(Luận văn thạc sĩ) xác định một số đoạn mã vạch ADN cho một số loài trà hoa vàng ở vườn quốc gia tam đảo

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HOÀNG MINH TRANG XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐOẠN MÃ VẠCH ADN CHO MỘT SỐ LOÀI TRÀ HOA VÀNG Ở VƯỜN QUỐC GIA TAM ĐẢO LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HOÀNG MINH TRANG XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐOẠN MÃ VẠCH ADN CHO MỘT SỐ LOÀI TRÀ HOA VÀNG Ở VƯỜN QUỐC GIA TAM ĐẢO Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Hà Văn Huân PGS.TS Nguyễn Trung Thành Hà Nội – 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu tơi, hướng dẫn khoa học PGS.TS Hà Văn Huân PGS.TS Nguyễn Trung Thành Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài trung thực chưa cơng bố hình thức Luận văn sử dụng thông tin, số liệu từ báo nguồn tài liệu tác giả khác có trích dẫn thích nguồn gốc đầy đủ Nếu có gian lận tơi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm nội dung luận văn Học viên Hồng Minh Trang LỜI CẢM ƠN Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô giáo khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội trang bị kiến thức cho tơi suốt q trình học tập Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Hà Văn Huân – Viện CNSH Lâm nghiệp – Đại học Lâm nghiệp PGS.TS Nguyễn Trung Thành – Khoa Sinh học – Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN tận tình bảo hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu đề tài hoàn chỉnh Luận văn Thạc sĩ Xin cảm ơn đề tài nghiên cứu khoa học cấp Nhà nước “Xây dựng sở liệu mã vạch ADN (DNA barcode) cho số loài lâm nghiệp gỗ lớn, lâm sản ngồi gỗ có giá trị kinh tế” PGS TS Hà Văn Huân chủ nhiệm hỗ trợ phương diện để thực nghiên cứu Tôi xin cảm ơn cán Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp – Đại học Lâm nghiệp tạo điều kiện cho tơi hồn thành đề tài nghiên cứu Xin cảm ơn Ban Quản lý VQG Tam Đảo cho phép thu thập mẫu vật làm nguồn vật liệu cho đề tài, cảm ơn chuyên gia thực vật học Lê Thành Cương giúp thu thập nhận dạng loài Trà hoa vàng nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đồng nghiệp sát cánh hỗ trợ động viên vật chất tinh thần suốt trình học tập nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm Học viên Hoàng Minh Trang MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 Chương TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Trà hoa vàng Vườn Quốc gia Tam Đảo 1.1.1 Điều kiện tự nhiên đa dạng thực vật Vườn Quốc gia Tam Đảo .3 1.1.2 Lược sử nghiên cứu Trà hoa vàng VQG Tam Đảo 1.1.3 Đảo Đặc điểm hình thái phân bố số loài Trà hoa vàng VQG Tam 1.1.4 Trà hoa vàng giá trị sử dụng 1.2 Tổng quan mã vạch ADN 1.2.1 Giới thiệu mã vạch ADN (DNA barcode) 1.2.2 Một số đoạn mã vạch ADN sử dụng 12 1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả phân biệt mã vạch ADN thực vật 20 1.2.4 Ứng dụng mã vạch ADN 21 1.2.5 Một số nghiên cứu mã vạch ADN loài Trà 22 Chương VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .25 2.1 Vật liệu nghiên cứu 25 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 25 2.1.2 Nội dung nghiên cứu 25 2.2 Phương pháp nghiên cứu .26 2.2.1 Hóa chất, thiết bị dụng cụ 26 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 27 Chương KẾT QUẢ - THẢO LUẬN .29 3.1 Kết tách chiết ADN tổng số mẫu trà hoa vàng .29 3.2 Kết PCR đoạn mã vạch ADN 30 3.3 Giải trình tự phân tích trình tự đoạn mã vạch ADN 32 3.3.1 Kết giải trình tự 33 3.3.2 Khoảng cách di truyền loài 58 KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 64 Kết luận .64 Kiến nghị 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi sử dụng 26 Bảng 3.1 Mẫu vật nghiên cứu 29 Bảng 3.2 Nồng độ độ tinh mẫu ADN tổng số (pha loãng 10 lần) 30 Bảng 3.3 Đánh giá trình tự đoạn mã vạch thu 33 Bảng 3.4 So sánh trình tự đoạn matK lồi Trà hoa vàng 34 Bảng 3.5 So sánh trình tự matK lồi Trà hoa vàng nghiên cứu 36 Bảng 3.6 Mức độ tương đồng đoạn matK loài Trà nghiên cứu với số loài khác 37 Bảng 3.7 So sánh trình tự đoạn rbcL lồi Trà hoa vàng 39 Bảng 3.8 So sánh trình tự rbcL lồi Trà hoa vàng nghiên cứu 41 Bảng 3.9 Mức độ tương đồng đoạn rbcL loài Trà nghiên cứu với số loài khác 41 Bảng 3.10 So sánh trình tự đoạn trnH-psbA lồi Trà hoa vàng 44 Bảng 3.11 So sánh trình tự trnH-psbA loài Trà hoa vàng nghiên cứu 45 Bảng 3.12 Mức độ tương đồng đoạn trnH-psbA loài Trà nghiên cứu với số loài khác 46 Bảng 3.13 So sánh trình tự đoạn ycf1b loài Trà hoa vàng 49 Bảng 3.14 So sánh trình tự ycf1b loài Trà hoa vàng nghiên cứu .51 Bảng 3.15 Mức độ tương đồng đoạn ycf1b loài Trà nghiên cứu với số loài khác 51 Bảng 3.16 So sánh trình tự đoạn ITS2 loài Trà hoa vàng 54 Bảng 3.17 So sánh trình tự ITS2 loài Trà hoa vàng nghiên cứu .55 Bảng 3.18 Mức độ tương đồng đoạn ITS2 loài Trà nghiên cứu với số loài khác 55 Bảng 3.19 Khoảng cách di truyền đoạn mã vạch riêng rẽ kết hợp đoạn mã vạch 59 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hệ gen lục lạp số loài thuộc chi Camellia [94] 24 Hình 2.1 Chu trình nhiệt nhân đoạn mã vạch ADN 28 Hình 3.1 Kết điện di sản phẩm tách chiết ADN tổng số mẫu Trà hoa vàng 29 Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR đoạn mã vạch ADN 32 Hình 3.3 Cây phân loại sinh học xây dựng dựa trình tự đoạn gen matK 38 Hình 3.4 Cây phân loại sinh học xây dựng dựa trình tự đoạn gen rbcL 43 Hình 3.5 Cây phân loại sinh học xây dựng dựa trình tự đoạn trnH-psbA 48 Hình 3.6 Cây phân loại sinh học xây dựng dựa trình tự đoạn ycf1b .53 Hình 3.7 Cây phân loại sinh học xây dựng dựa trình tự đoạn ITS2 57 Hình 3.8 Khoảng cách di truyền đoạn mã vạch 58 Hình 3.9 Cây phân loại sinh học dựa kết hợp vài trình tự mã vạch 63 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Tên viết tắt DNA Tên đầy đủ Nghĩa tiếng Việt Deoxyribonucleic acid ADN bp Base pair Cặp base ITS Internal transcribed spacer Vùng đệm vùng phiên mã matK Maturase K Protein maturase K NCBI National Center for Biotechnology Information Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polimer hóa rbcL Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase large subunit Tiểu đơn vị lớn enzyme ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase RNA Ribonucleic acid ARN VQG Vườn Quốc gia Hoàng Minh Trang – K23 QH2014 MỞ ĐẦU Trà hoa vàng thuộc chi Trà Camellia (họ Theaceae, Ericales) có hoa màu vàng, phát lần Việt Nam vào năm đầu kỉ XX Cho đến nhà khoa học phát khoảng 30 lồi Trà hoa vàng, có 28 lồi tìm thấy Trung Quốc 24 lồi tìm thấy Việt Nam [2] Các lồi trà hoa vàng có giá trị lớn mặt dược liệu, biết đến với tác dụng kiềm chế sinh trưởng khối u, ngăn ngừa ung thư, giảm lượng cholesterol lipoprotein máu có nguyên tố vi lượng Germanium (Ge), Selenium (Se), Mangan (Mn)… Ngồi trà hoa vàng cịn có giá trị thẩm mỹ cao, trồng làm cảnh có hoa lớn màu vàng đặc trưng [5] Ở Việt Nam, Trà hoa vàng phát chủ yếu số địa phương VQG Tam Đảo (Vĩnh Phúc), VQG Cúc Phương (Ninh Bình), Phước Lộc (Lâm Đồng)… [21, 65, 67], VQG Tam Đảo phát loài với số loài đặc hữu Việt Nam Camellia tamdaoensis, Camellia crassiphylla, Camellia petelotii … [63, 65] Đây nguồn gen vô quý cho hệ thực vật Tam Đảo nói riêng Việt Nam nói chung, cần bảo vệ phân loại để đưa biện pháp thích hợp cho việc bảo tồn nguồn gen, đa dạng sinh học Tuy nhiên, Trà hoa vàng Tam Đảo bị đe dọa nghiêm trọng việc khai thác mức từ phía người dân, đồng thời việc bảo tồn nghiên cứu chưa ý nhiều [65] Cho đến nay, việc phân loại thực vật nói chung lồi thuộc chi Trà nói riêng chủ yếu dựa vào đặc điểm hình thái, cấu tạo giải phẫu bên [94] Việc phân loại số trường hợp gặp nhiều khó khăn số lồi Trà hoa vàng có đặc điểm hình thái tương đối giống Với phát triển sinh học phân tử công nghệ gen, phương pháp phân loại dựa kỹ thuật phân tích ADN nghiên cứu phát triển sử dụng đoạn mã vạch ADN đặc trưng cho loài (DNA barcode) [17] Phương pháp trở thành công cụ đắc lực cho nhà khoa học việc phát loài mới, phân loại, đánh giá đa dạng di truyền quan hệ di truyền loài Mỗi đoạn mã vạch ADN có đặc trưng riêng có khả phân ...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HOÀNG MINH TRANG XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐOẠN MÃ VẠCH ADN CHO MỘT SỐ LOÀI TRÀ HOA VÀNG Ở VƯỜN QUỐC GIA TAM ĐẢO Chuyên ngành:... ? ?Xác định số đoạn mã vạch ADN cho số loài Trà hoa vàng Vườn Quốc gia Tam Đảo? ?? với đối tượng phân tích năm vùng trình tự rbcL, matK, ycf1b, trnH – psbA ITS2 Kết thu đóng góp vào Ngân hàng gen Quốc. .. nghiên cứu Trà hoa vàng VQG Tam Đảo 1.1.3 Đảo Đặc điểm hình thái phân bố số loài Trà hoa vàng VQG Tam 1.1.4 Trà hoa vàng giá trị sử dụng 1.2 Tổng quan mã vạch ADN