(Luận văn thạc sĩ) đánh giá tác động chống tăng glucose máu và lipid máu invivo của dịch chiết quả lựu (punica granatum linn fruits)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ici n ea nd HỒ THỊ HẰNG Ph arm ac y, VN U KHOA Y DƯỢC ed ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG TĂNG M GLUCOSE MÁU VÀ LIPID MÁU of IN VIVO CỦA DỊCH CHIẾT QUẢ LỰU @ Sc ho ol (PUNICA GRANATUM LINN.FRUITS) Co py rig ht KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI Ph arm ac y, VN U KHOA Y DƯỢC nd Người thực hiện: HỒ THỊ HẰNG ici n ea ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG TĂNG GLUCOSE MÁU VÀ LIPID MÁU M ed IN VIVO CỦA DỊCH CHIẾT QUẢ LỰU of (PUNICA GRANATUM LINN.FRUITS) ho ol KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Sc (NGÀNH DƯỢC HỌC) @ Khóa: QH.2014.Y Ths Đặng Kim Thu Co py rig ht Người hướng dẫn: PGS.TS Bùi Thanh Tùng Hà Nội - 2019 LỜI CẢM ƠN arm ac y, VN U Để hồn thành khóa luận này, tơi xin bày tỏ kính trọng lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Bùi Thanh Tùng, Ths Đặng Kim Thu giảng viên môn Dược lý, Dược lâm sàng - Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, giao đề tài hướng dẫn từ ngày đầu bước đường nghiên cứu khoa học tơi hồn thành đề tài nghiên cứu Các thầy, cô không trang bị cho tơi kiến thức, mà cịn truyền cho tơi niềm đam mê, lịng nhiệt huyết với nghề ln sẵn sàng giúp đỡ tơi gặp khó khăn ea nd Ph Tôi xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo môn Dược lý - Dược lâm sàng, mơn Hóa dược hết lịng quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện cho thực nghiên cứu hồn thành khóa luận ici n Tơi xin gửi lời cảm ơn đến Ban chủ nhiệm Khoa toàn thể thầy, cô giáo Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội cho kiến thức quý báu trình học tập nhà trường M ed Chúng trân trọng cảm ơn tài trợ kinh phí Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Châu Á, Đại học Quốc gia Hà Nội cho đề tài mã số CA.18.10A PGS.TS Bùi Thanh Tùng chủ trì để thực nghiên cứu Co py rig ht @ Sc ho ol of Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân bạn bè, người ln quan tâm, chăm sóc, động viên tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 30 tháng năm 2019 Sinh viên Hồ Thị Hằng MỤC LỤC VN U MỞ ĐẦU Chương - TỔNG QUAN arm ac y, 1.1 Đái tháo đường 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Dịch tễ 1.1.3 Phân loại 1.1.4 Cơ chế bệnh sinh 1.1.5 Các mơ hình gây ĐTĐ thực nghiệm of M ed ici n ea nd Ph 1.2 Tổng quan lựu 1.2.1 Tên gọi 1.2.2 Đặc điểm thực vật 1.2.3 Phân bố, sinh thái 10 1.2.4 Thành phần hóa học 10 1.2.5 Hoạt tính sinh học 12 1.2.5.1 Tác dụng chống oxy hóa 12 1.2.5.2 Tác dụng vi sinh 13 1.2.5.3 Tác dụng chống viêm 13 1.2.5.4 Tác dụng chống ung thư 14 1.2.5.5 Tác dụng tim mạch 14 1.2.5.6 Tác dụng bệnh tiểu đường 15 1.2.5.7 Tác dụng bệnh béo phì 16 1.2.5.8 Độc tính lựu 16 Chương - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 ho ol 2.1 Đối tượng nghiên cứu 17 2.1.1 Mẫu thực vật 17 2.2.2 Động vật thí nghiệm 17 @ Sc 2.2 Dụng cụ hóa chất 17 2.2.1 Dụng cụ 17 2.2.2 Hóa chất 17 Co py rig ht 2.3 Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1 Phương pháp đánh giá tác dụng chống tăng glucose máu lipid máu 18 2.3.1.1 Tạo mơ hình chuột béo phì 18 2.3.1.2 Gây ĐTĐ typ từ chuột béo phì thực nghiệm Streptozocin (STZ) 19 2.3.1.3 Phân lơ chuột thí nghiệm 19 2.3.1.4 Tiến hành thí nghiệm 20 2.3.1.5 Theo dõi thí nghiệm 20 VN U 2.3.1.6 Tiến hành lấy mẫu thử nghiệm sau kết thúc đợt thí nghiệm 20 2.3.2 Phương pháp xác định số số hóa sinh máu 20 2.3.2.1 Định lượng Glucose máu theo giai đoạn thực nghiệm 20 2.3.2.2 Định lượng Cholesterol huyết 21 Chương - KẾT QUẢ 23 arm ac y, 3.1 Kết gây mơ hình béo phì thực nghiệm 23 3.2 Kết đánh giá tác dụng dịch chiết lựu lên trọng lượng chuột 25 3.3 Kết đánh giá tác dụng dịch chiết lựu lên số số hóa sinh máu chuột ĐTĐ typ thực nghiệm 27 Ph Chương - BÀN LUẬN 30 Co py rig ht @ Sc ho ol of M ed ici n ea nd KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 33 VN U DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Đái tháo đường ADA Hiệp hội đái tháo đường Hoa Kỳ (American Diabetes Association ) STZ Streptozocin PE Chiết xuất vỏ (Peel extract) SE Chiết xuất hạt (Seed extract) HDL Lipoprotein tỉ trọng cao (High Density Lipoprotein) LDL Lipoprotein tỉ trọng thấp (Low Density Lipoprotein) IDF Liên đoàn Đái tháo đường Thế giới (International Diabetes Federation ) Ph nd ea ici n ed M of ol ho Sc @ ht rig py Co arm ac y, ĐTĐ VN U DANH MỤC CÁC BẢNG Co py rig ht @ Sc ho ol of M ed ici n ea nd Ph arm ac y, Bảng 3.1 Thể trọng chuột sau 28 ngày ni theo mơ hình gây béo thực nghiệm 23 Bảng 3.2 Nồng độ glucose máu nhóm chuột sau 10 ngày tiêm STZ 24 Bảng 3.3 Thể trọng chuột trước sau 21 ngày điều trị hai nồng độ khác dịch chiết lựu 26 Bảng 3.4 Ảnh hưởng dịch chiết lựu lên nồng độ glucose máu 27 Bảng 3.5 Ảnh hướng dịch chiết lựu số lipid máu 29 VN U DANH MỤC CÁC HÌNH Co py rig ht @ Sc ho ol of M ed ici n ea nd Ph arm ac y, Hình 1.1 Cấu trúc hóa học streptozocin Hình 1.2 Cấu trúc hóa học alloxan Hình 1.3 Quả lựu (Punica granatum Linn.Fruits) Hình 1.4 Cấu trúc phân tử punicalagin 10 Hình 1.5 Cấu trúc phân tử delphinidin 3,5 - diglucoside cyanidin 3,5 diglucoside 11 Hình 1.6 Cấu trúc phân tử axit punicic 11 Hình 2.1 Sơ đồ phương pháp nghiên cứu 18 Hình 3.1 Thể trọng chuột sau 28 ngày ni theo mơ hình gây béo thực nghiệm 24 Hình 3.2 Thể trọng chuột sau 28 ngày ni theo mơ hình gây béo thực nghiệm 25 Hình 3.3 Thể trọng chuột trước sau 21 ngày điều trị hai nồng độ khác dịch chiết lựu 27 Hình 3.4 Ảnh hưởng dịch chiết lựu lên nồng độ glucose máu 28 MỞ ĐẦU ea nd Ph arm ac y, VN U Theo tổ chức y tế giới (WHO), béo phì vấn đề sức khỏe cộng đồng thường gặp không trọng ngày gia tăng theo mức độ đáng báo động Từ năm 1980, tỷ lệ béo phì tồn giới gia tăng gấp hai lần, tăng từ 4,7% lên 8,5% người lớn dự đoán đến năm 2030 có 470 triệu người mắc bệnh [55] Tại Việt Nam, kết nghiên cứu Viện dinh dưỡng Quốc gia năm 2007 báo cáo tỷ lệ thừa cân/béo phì (tính theo số khối thể) lên tới 16,3% với đối tượng tuổi từ 25 đến 64 tuổi tiếp tục tăng Đây dấu hiệu cảnh báo gia tăng bệnh mạn tính khơng lây nhiễm cộng đồng, gây nên biến chứng sức khỏe nghiêm trọng bệnh tim mạch, mỡ máu, đột quỵ bệnh rối loạn chuyển hóa đặc biệt bệnh ĐTĐ M ed ici n Đái tháo đường hội chứng lâm sàng đặc trưng tình trạng tăng nồng độ glucose máu thiếu hụt insulin tế bào Trên toàn giới, ĐTĐ ngày gia tăng tỷ lệ mức độ ảnh hưởng đến vấn đề sức khỏe khác Mặc dù có tiến đáng kể điều trị bệnh ĐTĐ thuốc đường uống, việc tìm kiếm loại thuốc tiếp tục hạn chế tác dụng bất lợi chi phí điều trị [60] @ Sc ho ol of Sử dụng thuốc điều trị bệnh tiểu đường phổ biến nước phát triển, chi phí loại thuốc thơng thường gánh nặng kinh tế người dân [24] Tại Việt Nam, nhiều nghiên cứu tiến hành để đánh giá tiềm điều trị bệnh ĐTĐ thuốc cho kết khả quan như: Thân Ý dĩ, thân Mướp đắng, Chuối hột [3, 4, 7] Co py rig ht Lựu biết đến không loại ăn trồng nhiều nước ta mà loại dược liệu sử dụng nhiều Y học cổ truyền Trên giới có nhiều nghiên cứu đánh giá tác dụng chống tăng glucose máu lipid máu từ thành phần lựu Tuy nhiên Việt Nam, chưa tìm thấy nghiên cứu đánh giá tác dụng sinh học lựu Để góp phần cung cấp sở cho việc sử dụng phát triển sản phẩm từ lựu, đề tài “Đánh giá tác dụng chống tăng glucose máu lipid máu in vivo VN U dịch chiết lựu (Punica granatum Linn.fruits)” thực nhằm mục tiêu sau:  Xây dựng mơ hình chuột bị ĐTĐ typ chuột béo phì Co py rig ht @ Sc ho ol of M ed ici n ea nd Ph arm ac y,  Đánh giá tác dụng chống tăng glucose máu lipid máu cao chiết ethanol lựu mơ hình chuột ĐTĐ typ 2 7,32 ± 1,22 16,22 ± 1,56 ↑ 6,09% ↑ 141,37% 20 16,22 15 10 7,32 6,72 Ph 6,9 nd Nhóm ni thường Nhóm ni béo D 10 ici n D0 ea Nồng độ glucose máu (mmol/L) Thay đổi (%) ↑ 53,87% VN U Sau tiêm 10 ngày ↓ 1,74% arm ac y, Thay đổi (%) M ed Hình 3.2 Thể trọng chuột sau 28 ngày ni theo mơ hình gây béo thực nghiệm ho ol of Nhận xét: Nồng độ glucose máu thời điểm nghiên cứu nhóm ni thường khơng có khác biệt đáng kể so với trước nghiên cứu (p>0,05) Sau tiêm STZ ngày, nồng độ glucose máu nhóm chuột ni béo tăng 53,87% so với ban đầu sau 10 ngày tiêm, nồng độ glucose máu tăng cao rõ rệt lên đến 141,37% so với ban đầu Sc 3.2 Kết đánh giá tác dụng dịch chiết lựu lên trọng lượng chuột rig ht @ Để tiến hành nghiên cứu tác dụng dịch chiết lựu lên trọng lượng mơ hình chuột ĐTĐ typ thực nghiệm, chuột ĐTĐ typ điều trị 21 ngày cách cho chuột uống cao pha nước cất dịch chiết lựu vào buổi sáng Co py Trọng lượng chuột vào ngày 0, 5, 10, 15, 21 thể Bảng 3.3 25 VN U arm ac y, Ngày (g) 33,35±1,35 34,2±1 15 (g) 21 (g) Thay đổi (%) 37,4±0,4 ↑ 12,14 49,4±1,3# ↑ 16,1 43,05±0,95 43,1±1,8* ↓ 5,48 10 (g) 35,35±0,55 36,15±0,35 nd Chứng sinh lý Chứng tiểu đường (g) Ph Bảng 3.3 Thể trọng chuột trước sau 21 ngày điều trị hai nồng độ khác dịch chiết lựu ici n ea 42,55±1,45 45,15±1,65 46,05±2,05 48,1±1,3 45,6±1,2 45,05±1,55 43,6±0,8 150 mg/kg 44,6±1,7 45,3±1,5 43,6±1,5 43,8±0,6 43,2±0,3* ↓ 3,14 300 mg/kg 45,1±1,2 44,35±0,55 43,1±0,3 43±1,4 43,2±1,2* ↓ 4,21 ol of M ed Gliclazid ho *Khác biệt có ý nghĩa so với nhóm 2; # Khác biệt có ý nghĩa so với nhóm @ Trọng lượng (g) 50 Sc 60 40 49,4 45,6 42,55 43,1 44,6 43,2 45,1 Nhóm Nhóm Nhóm 43,2 37,4 33,35 Co py rig ht 30 20 10 Nhóm Nhóm D0 26 D 21 VN U Hình 3.3 Thể trọng chuột trước sau 21 ngày điều trị hai nồng độ khác dịch chiết lựu D 0: cân nặng chuột trước ngày điều trị arm ac y, D 21: cân nặng chuột sau 21 ngày điều trị ed ici n ea nd Ph Nhận xét: Từ số liệu Bảng 3.3 Hình 3.3 nhận thấy sau 21 ngày điều trị, nhóm chứng sinh lý nhóm chứng tiểu đường khơng điều trị cho uống nước khơng cho uống dịch chiết khối lượng chuột tăng dần đặc biệt nhóm chứng tiểu đường tăng 16,1% cịn nhóm chứng sinh lý tăng 12,14% Trong nhóm chuột điều trị gliclazid lượng cao chiết khác dịch chiết lựu khối lượng thể chuột giảm Mức độ giảm mạnh nhóm chuột cho uống gliclazid giảm 5,48%; tiếp đến nhóm cho uống dịch chiết cao ethanol liều 300 mg/kg (4,21%) cuối nhóm điều trị dịch chiết cao ethanol liều 150 mg/kg (3,14%) Mức độ giảm thể trọng nhóm chuột cho uống cao chiết khơng tuyến tính Từ kết kết luận dịch chiết lựu có tác dụng kìm hãm cân nặng chuột of M 3.3 Kết đánh giá tác dụng dịch chiết lựu lên số số hóa sinh máu chuột ĐTĐ typ thực nghiệm 3.3.2 Nồng độ Glucose máu chuột ĐTĐ typ ho ol Trong 21 ngày cho uống dịch chiết, chuột lấy máu đuôi vào ngày 0, 5, 10, 15, 21 để xác định nồng độ glucose máu Sc Bảng 3.4 Ảnh hưởng dịch chiết lựu lên nồng độ glucose máu (mmol/L) 10 (mmol/L) 15 (mmol/L) 21 (mmol/L) Thay đổi (%) 6,75±1,25 7,25±2,14 6,6±2,19 6,7±1,58 6,85±1,377 ↑ 1,48 16,6±3,28 16,8±3,14 17,1±2,69 16,9±3,24 17,2±2,34# ↑ 3,61 Gliclazid 16,1±2,67 15,8±2,51 16,28±2,69 15,72±3,81 13,65±3,69* ↓ 15,22 15,41±2,87 13,6±3,19 14,51±2,14 13,53±3,16* ↓ 14,37 (mmol/L) @ Ngày Co py rig ht Chứng sinh lý Chứng tiểu đường 150 mg/kg 15,8±3,64 27 15,6±2,57 15,36±2,34 13,26±2,39 12,88±3,27 11,4±3,12* ↓ 26,9 VN U 300 mg/kg arm ac y, 25 16,617,2 20 15,8 16,1 13,65 13,53 11,40 Ph 15 6,75 6,85 nd 10 15,6 ea Nhóm Nhóm Nhóm Nhóm Nhóm ici n Nồng độ glucose máu (mmol/L) *Khác biệt có ý nghĩa so với nhóm 2; # Khác biệt có ý nghĩa so với nhóm D0 D 21 M ed Hình 3.4 Chỉ số glucose máu nhóm chuột trước sau điều trị 21 ngày @ Sc ho ol of Nhận xét: Từ số liệu Bảng 3.4 Hình 3.4 cho thấy, nhóm chứng sinh lý có nồng độ glucose máu tăng nhẹ ổn định mức bình thường, nhóm chuột tiểu đường tăng nhẹ mức nồng độ glucose máu cao Tất nhóm chuột điều trị gliclazid hai liều khác cao chiết ethanol lựu giảm nồng độ glucose máu, nhóm điều trị gliclazid giảm nhiều (17,79%), tiếp đến nhóm điều trị cao chiết ethanol liều 300 mg/kg (9,35%) cuối liều 150 mg/kg (5,04%) ht 3.3.1 Ảnh hưởng dịch chiết lựu tình trạng tăng lipid máu Co py rig Tiến hành đánh giá thay đổi số tiêu hóa sinh máu chuột sau điều trị, so sánh biến đổi số cholesterol tổng, triglycerid, HDL cholesterol, LDL cholesterol với nhóm chuột ăn thức ăn bình thường (nhóm chứng sinh lý) nhóm chuột ăn thức ăn có hàm lượng chất béo cao (nhóm chứng tiểu đường) 28 Bảng 3.5 Ảnh hướng dịch chiết lựu số lipid máu HDLc (mmol/L) 34,45±2,31 Chứng tiểu đường 78,69±5,3# 98,34±5,17# 23,12±3,18# Gliclazid 150 mg/kg 300 mg/kg 36,48±5,73* 56,88±6,36* 46,39±4,35* 38,45±8,35* 62,14±8,39* 48,76±7,21* 36,31±4,21* 26,12±2,47* 32,47±5,36* Chứng sinh lý LDLc (mmol/L) 12,36±2,14 VN U Triglycerid (mmol/L) 56,23±4,36 37,21±2,35# arm ac y, Cholesterol tổng (mmol/L) 43,78±7,54 15,35±2,39* 26,14±2,37* 19,36±2,41* Ph *Khác biệt có ý nghĩa so với nhóm 2; # Khác biệt có ý nghĩa so với nhóm ol of M ed ici n ea nd Nhận xét: Sau 21 ngày điều trị, hàm lượng cholesterol tổng, triglycerid LDL cholesterol máu chuột nhóm điều trị gliclazid cao chiết lựu giảm so với nhóm khơng điều trị Nhóm chuột điều trị gliclazid giảm cholesterol tổng 53,64% so với nhóm chứng tiểu đường, nhóm điều trị cao chiết lựu liều 150 mg/kg, 300 mg/kg giảm 27,72% 41,05%, thay đổi có ý nghĩa thống kê Cao chiết lựu liều 150 mg/kg làm giảm số triglycerid 36,81% giảm LDL cholesterol 29,75% so với nhóm chứng tiểu đường Cao chiết liều 300 mg/kg giúp giảm số triglycerid 50,42% giảm LDL cholesterol 47,97% so với nhóm chứng tiểu đường Như cao chiết lựu liều 300 mg/kg giúp giảm cholesterol tổng, triglycerid, LDL cholesterol tốt so với liều 150 mg/kg Co py rig ht @ Sc ho HDL cholesterol lipoprotein có vai trị quan trọng việc vận chuyển cholesterol khỏi máu ngăn không cho chúng xâm nhập vào thành động mạch giúp làm giảm nguy mắc bệnh tim mạch Do đó, việc nâng hàm lượng HDL cholesterol máu có ý nghĩa quan trọng với thể người Trong nghiên cứu này, cao chiết lựu 150 mg/kg có tác dụng làm tăng 11,49% liều 300 mg/kg làm tăng 28,8% HDL cholesterol so với nhóm chứng tiểu đường 29 Chương - BÀN LUẬN ht @ Sc ho ol of M ed ici n ea nd Ph arm ac y, VN U Bệnh ĐTĐ typ đặc trưng đề kháng insulin suy giảm chức tiết insulin tế bào β đảo tụy Dựa sở này, nhiều mơ hình ĐTĐ thực nghiệm xây dựng theo xu hướng tạo đề kháng với insulin và/hoặc làm suy giảm chức tế bào β đảo tụy Nhu cầu xây dựng mơ hình lớn việc phát hiện, nghiên cứu đánh giá tác dụng thuốc điều trị ĐTĐ có nguồn gốc từ thiên nhiên trở thành xu hướng ngày trọng phát triển Có thể gây ĐTĐ typ nhiều phương pháp Mỗi mơ hình có ưu, nhược điểm riêng việc gây ĐTĐ typ ứng dụng thực nghiệm Nhằm đánh giá tác dụng chống tăng glucose máu lipid máu chuột bị ĐTĐ typ 2, mơ hình kết hợp chế độ ăn giàu chất béo sử dụng hóa chất STZ liều 120 mg/kg thể trọng chuột lựa chọn Béo phì đóng vai trị quan trọng gây nên tình trạng kháng insulin Dựa sở mơ hình nghiên cứu này, chuột nuôi với chế độ ăn giàu chất béo nhằm gây nên tình trạng béo phì để làm tăng khả kháng insulin Sự tổn thương tế bào β đảo tụy làm giảm tiết insulin chế thiếu bệnh sinh ĐTĐ typ cần kết hợp với tiêm STZ sau nuôi béo để gây tổn thương đảo tụy đề kháng insulin, gây ĐTĐ typ STZ kháng sinh tổng hợp gây tổn thương tế bào β sử dụng nhiều mơ hình gây ĐTĐ Có nhiều nghiên cứu sử dụng STZ với mức liều khác qua nghiên cứu thể mức liều khác làm tổn thương tế bào β nhiều hay Từ nhiều nghiên cứu tác giả nước, liều 120 mg/kg lựa chọn nghiên cứu kết hợp với chế độ ăn giàu chất béo để gây ĐTĐ typ chuột nhắt trắng Mơ hình đảm bảo dựa chế bệnh sinh ĐTĐ typ với chi phí thấp, dễ thực hữu ích mơ hình đánh giá tiền lâm sàng với thuốc có tiềm điều trị ĐTĐ Co py rig Trong mơ hình nghiên cứu này, ngồi việc so sánh với nhóm chứng sinh lý nhóm chứng tiểu đường cho uống nước cất, sử dụng gliclazid làm thuốc đối chứng dương Gliclazid thuộc hệ thứ hai nhóm sulfonylure sử dụng để điều trị ĐTĐ, kích thích tế bào β sản xuất insulin làm giảm nồng độ glucose máu, sử dụng cho bệnh nhân bị ĐTĐ không phụ thuộc insulin 30 ho ol of M ed ici n ea nd Ph arm ac y, VN U Kết thực nghiệm cho thấy: chuột nhắt trắng bị gây ĐTĐ typ 2, sau 21 ngày uống cao chiết lựu liều 150 mg/kg 300 mg/kg gây giảm nồng độ glucose máu 14,37% 26,9 % so với nhóm chứng bệnh, khác biệt có ý nghĩa thống kê với p