường pH = Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng pH môi trường lên phát triển độc lực vi khuẩn Ở thí nghiệm khảo sát phát triển E ictaluri môi trường BHIB giá trị pH = 6, Thí nghiệm cịn có phần kiểm tra độc lực vi khuẩn sau tăng sinh điểm pH khảo sát Vì thời điểm 18 sau tăng sinh tiến hành thu sinh khối vi khuẩn phát triển môi trường BHI giá trị pH 6, 8, pha loãng để nồng độ gây nhiễm đồng x104 CFU/cá Kết cho thấy vi khuẩn phát triển tốt môi trường pH =6 so với pH cịn lại TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 6/2014 115 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 3.4 Khảo sát ảnh hưởng tốc độ khuấy lên phát triển E ictaluri nồi lên men Thí nghiệm 6: Kết đồ thị cho thấy giá trị OD550nm cao vi khuẩn E ictaluri nuôi với tốc độ khuấy đảo 250 vòng/phút, 200 vòng/phút thấp 150 vòng/phút từ thứ 21 đến thứ 36 Mặc dù kết đo OD550nm cho thấy có khác biệt phát triển vi khuẩn E ictaluri tốc độ khuấy đảo khác kết xác định mật độ tế bào vi khuẩn phương pháp pha loãng trải đĩa lại cho thấy khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê mật độ vi khuẩn tốc độ khuấy (đồ thị 8) Đồ thị Ảnh hưởng tốc độ khuấy lên phát triển E ictaluri nồi lên men thông qua giá trị OD550nm Đồ thị Ảnh hưởng tốc độ khuấy lên phát triển E ictaluri nồi lên men thông qua mật độ tế bào vi khuẩn (CFU/ml) Đồ thị Giá trị OD E ictaluri nuôi cấy nồi lên men với tốc độ khuấy 200 vịng/phút mức lượng khí thổi vào khác Đồ thị 10 Mật độ vi khuẩn môi trường BHIA thời điểm thu mẫu nồi lên men với tốc độ khuấy 200 vịng/phút lượng khí thổi vào 2, 4, lít/phút 116 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 6/2014 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN 3.5 Ảnh hưởng lượng khí thổi vào lên phát triển E ictaluri Thí nghiệm 7: Kết khảo sát tốc độ khuấy 200 vòng/phút với lượng khí thổi vào 2, 4, lít/phút nồi lên men cho thấy nghiệm thức với lượng khí thổi vào lít/phút vi khuẩn phát triển đến mức cực đại sau 36h nuôi cấy nồi lên men (đồ thị 9) Tuy nhiên, sau mật độ vi khuẩn giảm dần So với nghiệm thức khác nghiệm thức với lượng khí thổi vào lít/phút cho thấy vi khuẩn tăng nhanh mật độ sau 30h nuôi cấy, sau có biến động tăng giảm trì mức mật độ cao 48h ni cấy nồi lên men Nghiệm thức có lượng khí thổi vào lít/phút cho thấy có giá trị OD thấp so với nghiệm thực khác hầu hết điểm thu mẫu Kết thu mẫu cấy trải đĩa môi trường BHIA cho thấy mật độ vi khuẩn cao nghiệm thức có tốc độ khuấy 200 vịng/phút lượng khí thổi vào lít/phút (đồ thị 10) Tiếp theo 200 vịng/phút lượng khí thổi vào lít/phút Cũng giống kết đo OD, mật độ vi khuẩn lượng khí thổi vào lít/phút thấp Điều cho thấy vi khuẩn hiếu khí oxy cần thiết cho phát triển 3.6 Sản xuất vaccine bất hoạt thông qua sốc nhiệt protein vaccine Thí nghiệm thử nghiệm tốc độ khuấy (150 200 vòng/phút) lượng khí thổi vào (6 lít/phút) tiến hành thu vi khuẩn thời điểm 33 giờ, 36 giờ, 39 sau tiến hành sốc nhiệt vi khuẩn nhiệt độ 410C 30 phút (điều kiện tối ưu sốc nhiệt trình bày phần trên) sau bất hoạt vi khuẩn formalin 0,4% trước thử nghiệm vaccine để đánh giá thời gian thu vi khuẩn để sản xuất vaccine tốt thông qua tỷ lệ bảo hộ nghiệm thức Trong q trình thực thí nghiệm thu mẫu kiểm tra OD mật độ vi khuẩn cho nghiệm thức Kết giá trị OD số lượng tế bào/ml nghiệm thức (đồ thị 11 12) cho thấy tốc độ khuấy 200 vịng/phút 150 vịng/phút với lượng khí thổi vào lít/phút vi khuẩn phát triển tốt so với nghiệm thức có tốc độ khuấy lượng khí thổi vào lít/phút Bên cạnh đó, số lượng tế bào bắt đầu phát triển mạnh thời gian 33-36 bắt đầu giảm dần đến thời điểm 39 Trong khoảng thời gian 33-39 thu sinh khối vi khuẩn sốc nhiệt kiểm tra khả bảo hộ vaccine thời điểm 33, 36, 39 với điều kiện trục khuấy 150, 200 vịng/phút lượng khí thổi vào lít/phút Ở phần sản xuất vaccine cho thí nghiệm vi khuẩn sốc nhiệt 41oC thời gian 30 (dựa kết nội dung khác thuộc phạm vi nghiên cứu đề tài này) Đồ thị 11 Giá trị OD E ictaluri nuôi cấy nồi lên men với tốc độ khuấy 150 200 vịng/ phút mức lượng khí thổi vào lít/phút Đồ thị 12 Mật độ E ictaluri nuôi cấy nồi lên men với tốc độ khuấy 150 200 vịng/phút lượng khí thổi vào lít/phút TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THAÙNG 6/2014 117 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Kết tỷ lệ chết trình bày đồ thị 13 cho thấy tỷ lệ chết nghiệm thức với trục khuấy 200 vòng/phút, lượng khí thổi vào 6lít/ phút thời điểm thu mẫu 36, 39 trục khuấy 200 vòng/phút, lượng khí thổi vào thời điểm thu mẫu 39 có tỷ lệ chết 50% khác biệt đáng kể với nghiệm thức cịn lại (p