(Luận văn thạc sĩ) biến đổi của gen MT CO1 ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ THỊ QUỲNH THƠ BIẾN ĐỔI CỦA GEN MT-CO1 TY THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ THỊ QUỲNH THƠ BIẾN ĐỔI CỦA GEN MT-CO1 TY THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Trịnh Hồng Thái XÁC NHẬN HỌC VIÊN ĐÃ CHỈNH SỬA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG Giáo viên hướng dẫn Chủ tịch hội đồng chấm luận văn thạc sĩ khoa học PGS.TS Trịnh Hồng Thái PGS.TS Nguyễn Quang Huy Hà Nội - 2017 LỜI CẢM ƠN Lời tơi xin chân thành bày tỏ lịng cảm ơn kính trọng sâu sắc PGS.TS Trịnh Hồng Thái ngƣời thầy quan tâm, bảo tận tình, hƣớng dẫn tơi suốt q trình thực hiên luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn ThS Phạm Thị Bích thầy giáo Khoa Sinh học Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt thầy cô giáo Bộ môn Sinh lý thực vật Hóa sinh tận tình giảng dạy, dìu dắt suốt thời gian học tập trƣờng Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới anh chị tận tình giúp đỡ bảo tơi suốt q trình học tập thực luận văn Phòng Proteomics Sinh học Cấu trúc thuộc Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghê Enzyme Protein, bạn học viên cao học em sinh viên làm việc phòng, giúp đỡ, chia sẻ khó khăn suốt q trình tơi học tập thực đề tài Con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Bố, Mẹ, ngƣời vất vả nuôi khôn lớn dạy học làm ngƣời Em cảm ơn anh chị, ngƣời thân ln dành tình cảm lời động viên em Cuối xin chân thành cảm ơn ngƣời bạn tôi, ngƣời ủng hộ giúp đỡ Hà Nội, ngày tháng Học viên cao học Lê Thị Quỳnh Thơ năm BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid deoxyribonucleic ADP Adenosine diphosphate APS Ammonium persulfate ATP Adenosine triphosphate ARN Acid ribonucleic (ARN) bp Base pair (cặp bazơ) BLAST Basic local alignment rearch tool cs Cộng ND NADH dehydrogenase EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EtBr Ethidium bromide HPLC Highperformance liquid chromatography (Sắc kí lỏng hiệu cao) NCBI Chromatography) National Center for Biotechnology Information MT-CO1 Cytochrome c oxidase subunit liquichchchrochromatography)chromatography)chromatography) MT-CO2 Cytochrome c oxidase subunit MtDNA Mitochondria DNA (ADN ty thể) PCR Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) RFLP Restriction fragment length polymorphism (đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn) ROS Reactive oxygen species (Các loại oxy phản ứng) rARN ribosome RNA (ARN ribosome) tARN transfer RNA (ARN vận chuyển) TNM Tumor Node Metastasis UTĐTT Ung thƣ đại trực tràng MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bệnh ung thƣ đại trực tràng 1.1.1 Tình trạng ung thƣ đại trực tràng giới Việt Nam 1.1.2 Ung thƣ đại trực tràng 1.1.3 Các yếu tố nguy ung thƣ đại trực tràng 1.1.4 Triệu trứng bệnh 1.1.5 Phân loại ung thƣ đại trực tràng theo mô học 1.1.6 Các thị sinh học ung thƣ đại trực tràng 1.2 Tổng quan ty thể ngƣời 1.2.1 Ty thể 1.2.2 Hệ gen ty thể 10 1.2.3 Biến đổi ADN ty thể ung thƣ đại trực tràng 12 1.3 Phức hệ cytochrome c oxidase gen MT-CO1 14 1.3.1 Phức hệ cytochrome c oxidase chuỗi hô hấp ty thể 14 1.3.2 Gen MT-CO1 protein ty thể 14 1.3.3 Biến đổi gen MT-CO1 với bệnh ung thƣ 15 1.3.4 Các phƣơng pháp phát biến đổi mtDNA 18 1.4 Tình hình nghiên cứu biến đổi gen ty thể gen MT-CO1ở Việt Nam 20 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tƣợng 22 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 22 2.1.2 Các hóa chất sử dụng 22 2.1.3 Thiết bị sử dụng nghiên cứu 23 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.2.1 Khuếch đại đoạn gen MT-CO1 ty thể phƣơng pháp PCR 24 2.2.2 Tinh sản phẩm PCR 26 2.2.3 Giải trình tự trực tiếp 26 2.2.4 Phân tích PCR-RFLP 26 2.2.5 Điện di sản phẩm PCR sản phẩm cắt enzyme giới hạn 28 2.2.6 Xác định mức độ dị tế bào chất phần mềm phân tích hình ảnh ImageJ 30 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Kết sàng lọc biến đổi gen MT-CO1 giải trình tự trực tiếp 31 3.1.1 Kết PCR từ cặp mồi 5851F-7595R 31 3.1.2 Các biến đổi gen MT-CO1 đƣợc xác định giải trình tự trực tiếp 31 3.2 Kết sàng lọc biến đổi C6340T, T6253C phƣơng pháp PCR-RFLP 35 3.2.1 Kết thiết kế mồi lựa chọn enzyme cắt giới hạn 35 3.2.2 Kết PCR-RFLP 36 3.2.3 Kết định lƣợng mức độ đột biến phần mềm ImageJ 38 3.3 Kết sàng lọc biến đổi C6340T mẫu máu ngƣời bình thƣờng vài mẫu máu ngƣời bệnh 40 KẾT LUẬN 44 KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHỤ LỤC DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Tỷ lệ mắc tử vong UTĐTT tổng số loại ung thƣ Hình 1.2 Hình ảnh vị trí đại tràng trực tràng ngƣời Hình 1.3 Cấu trúc ty thể Hình 1.4 Bản đồ hệ gen ty thể ngƣời 11 Hình 1.5 Dạng đồng tế bào chất dị tế bào chất ADN ty thể 11 Hình 1.6 Sơ đồ minh họa chế vận chuyển electron qua MT-CO1 15 Hình 2.1 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR từ cặp mồi 5851F-7595R 25 Hình 2.2 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR với cặp mồi 6221F-6381R 25 Hình 3.1 Ảnh điện di sản phẩm PCR với cặp mồi (5851F, 7595R) 31 Hình 3.2 Một số vị trí biến đổi gen MT-CO1 ty thể 32 Hình 3.3 Vị trí nhận biết enzyme 35 Hình 3.4 Kết điện di sản phẩm PCR-RFLP mẫu bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng vị trí 6340 36 Hình 3.5 Kết điện di thí nghiệm lần gel polyacrylamid 10% phân tích định lƣợng phần mềm ImageJ bệnh nhân biến đổi khơng hồn tồn vị trí 6340 38 Hình 3.6 Kết điện di thí nghiệm lần gel polyacrylamid 10% phân tích định lƣợng phần mềm Image J bệnh nhân biến đổi khơng hồn tồn vị trí 6340 39 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Bảng phân loại TNM UICC(2002) ung thƣ đại trực tràng Bảng 1.2 Phân loại giai đoạn phát triển ung thƣ đại trực tràng Bảng 1.3 Thống kê số biến đổi xảy gen MT-CO1 loại mô 16 Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng nghiên cứu 22 Bảng 2.2 Tên thiết bị sử dụng nghiên cứu 23 Bảng 2.3 Trình tự cặp mồi (5851F, 7595R) (6221F, 6381R) 24 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR 25 Bảng 2.5 Trình tự nhận biết enzym cắt giới hạn 27 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng cắt với enzyne BccI, TaaI 27 Bảng 2.7 Thành phần gel agarose 1% 1.5% 28 Bảng 2.8 Các thành phần cần sử dụng cho gel dày 0,75 mm, kích thƣớc 7cm 30 Bảng 3.1 Các vị trí biến đổi gen MT-CO1 ty thể 27 mẫu UTĐTT 33 Bảng 3.2 Kết xác định mức độ biến đổi C6340T đƣợc phân tích phần mềm ImageJ 40 MỞ ĐẦU Ung thƣ đại trực tràng (UTĐTT) loại ung thƣ biểu môphổ biến có tỷ lệ mắc tử vong caotrên tồn giới Việt Nam Ung thƣ đại trực tràng điều trị khỏi hẳn kéo dài thời gian sống bệnh nhân đƣợc phát chẩn đoán giai đoạn sớm Trên giới, hƣớng nghiên cứu tìm thị sinh học cho bệnh ung thƣ, có UTĐTT đƣợc quan tâm nhiều nhà khoa học Trong đó, nghiên cứu biến đổi ADN ty thể hƣớng có nhiều triển vọng tìm thị giúp hỗ trợ chẩn đoán sớm ung thƣ Do ADN ty thể khơng có protein histone bảo vệ, chế sửa chữa ADN hiệu tồn bào quan với phản ứng oxy hóa khử liên tục, ADN ty thể chịu tác động mạnh mẽ tác nhân gây đột biến so với ADN nhân Đến nay, 200 đột biến hệ gen ty thể ngƣời đƣợc phát hiện, gây triệu trứng bệnh khác nhau, chủ yếu tập trung vào cơ, thần kinh, khả chuyển hóa bệnh ung thƣ Trên giới, có nhiều cơng trình nghiên cứu đột biến ADN ty thể liên quan đến bệnh khác có bệnh ung thƣ Tuy nhiên, Việt Nam hƣớng nghiên cứu mẻ, số liệu cơng bố chƣa nhiều Do đó, tiến hành thực đề tài: “Biến đổi gen MT-CO1 ty thể bệnh nhân ung thư đại trực tràng” nhằm mục tiêu: - Đánh giá tình trạng biến đổi gen MT-CO1 thuộc ADN ty thể bệnh nhân UTĐTT - Xác định đƣợcmức độ dị tế bào chất gen MT-CO1đối với sốmẫu môcủa bệnh nhân UTĐTT Đề tài đƣợc hỗ trợ từ nguồn kinh phí đề tài QG.15.05 đƣợc thực phịng Proteomics Sinh học Cấu trúc thuộc Phịng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bệnh ung thƣ đại trực tràng 1.1.1 Tình trạng ung thƣ đại trực tràng giới Việt Nam UTĐTT bệnh ung thƣ phổ biến giới gặp nhiều nƣớc phát triển Theo thống kê năm 2012 Globocan, UTĐTT đứng thứ tỷ lệ mắc (9,7%) thứ tỷ lệ tử vong (8,5%) ung thƣ (Hình 1.1) Tỷ lệ mắc bệnh giới có khác biệt lớn vị trí địa lý khu vực địa lý khác biệt theo giới tính, tỷ lệ mắc bệnh cao Úc/ New Zealand (ASR 44,8 nam 32,2 nữ 100.000) thấp Tây Phi (4,5 nam 3,8 nữ 100.000) trƣờng hợp đƣợc chẩn đoán ung thƣ Ở Mỹ, UTĐTT đứng thứ tỷ lệ mắc thứ tỷ lệ tử vong ung thƣ Hàng năm, giới có khoảng 1,3 triệu ca mắc 600.000 ca tử vong[53] Hình 1.1 Tỷ lệ mắc tử vong UTĐTT tổng số loại ung thƣ [53] Ở Việt Nam, UTĐTT đứng thứ sau ung thƣ dày, phổi, vú, vòm họng xu hƣớng ngày tăng Theo liệu thống kê Glocbocan năm 2012, UTĐTT đứng thứ nam giới, hàng năm có khoảng 4561 ca mắc mới, chiếm 6,5% tỉ lệ mắc ung thƣ; nữ giới UTĐTT đứng thứ 6, khoảng 4207 ca mắc mới, chiếm 7,7% tổng số ngƣời mắc nữ giới[53] 50 Wang X (2001), “The expanding role of mitochondria in apoptosis”, Genes & development, 15(22), pp.2922-2933 51 Warburg O (1956), “On respiratory impairment in cancer cells”, Science, 124(3215), pp.269-70 52 Wikström M (2004), “Cytochrome c oxidase: 25 years of the elusive proton pump”, Biochimica et biophysica acta, 1655, pp.241-247 Tài liệu web 53 http://globocan.iarc.fr/ 54 https://www.cancer.org/cancer/ (07/10/2017) 55 http://www.fvhospital.com/(07/10/2016) 56 https://www.cancer.org/cancer/(07/10/2017) 57 https://www.britannica.com/science/mitochondrion (26/10/2017) 58 http://www.uniprot.org/uniprot/P00395(10/2017) 59 https//www.mitomap.org (07/2017) 52 PHỤ LỤC Phụ lục Danh sách mẫu bệnh nhân UTĐTT đƣợc phân tích PCR với cặp mồi 5851F-7595R giải trình tự trực tiếp Kích Mã Họ tên số Tuổi Kích Giới Vị trí thƣớc Số thƣớc tính khối u u hạch hạch (cm) 8619 Nguyễn Tiến Ƣ 60 Nam ĐT 4*5 3089 Lê Thị M 80 Nữ TT 3*2 3753 Hoàng Thị T 54 Nữ ĐT 5*3 3905 Nguyễn Thị T 80 Nữ TT 4120 Đỗ Thị V 51 Nữ TT 4833 Nguyễn Thị P 59 Nữ ĐT (cm) 0,5 Loại mô Giai bệnh đoạn học TNM Mức độ biệt hóa UTBMT T3N1M0 Mã giải trình tự DB196 UTBMT T3N0M0 Vừa UTBMT T2N0M0 Vừa 4*3 UTBMT T3N0M0 Vừa DB192 UTBMT T3N0M0 Vừa DB193 UTBMT T3N0M0 Rõ DB194 DB176 DB175, DB190 18768 Lê Thu H 63 Nữ TT 3*3,5 UTBMT T2N0M0 Vừa DB225 17401 Nguyễn Duy V 54 Nam ĐT 4*6 UTBMT T2N1M0 Rõ DB224 40 Nam TT 2*2,5 UTBMT T1N1M0 Vừa DB223 19563 Nguyễn Văn C 59 Nam ĐT 5*6 UTBMT T2N0M0 Kém DB195 19561 Bùi Thị H 61 Nữ ĐTT 3*3,5 UTBMT T2N1M0 Vừa DB226 36473 Hoàng Thị M 42 Nữ TT 3(1) UTBMT T3N1M0 Vừa DB197 36474 Nguyễn Thị H 60 36924 Nguyễn Văn D 37047 Đăng Thúy T 17180 37158 Nguyễn Xuân H Chứ Thị Tuyết M 0,5 Nữ TT 2,5 2(1) 0,5 53 Nam ĐT lên 0,5 65 Nữ TT thấp Nữ TT thấp 3(1) 0,5 2(2) 0,5 39 37456 Trần Văn T 39 Nam ĐT góc lách 3,5 38432 Hà Thị T 71 Nữ ĐT Sigma UTBMT T3N1M0 DT163, Vừa DB164 UTBMT T2N0M0 Vừa DB165 UTBMT T2N0M0 Vừa DB198 UTBMT T3N1M0 Vừa DB227 UTBMT T3N1M0 Kém DB228 UTBMT T3N0M0 Vừa DB199 38784 Nguyễn Thị C 39931 Nguyễn Xuân S 40102 Mai Trọng H 43 53 60 40103 Lại Thị N Nữ ĐT 16