Nhan đề : Ứng dụng chỉ thị phân tử Indel và kỹ thuật PCR định lượng để đánh giá hiệu quả ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài tại Viện huyết học truyền máu trung ương Tác giả : Trần Thanh Hiền Người hướng dẫn: Trương Quốc Phong Dương Quốc Chính Từ khoá : Viện huyết học truyền máu trung ương; Tế bào gốc; Tế bào gốc tạo máu; Kỹ thuật PCR Năm xuất bản : 2019 Nhà xuất bản : Trường đại học Bách Khoa Hà Nội Tóm tắt : Tổng quan về tế bào gốc, ghép tế bào gốc, tế bào gốc tạo máu và nguồn tế bào gốc tạo máu; đối tượng và phương pháp nghiên cứu; kết quả nghiên cứu.
TRẦN THANH HIỀN BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - Trần Thanh Hiền CÔNG NGHỆ SINH HỌC ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ INDEL VÀ KỸ THUẬT PCR ĐỊNH LƯỢNG ĐỂ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ GHÉP TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU ĐỒNG LOÀI TẠI VIỆN HUYẾT HỌC – TRUYỀN MÁU TRUNG ƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Trần Thanh Hiền ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ INDEL VÀ KỸ THUẬT PCR ĐỊNH LƯỢNG ĐỂ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ GHÉP TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU ĐỒNG LOÀI TẠI VIỆN HUYẾT HỌC – TRUYỀN MÁU TRUNG ƯƠNG Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : TS Dương Quốc Chính PGS TS Trương Quốc Phong Hà Nội – 2019 LỜI CẢM ƠN Truớc hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Dương Quốc Chính - Trưởng khoa Di truyền Sinh học phân tử, Viện Huyết học – Truyền máu TW, người thầy trực tiếp hướ ng dẫn, tận tình bảo tạo điều kiện tốt cho tơi hồn thành khóa luận Tôi xin gửi lời cảm on chân thành sâu sắc dến PGS.TS Trương Quốc Phong – Trưởng PTN Proteomics, Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, người thầy định hướng cho lời khuyên quý báu suốt thời gian thực nghiên cứu Tơi xin cảm ơn tồn thể anh chị Khoa Di truyền Sinh học Phân tử, Viện Huyết học – Truyền máu TW bảo để tơi hồn thành khóa luận cách tốt Đồng thời, xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Huyết học – Truyền máu TW tạo điều kiện cho tơi q trình thực nghiên cứu đơn vị Xin chân thành gửi lời cảm ơn tới thầy, cô giáo môn Di truyền thầy cô giáo Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội hết lòng giảng dạy kiến thức khoa học cho trình học tập nghiên cứu trường Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè, nguời bên, động viên khích lệ tơi suốt q trình học tập thực khóa luận Hà Nội, ngày 30 tháng năm 2019 SINH VIÊN Trần Thanh Hiền MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan ghép tế bào gốc .3 1.1.1 Tế bào gốc 1.1.1.1 Tế bào gốc gì? 1.1.1.2 Quá trình phát triển tế bào gốc 1.1.1.3 Phân loại tế bào gốc 1.1.2 Lịch sử ngành ghép TBG 1.1.3 Phân loại ghép tế bào gốc theo nguồn hiến .8 1.1.4 Tế bào gốc tạo máu nguồn tế bào gốc tạo máu 1.1.4.1 Tế bào gốc tạo máu 1.1.4.2 Nguồn tế bào gốc tạo máu 13 1.1.5 Phác đồ điều kiện hóa 14 1.1.6 Chỉ định ghép TBG đồng loại 15 1.1.7 Các bước kỹ thuật ghép TBG đồng loại .15 1.1.8 Các phương pháp ghép tế bào gốc tạo máu 17 1.1.9 Tầm quan trọng hệ miễn dịch HLA ghép tế bào gốc tạo máu 18 1.2 Tổng quan bệnh nhân ghép TBG 19 1.3 Tổng quan người hiến tế bào gốc 20 1.4 Quá trình điều trị diễn biến bệnh nhân ghép tế bào gốc (HSCT) .21 1.5 Bệnh ghép chống chủ .21 1.5.1 Bệnh ghép chống chủ cấp [3] 22 1.5.2 Bệnh ghép chống chủ mạn 22 1.6 Mọc mảnh ghép 23 1.6.1 Tiêu chuẩn mọc mảnh ghép 23 1.6.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến mọc mảnh ghép 23 1.6.3 Các xét nghiệm đánh giá mọc mảnh ghép 24 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Đối tượng nghiên cứu 25 2.2 Phương pháp nghiên cứu .25 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu .25 2.2.2 Chỉ tiêu nghiên cứu .25 2.3 Vật liệu nghiên cứu 25 2.3 Quy trình thực 26 2.3.1 Chuẩn bị mẫu 26 2.3.1.1 Chuẩn bị mẫu trước ghép 26 2.3.1.2 Chuẩn bị mẫu theo dõi đánh giá thể khảm sau ghép 26 2.3.2 Tìm kiếm thị Indel mang thơng tin 27 2.3.3 Phân tích thể khảm DNA dựa thị Indel mang thông tin .27 2.3.4 Sơ đồ nghiên cứu 30 2.3.5 Thu thập, xử lý liệu phân tích kết 31 2.3.6 Đạo đức nghiên cứu .31 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32 3.1 Đặc điểm chung nhóm bệnh nhân nghiên cứu người hiến TBG 32 3.1.1 Đặc điểm tuổi giới 32 3.1.2 Phân bố nhóm bệnh nghiên cứu .33 3.2 Ứng dụng kỹ thuật PCR định lượng với thị INDEL theo dõi mọc mảnh ghép bệnh nhân ghép TBG tạo máu đồng loài 34 3.2.1 Kết chuẩn bị DNA hệ gen 34 3.2.2 Kết tìm kiếm Indel mang thông tin 35 3.2.2.1 Kết marker theo dõi thể khảm .35 3.2.2.2 Kết marker theo dõi tồn dư tối thiểu 36 3.2.2.3 Kết tìm kiếm thị INDEL mang thông tin số cặp ghép .37 3.3 Đánh giá hiệu phương pháp 38 3.3.1 Số ngày, số lượt theo dõi nhóm bệnh nhân nghiên cứu 38 3.3.2 Theo dõi đáp ứng điều trị dựa dòng tế bào 39 3.3.3 Đánh giá tương quan tỷ lệ mọc mảnh ghép với giới tính 40 3.3.4 Đánh giá phương pháp Indel với số phương pháp khác 42 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 43 4.1 Đặc điểm nhóm BN nghiên cứu 43 4.1.1 Đặc điểm nhóm bệnh nhân nghiên cứu Error! Bookmark not defined 4.1.1.1 Đặc điểm nhóm bệnh 43 4.1.1.2 Đặc điểm tuổi 44 4.1.1.3 Đặc điểm giới tính .44 4.2 Hiệu theo dõi thể khảm miễn dịch phương pháp Indel 45 KẾT LUẬN 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DNA Deoxyribonucleic acid ES Embryonic stem cells GvHD Graft versus host disease Indel Insert/deletion iPSC Induced Pluripotent Stem Cells PCR Polymerase Chain Reaction qPCR Quantitative Polymerase Chain Reaction SHPT Sinh học phân tử TBG Tế bào gốc HC Hồng cầu BC Bạch cầu TC Tiểu cầu HLA Human Leucocyte Antigen DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Các marker màng tế bào xác định tế bào gốc tạo máu Bảng 1.2: Khuyến cáo mức độ hòa hợp HLA sử dụng ghép TBG tạo máu đồng loài Bảng 2.1: Các sinh phẩm hóa chất Bảng 2.2: Các máy thiết bị Bảng 3.1: Đặc điểm chung nhóm đối tượng nghiên cứu Bảng 3.2: Phân bố nhóm bệnh nghiên cứu… …………………………….33 Bảng 3.3: Kết tách chiết DNA hệ gen số mẫu sử dụng nghiên cứu …………………………………………………………………………… 34 Bảng 3.4: Kết sàng lọc thị Indel tìm kiếm thị theo dõi thể khảm…35 Bảng 3.5: Kết tìm kiếm thị theo dõi tồn dư tối thiểu ………………….36 Bảng 3.6: Kết tìm kiếm Indel mang thông tin cặp ghép số (BN4 NC4) xuất từ phần mềm KMRengine ……………………………………………….37 Bảng 3.7: Số lượt số ngày theo dõi nhóm bệnh nhân Bảng 3.8: Theo dõi đáp ứng điều trị dòng tế bào Bảng 3.9: Đánh giá tương quan tỷ lệ mọc mảnh ghép với giới tính Bảng 3.10: Đánh giá phương pháp Indel với số phương pháp khác DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Các locus gen hệ thống HLA Hình 1.2: Sơ đồ phát triển biệt hóa tế bào máu 10 Hình 1.2: Đặc trưng tế bào gốc tạo máu 11 Hình 1.3: Khả tự tái tạo tế bào gốc 12 Hình 2.1: Mơ tả thị mang thông tin người cho người nhận .27 Hình 3.1: Kết theo dõi thể khảm bệnh nhân MTTH 41 ĐẶT VẤN ĐỀ Từ thử nghiệm lâm sàng ghép tế bào gốc tạo máu vào cuối thập niên 1950, đến TBG ngày phát triển ứng dụng rộng rãi, trở thành phương pháp điều trị quan trọng để điều trị bệnh ác tính khơng ác tính quan tạo máu Cho đến nay, giới thực thành công khoảng 200.000 ca ghép TBG năm lại có thêm khoảng 20.000 bệnh nhân ghép TBG để điều trị [11] Ghép TBG đồng loài (allogenic stem cell transplatation) phương pháp điều trị chữa khỏi nhiều bệnh máu lành ác tính [10, 13] Phương pháp nhằm cấy ghép TBG người hiến vào người nhận, tạo nên quần thể tế bào sinh máu bình thường người hiến người nhận Như vậy, thể người nhận tồn song song tế bào sinh máu họ người hiến, tình trạng gọi thể khảm (chimerism) Phân tích thể khảm đánh giá để xác định phát triển tế bào tạo máu người hiến thể người nhận sau ghép Sau ghép TBG, tỷ lệ tế bào người cho người nhận số quan trọng để đánh giá mức độ thành công ca ghép, tiên lượng khả tái phát, thải ghép bệnh ghép chống chủ (grap versus host diseas – GvHD) Hiện phương pháp phân tích thể khảm dựa kỹ thuật sinh học phân tử (SHPT) chứng minh là cơng cụ có độ nhạy cao hiệu để đánh giá tình trạng khảm bệnh nhân sau ghép TBG tạo máu đồng loài Các phương pháp SHPT realtime-PCR, giải trình tự gen (Sanger, NGS) sử dụng để phân tích thể khảm, dựa thị phân tử VNTR, STR, Indel SNP Kỹ thuật PCR sử dụng thị STR (short tandem repeat) sử dụng phổ biến hệ thống giải trình tự gen Sanger STR đoạn DNA lặp có độ dài từ - 6bp, di truyền qua hệ mang tính đặc trưng cá thể Tuy nhiên đoạn lặp dễ có khả bị biến đổi dẫn đến khả tính đa hình khơng hiệu việc phân tích thể khảm [7] Một phương pháp khác hữu ích phổ biến sử dụng thị đa hình chèn xóa (insersion deletion – indel) Indel thị có tính bảo tồn cao hệ gen người, xuất phổ biến mang tính cá thể Do indel thị phân tử phù hợp để định danh cá thể, thơng qua xác định tỷ lệ quần thể 3.3.3 Đánh giá tương quan tỷ lệ mọc mảnh ghép với giới tính Bảng 3.9: Đánh giá tương quan tỷ lệ mọc mảnh ghép với giới tính Khảm hoàn toàn (n) Nam Khảm hỗn hợp Thải ghép Không theo dõi P (%) 20.0% (n) (%) 33.3% (n) - (%) - (n) (%) 46.7% Tcell >0.05 Nữ 35.7% 28.6% - - 35.7% Nam 26.7% 26.7% - - 46.7% Nữ 14.3% 42.9% - - 42.9% Nam 6.7% 26.7% 6.7% 60.0% M cell Máu >0.05 >0.05 toàn phần Nữ 7.1% 14.3% 0.0% 11 Nhận xét: − Với dòng Tcell: Tỷ lệ nam nữ phân chia đồng đều, P>0.05 − Với dòng Mcell: Tỷ lệ nam nữ phân chia đồng đều, P>0.05 − Với máu tồn phần: thải ghép có ca gặp nam giới, P>0.05 40 78.6% Hình 3.1: Kết theo dõi thể khảm bệnh nhân MTTH Nhận xét: Hình ảnh theo dõi mọc mảnh ghép bệnh nhân MTTH Các Indel mang thông tin sử dụng cho phân tích thể khảm KMR011, KMR035 Bệnh nhân theo dõi ngày D21, D30, D60, D90, D120, D180, D210, D220, D285 sau ghép, kết phân tích thể khảm 100%; 99.31%; 94.91%; 93.53%; 91.38%; 100%; 86.48%; 100%; 87.20% 41 3.3.4 Đánh giá phương pháp Indel với số phương pháp khác Bảng 3.10: Đánh giá phương pháp Indel với số phương pháp khác BN K.V.H Đ.H.Y L.H.T Ngày theo dõi Indel STR FISH X-Y D30 85.26% 100% - D60 77.65% 100% - D90 87.36% 100% - D120 - - - - - XX=100% D180 61,34% 100% - D210 92,02% - XX=100% D240 99,31% - XX=100% D270 90,75% - - D30 86.36% 100% XY=86.1% 71.67% - - D90 84.73% - XY=99% D30 68,54% 100% D60 79,83% 100% D90 64,17% 100% D120 80,11% 100% 72,95% 100% D180 91,38% 100% D210 - - D240 100,35% - D270 77,92% 100% D150 D60 D150 Dòng TB Máu ngoại vi Máu ngoại vi Máu ngoại vi Ghép đồng giới Nhận xét: So sánh phương pháp Indel với phương pháp kinh điển khác STR, FISH X-Y cho thấy có khác biệt phương pháp 42 CHƯƠNG BÀN LUẬN Bệnh nhân ghép tế bào gốc tạo máu đồng lồi nhóm bệnh nhân đặc biệt với trình điều trị phức tạp có nhiều biến chứng nguy hiểm Ghép tế bào gốc thường gặp phải vấn đề nghiêm trọng tái phát, thải ghép, bệnh ghép chống chủ Do vậy, theo dõi mọc tình trạng mọc mảnh ghép quan trọng việc can thiệp, điều chỉnh phác đồ phù hợp Xét nghiệm công cụ cho phép đánh giá phát triển mảnh ghép sau ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài, đồng thời theo dõi dự đoán nguy tái phát nguy thải ghép bệnh nhân sau ghép Kỹ thuật phân tích thể khảm phải đạt tiêu chí sau: Độ nhạy cao để phát giai đoạn sớm Đủ rõ ràng để phân biệt tế bào người cho người nhận Thời gian thực ngắn để thay đổi lựa chọn điều trị kịp thời Phương pháp phân tích STR tiêu chuẩn vàng để phân tích chimerism dự đoán nguy tái phát [39] Tuy nhiên, STR bị hạn chế độ nhạy, hệ số biến thiên cao trường hợp có khảm chimerism thấp mở sở để phát triển công nghệ [22, 39, 61] Ưu điểm phương pháp dựa qPCR so với phân tích STR thơng thường chứng minh nhiều nghiên cứu [22, 39] qPCR cho độ nhạy cao hơn, có khả phát tối thiểu 0.01% tế bào người nhận (1 tế bào người nhận số 10.000 tế bào người cho) Tháng 11/2016, Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương bắt đầu tiến hành ghép tự thân điều trị huyết học Đến tháng 5/2018, ca ghép đồng loài tiến hành Tính đến cuối năm 2016, viện tiến hành 244 ca HSCT, gồm 132 ca ghép tự thân 112 ca ghép đồng loài Việc ứng dụng phương pháp đại, nhanh chóng với kết xác cần thiết cho nhóm bệnh nhân ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài 4.1 Đặc điểm nhóm BN nghiên cứu [20, 35] 4.1.1 Đặc điểm nhóm bệnh Dựa vào bảng 3.2, nhận thấy nghiên cứu, bệnh nhân chủ yếu thuộc nhóm bệnh bạch cầu tủy cấp (AML), chiếm 10/29 bệnh nhân, tương ứng 34.5% Điều phù hợp với phân bố bệnh định ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài Theo nghiên cứu Alessandra Paz CS (2018) làm đối tượng 347 bệnh 43 nhân ghép có thống kê số lượng bệnh nhân AML chiếm nhiều 85/346, tương ứng 24% Tuy nhiên theo nghiên cứu Alessandra Paz CS (2018), CML đứng thứ hai chiếm 23%, ALL chiếm 16.4% Chênh lệch lý giải cỡ mẫu nhỏ 4.1.2 Đặc điểm tuổi Trong nghiên cứu chúng tơi, bệnh nhân có độ tuổi trung bình 34.38 ± 15.98 tuổi Tống Thị Hương nghiên cứu bệnh nhân ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài viện Huyết học – Truyền máu Trung ương có độ tuổi trung bình 30 ± 8.31 [2] Điều hợp lý nhóm bệnh nhân nghiên cứu chúng tơi có cỡ mẫu nhỏ hơn, chênh lệch với số liệu tác giả Tống Thị Hương không đáng kể Theo nghiên cứu Alessandra Paz CS (2018) có số tuổi trung bình người cho 33 (từ 3-65 tuổi), kết phù hợp với kết nghiên cứu Tuy nhiên nghiên cứu Haesook T Kim CS (2016) có số tuổi trung bình người nhận 52 Có khác biệt nghiên cứu tác giả đánh giá bệnh nhân ghép khơng có bệnh nhân mắc Thalassemia Cịn nghiên cứu chúng tơi có bệnh nhân Thalassemia với tuổi tương ứng tuổi Bệnh nhân mắc Thalassemia điều trị phương pháp ghép TBG sớm bệnh bệnh di truyền, phát sớm, đặc biệt bệnh nhân không định ghép TBG tiên lượng xấu, đặc biệt phải truyền máu suốt đời; bên cạnh bệnh nhân gặp nhiều biến chứng tải sắt (vì truyền máu nhiều lần), nguy mắc bệnh truyền nhiễm suy quan gan, lách, thận… 4.1.3 Đặc điểm giới tính Trong nghiên cứu chúng tôi, tỷ lệ nữ 14/29, nam 15/29; tỷ lệ nam/nữ 1.07 Theo nghiên cứu nước ngồi, giới tính bệnh nhân khơng ảnh hưởng tới kết cấy ghép tế bào gốc tạo máu đồng lồi, mà bất đồng giới tính người hiến người nhận làm ảnh hưởng đến kết ghép [31] Theo nghiên cứu Haesook T Kim CS (2016) có tỷ lệ người nhận nam/nữ 1.38% Có khác biệt lẽ cỡ mẫu nghiên cứu chúng tơi cịn nhỏ 29 ca ghép, nghiên cứu Haesook T Kim CS (2016) có cỡ mẫu 11797 ca 44 4.2 Hiệu theo dõi thể khảm miễn dịch phương pháp Indel 4.2.1 Kết qủa tách chiết ADN hệ gen Bảng 3.3 cho thấy mẫu sau trình tách chiết đánh giá nồng độ độ tinh máy đo Nanodrop có nồng độ ADN thu từ mẫu 11.11ng/µl Độ tinh A260/280 dao động khoảng 1,85 - 2,0 Với độ tinh phù hợp đủ độ Mẫu tuỷ mẫu máu toàn phần thường sử dụng cho phân tích mảnh ghép Trong đó, số nghiên cứu dùng mẫu máu toàn phần trường hợp đánh giá kết sau ghép máu toàn phần giai đoạn giàu tế bào T Theo nghiên cứu Antin J H CS (2001) tế bào T chiếm 10% tổng số bạch cầu máu tồn phần, có 3% dịch tuỷ xương [18] Vấn đề quan trọng sau ghép mảnh ghép người hiến có phát triển hay khơng, tiếp tình trạng mảnh ghép có trộn lẫn tế bào người hiến người nhận hay không Tuy nhiên, thể khảm hỗn hợp xuất hiện, điều quan trọng phải biết dòng tế bào có pha trộn, dịng tế bào hồn tồn người hiến Do đó, bên cạnh theo dõi mọc mảnh ghép máu toàn phần, phương pháp theo dõi dòng tế bào sử dụng [17] Theo nghiên cứu Ganderton R (2010) Theide C (2004) độ nhạy phương pháp tách dịng tế bào tăng 10 lần [19, 58] Phương pháp theo dõi chimerism dịng tế bào có vai trị hỗ trợ, bổ sung cho phương pháp theo dõi chimerism máu toàn phần Đặc biệt, độ nhạy phương pháp cao nên phát sớm tái phát dịng tế bào ác tính 4.2.2 Đánh giá marker có ý nghĩa theo dõi Bảng 3.4 trình bày kết sàng lọc 29 cặp ghép (29 người cho 29 người nhận) với 29 thị Indel Trong số thị KMR030 KMR039 lặp lại nhiều (7 lần với thị) Dựa vào có mặt marker chúng tơi đưa thị thu gọn hơn, tiết kiệm chi phí cho bệnh nhân Tiếp tục theo dõi thống kê để có đánh giá khách quan xác 45 4.2.3 Đánh giá tương quan tỷ lệ mọc mảnh ghép với giới tính Theo bảng 3.9 đánh giá tỷ lệ mọc mảnh ghép tương quan với giới tính cho thấy tỷ lệ nam nữ phân chia đồng có P>0.05 Điều cho thấy nghiên cứu khơng có tương quan đáp ứng điều trị với giới tính Tuy nhiên, theo nghiên cứu Alessandra Paz CS (2018), người cho nam ghép khác giới có người nhận nữ cho thấy làm tăng GvHD cấp tính, GvHD mãn tính đặc biệt người phụ nữ mang thai [41] tăng ức chế miễn dịch Sự khác biệt nghiên cứu với nghiên cứu lí giải cỡ mẫu cịn 4.2.4 So sánh phương pháp Indel với phương pháp khác Xét nghiệm phân tích thể khảm sau ghép cơng cụ quan trọng cho phép đánh giá phát triển mảnh ghép sau ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài Đồng thời, xét nghiệm giúp theo dõi dự đoán nguy tái phát nguy thải ghép bệnh nhân bệnh máu ác tính sau ghép [15, 63] Kỹ thuật phân tích thể khảm dựa PCR sử dụng nguyên liệu ADN ước lượng xuất tế bào người cho người nhận Tuy nhiên kỹ thuật phân tích thể khảm phải đảm bảo số tiêu chí như: (1) có độ nhạy cao để phát tái phát bệnh giai đoạn sớm; (2) đủ rõ ràng để phân biệt tế bào người cho tế bào người nhận mặt di truyền; (3) thời gian thực ngắn để thay đổi lựa chọn điều trị kịp thời; (5) cuối giá thành phải hợp lý xét nghiệm thường quy bệnh nhân ghép [15] Hiện nay, nhiều phòng xét nghiệm sử dụng phân tích thể khảm thị STR, kỹ thuật xem tiêu chuẩn vàng để phân tích thể khảm nhiều năm [50] Tuy nhiên, với phát triển cơng nghệ y sinh học tiêu chuẩn điều trị theo dõi sau ghép ngày tăng cao Gần đây, xét nghiệm PCR định lượng độ nhạy cao dựa thị Indel nghiên cứu ứng dụng cho phân tích thể khảm [63] Một số nghiên cứu cho thấy phương pháp dựa Indel STR tương tự hầu hết trường hợp Tuy nhiên, phân tích Indel hữu ích số trường hợp với tỷ lệ khảm thấp trường hợp phân tích STR xuất đỉnh giả bao chùm đỉnh thật gây khó khăn cho việc đánh giá xác tình trạng khảm [21, 25, 63] Quy trình phân tích thể khảm sử dụng PCR định lượng thị Indel thực thơng qua hai bước: (1) tìm kiếm thị Indel mang thông tin cặp ghép, thực trước ghép; (2) sau phân tích thể khảm dựa 46 thị Indel mang thông tin thời điểm theo dõi sau ghép Cả hai bước sử dụng nguyên liệu đầu vào ADN hệ gen tách chiết từ mẫu máu ngoại vi Nồng độ ADN có ảnh hưởng trực tiếp đến phản ứng PCR định lượng mà cụ thể độ nhạy xét nghiệm Với bệnh nhân điều kiện hóa diệt tủy trước ghép bệnh nhân suy tủy việc đảm bảo lượng ADN cho phân tích thể khảm thách thức Một số nghiên cứu sử dụng thị Indel cho thấy để xét nghiệm đạt độ nhạy 0,1% lượng ADN đầu vào phải lớn 100 ng [42] Nghiên cứu Kim (2014) cho thấy độ nhạy xét nghiệm sử dụng Indel đạt đến 0,11% với 25 ng ADN đầu vào, nhạy 10 lần so sánh với phân tích STR [63] Nghiên cứu sử dụng kít KimerDX đạt độ nhạy 0,1% với 66 ng lượng ADN đầu vào Trong đó, mẫu ADN có nồng độ thấp nghiên cứu 46,9 ng/ul (~423 ng đầu vào), đạt độ nhạy theo lý thuyết