Nghiên cứu đặc điểm tạo cụm tế bào của mẫu tế bào gốc tạo máu sau lưu trữ đông lạnh

Tổng quan về phân loại tế bào gốc, tế bào gốc tạo máu, các phương pháp thu thập, xử lý, lưu trữ tế bào gốc tạo máu; ứng dụng của tế bào gốc tạo máu trong điều trị bệnh lý ác tính; tình hình nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc tại Việt Nam; đối tượng và phương pháp nghiên cứu; kết quả và bàn luận.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI VŨ THU HUYỀN VŨ THU HUYỀN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM TẠO CỤM CỦA MẪU TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU SAU LƯU TRỮ ĐÔNG LẠNH LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC 2017B Hà Nội – Năm 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI VŨ THU HUYỀN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM TẠO CỤM CỦA MẪU TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU SAU LƯU TRỮ ĐÔNG LẠNH Chuyên ngành : Công nghệ sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : TS TRẦN NGỌC QUẾ PGS.TS KHUẤT HỮU THANH Hà Nội – Năm 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học riêng Các số liệu sử dụng phân tích luận văn có nguồn gốc rõ ràng cho phép sử dụng sở nơi thực nghiên cứu Các kết nghiên cứu thực cách trung thực, khách quan chưa công bố nghiên cứu trước Học viên Vũ Thu Huyền LỜI CẢM ƠN Trân trọng cảm ơn thầy hướng dẫn: TS Trần Ngọc Quế (Giám đốc Ngân hàng Tế bào gốc, Viện Huyết học – Truyền máu TW), PGS.TS Khuất Hữu Thanh (Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách khoa Hà Nội) thầy cô Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách khoa Hà Nội tận tình hướng dẫn tạo điều kiện tốt cho suốt trình học tập thực luận văn Xin bày tỏ lòng biết ơn đến tập thể Ngân hàng Tế bào gốc, Viện Huyết họcTruyền máu TW, nơi công tác nơi giúp đỡ q trình thực nghiên cứu hồn thành luận văn Học viên Vũ Thu Huyền DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AABB BFU-E American Association of Blood Banks Burst forming unit-erythroid CFU-E Colony forming unit-erythroid Colony forming unitCFU-G granulocyte Colony forming unitCFUgranulocyte, erythrocyte, GEMM monocyte, megakaryocyte Colony forming unitCFU-GM granulocyte-macrophage CFU-lympho Colony forming unit-lympho Colony forming unitCFU-Meg megakaryocyte CSF Colony stimulating factor EPO Hiệp hội ngân hàng máu Mỹ Đơn vị tạo cụm hồng cầu lớn Đơn vị tạo cụm hồng cầu nhỏ Đơn vị tạo cụm dòng hạt Đơn vị tạo cụm hỗn hợp Đơn vị tạo cụm dòng hạt-đại thực bào Đơn vị tạo cụm dòng lympho Đơn vị tạo cụm dòng mẫu tiểu cầu Yếu tố kích thích tạo cụm HPC Erythropoietin Granulocyte colony stimulating factor Granulocyte-macrophage colony stimulating factor Hematopoietic progenitor cell Yếu tố kích thích tạo cụm dịng hạtđại thực bào Tế bào đầu dòng tạo máu HSC Hematopoietic stem cell Tế bào gốc tạo máu IFN Interferon IL interleukin SCF stem cell factor G-CSF GM-CSF Yếu tố kích thích tạo cụm dịng hạt Yếu tố tế bào gốc TBCN Tế bào có nhân TBG Tế bào gốc TPO Thrombopoietin DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Sơ đồ sinh máu Hình Cấu trúc phân tử CD34 Hình 4.1 Một số hình ảnh cụm tế bào sau 14 ngày ni cấy Hình 4.2 Một số hình ảnh cụm tế bào sau 14 ngày nuôi cấy DANH MỤC BẢNG Bảng Các kháng nguyên bề mặt biểu tế bào gốc tạo máu Bảng Hướng dẫn nhận diện loại cụm tế bào kính hiển vi Bảng 4.1 Một số đặc điểm chung mẫu nuôi cấy Bảng 4.2 Đặc điểm cụm tế bào đĩa nuôi cấy (d=35mm) Bảng 4.3 Số cụm tế bào trung bình đơn vị lưu trữ Bảng 4.4 Đặc điểm chung mẫu nghiên cứu thuộc nhóm bệnh nhân Bảng 4.5 Đặc điểm chung theo nhóm bệnh lý Bảng 4.6 Đặc điểm chung mẫu nghiên cứu thuộc nhóm người hiến Bảng 4.7 Tương quan số yếu tố nhóm người hiến bệnh nhân Bảng 4.8 Số lượng cụm tế bào trung bình đĩa ni cấy Tương quan số lượng cụm tế bào gốc trung bình đĩa ni cấy (d=35mm) theo nhóm bệnh nghiên cứu Ảnh hưởng thời gian lưu trữ đến số lượng cụm tế bào mẫu tế bào gốc máu dây rốn Tương quan yếu tố nghiên cứu số lượng loại cụm mẫu tế bào gốc máu dây rốn Tương quan yếu tố nghiên cứu số lượng loại cụm mẫu tế bào gốc máu ngoại vi Khả tạo cụm tế bào gốc tế bào CD34 nhóm hai nhóm nghiên cứu Đặc điểm thời gian lưu trữ tỷ lệ tế bào sống sau rã đông Bảng 4.9 Bảng 4.10 Bảng 4.11 Bảng 4.12 Bảng 4.13 Bảng 4.14 MỤC LỤC PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN 2: TỔNG QUAN 2.1 Khái niệm phân loại tế bào gốc 2.2 Tế bào gốc tạo máu 2.2.1 Tế bào gốc máu dây rốn 2.2.2 Tế bào gốc máu ngoại vi 10 2.3 Các phương pháp thu thập, xử lý, lưu trữ tế bào gốc tạo máu 11 2.4 Các phương pháp đánh giá chất lượng đơn vị tế bào gốc tạo máu 11 2.4.1 Các phương pháp chung 11 2.4.2 Nuôi cấy cụm tế bào 13 2.5 Ứng dụng tế bào gốc tạo máu điều trị bệnh lý ác tính 15 2.6 Tình hình nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc Việt Nam 17 PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1 Vật liệu, thiết bị hóa chất 20 3.2 Phương pháp nghiên cứu 21 3.2.1 Thiết kế nghiên cứu: 21 3.2.2 Phương pháp chọn mẫu 21 3.2.3 Các thông số nghiên cứu 22 3.2.4 Xử lý số liệu nghiên cứu 22 3.2.5 Quy trình kỹ thuật áp dụng nghiên cứu 22 3.2.5 Tính tốn, biện luận đọc kết 24 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 28 Kết 28 4.1.1 Đặc điểm tạo cụm tế bào gốc máu dây rốn 28 4.1.2 Đặc điểm tạo cụm tế bào gốc máu ngoại vi 29 4.1.3 Mối liên quan đặc điểm tạo cụm tế bào gốc số yếu tố 33 4.1.4 So sánh số đặc điểm hai nhóm nghiên cứu 35 4.2 Bàn luận 36 4.2.1 Đặc điểm cụm tế bào có nguồn gốc từ máu dây rốn 37 4.2.2 Đặc điểm cụm tế bào có nguồn gốc từ máu ngoại vi 38 4.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết nuôi cấy cụm tế bào 40 4.2.4 So sánh đặc điểm tạo cụm nhóm nghiên cứu 42 PHẦN KẾT LUẬN 43 PHẦN KHUYẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỀ Tế bào gốc tạo máu (HSC: Hematopoietic Stem Cell) nghiên cứu nửa kỷ lĩnh vực tiến bật y sinh học đại Tế bào gốc tạo máu loại tế bào thấy tủy xương, máu ngoại vi máu dây rốn Chúng tạo tế bào máu tế bào có thẩm quyền miễn dịch, đáp ứng cho đổi định số lượng chức máu Ghép tế bào gốc nói chung, coi liệu pháp tiềm năng, ứng dụng nhiều lĩnh vực Trong số bật ghép tế bào gốc tạo máu, phương pháp điều trị bệnh lý ung thư, di truyền đưa lại hội sống cho bệnh nhân bị mắc bệnh lý thuộc chuyên khoa huyết học Tế bào gốc lấy từ nhiều nguồn như: từ máu dây rốn, từ tủy xương từ máu ngoại vi Phương pháp thu thập tế bào gốc từ máu dây rốn máu ngoại vi trở nên phổ biến chiếm ưu so với phương pháp lấy dịch tủy xương phương pháp đại, với nhiều ưu điểm: khơng cần gây mê, thủ thuật xâm lấn, tiết kiệm thời gian, dễ thực hiện, chủ động việc thu thập tế bào gốc, sản phẩm tinh hơn, không lẫn thành phần khác (như hạt mỡ, cặn xương…) Đối với tế bào gốc từ máu ngoại vi thu thập từ người hiến huyết thống (ghép đồng lồi) từ bệnh nhân (ghép tự thân) Đối với tế bào gốc từ máu dây rốn thu thập từ sản phụ hiến tình nguyện máu dây rốn vào ngân hàng tế bào gốc máu dây rốn cộng đồng (được xem nguồn ghép phong phú sẵn sàng cho bệnh nhân có nhu cầu ghép) thu thập theo hình thức lưu trữ cá nhân ngân hàng máu dây rốn dịch vụ Các mẫu máu sau trình thu thập, trải qua quy trình xử lý để thu thập tế bào gốc sau mẫu tế bào gốc lưu trữ để chuẩn bị cho ghép Đối với nguồn máu dây rốn 100% mẫu lưu trữ đông lạnh trước sử dụng Đối với nguồn tế bào gốc máu ngoại vi ngoại trừ ca ghép có định truyền tươi (mẫu sau thu thập truyền cho bệnh nhân vòng 48 giờ) đa số mẫu sau thu thập xử lý cần lưu trữ đơng lạnh để chờ bệnh nhân hồn thiện q trình điều kiện hóa trước ghép Chính trải qua thời gian lưu trữ đông lạnh nên việc kiểm tra chất lượng mẫu tế bào gốc cần thiết quan trọng Việc thực đánh giá chất lượng mẫu tế bào gốc sau lưu trữ, giúp đem lại thông tin cần thiết để hỗ trợ việc ứng dụng cải thiện quy trình tạo nguồn tế bào gốc Một số phương pháp giới chuyên môn Thế giới khuyến cáo dùng để đánh giá chất lượng mẫu tế bào gốc sau lưu trữ nuôi cấy mẫu tế bào gốc môi trường nuôi cấy chuyên biệt Căn vào đặc điểm cụm tế bào hình thái (các tế bào cụm có hình thái rõ ràng hay dính sát chồng lấp vào nhau), tính chất (cụm hồng cầu, bạch cầu, hỗn hợp), số lượng cụm mọc môi trường để đưa đánh giá sơ chất lượng mẫu tế bào gốc Tại Việt Nam, việc ứng dụng tế bào gốc điều trị thực thành công bệnh viện Viện Huyết học-Truyền máu TW, Bệnh viện Nhi TW, Bệnh viện Bạch Mai, Bệnh viện Truyền máu - Huyết học Tp Hồ Chí Minh, Bệnh viện TW Huế Song song với nghiên cứu tế bào gốc đẩy mạnh có nhiều cơng trình nghiên cứu khoa học cơng bố lĩnh vực Tuy nhiên, nghiên cứu đánh giá chất lượng mẫu tế bào gốc nói chung cơng bố việc sâu nghiên cứu đặc điểm tạo cụm tế bào hạn chế Xuất phát từ thực tế đó, em tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm tạo cụm tế bào mẫu tế bào gốc tạo máu sau lưu trữ đông lạnh” với mục đích sau: 1) Xác định đặc điểm cụm tế bào mẫu tế bào gốc máu dây rốn mẫu tế bào gốc máu ngoại vi; 2) Xác định mối tương quan đặc điểm tạo cụm tế bào với số số đặc điểm mẫu tế bào gốc như: số lượng tế bào có nhân, số lượng tế bào CD34, tỷ lệ sống, thời gian lưu trữ Nhận xét: Số lượng tế bào có nhân có mối tương quan thuận có ý nghĩa thống kê với số lượng cụm BFU-E, CFU-GM Số lượng CD34+ có mối tương quan thuận có ý 800 700 600 500 400 300 200 100 1000 r = 0.68; p < 0,05 Tổng số cụm (104) Tổng số cụm (104) nghĩa thống kê với số lượng loại cụm nghiên cứu 50 100 r = 0.81; p < 0,05 800 600 400 200 150 Số lượng tế bào có nhân (107) 500 1000 1500 2000 Số lượng tế bào CD34+ (105) Biểu đồ 1: Tương quan số lượng cụm tế bào với số lượng tế bào có nhân số lượng tế bào CD34+ đơn vị máu dây rốn lưu trữ Nhận xét: Số lượng cụm mọc có liên quan chặt chẽ với số lượng tế bào có nhân mẫu nghiên cứu r = 0,68 (p < 0,05) liên quan chặt chẽ với số lượng tế bào CD34+ mẫu nghiên cứu r = 0,81 (p < 0,05) Bảng 4.12: Tương quan yếu tố nghiên cứu số lượng loại cụm mẫu tế bào gốc máu ngoại vi (n=123) Số lượng tế bào Số lượng CD34+ Thời gian lưu trữ có nhân (107) (105) (năm) CFU-E r 0,07 0,09 0,004 (104 cụm) p > 0,05 > 0,05 > 0,05 BFU-E r -0,01 0,18 -0,12 (104 cụm) p > 0,05 < 0,05 > 0,05 CFU-GM r 0,1 0,15 -0,18 34 Số lượng tế bào Số lượng CD34+ Thời gian lưu trữ có nhân (107) (105) (năm) (104 cụm) p > 0,05 > 0,05 > 0,05 GEMM r 0,14 0,09 -0,09 (104 cụm) p > 0,05 > 0,05 > 0,05 Nhận xét: Số lượng tế bào có nhân thời gian lưu trữ không ảnh hưởng đến số lượng cụm tế bào gốc sau ni cấy Số lượng CD34+ có xu hướng có mối tương quan thuận có ý nghĩa thống kê với số lượng cụm BFU-E 4.1.4 So sánh số đặc điểm hai nhóm nghiên cứu Bảng 4.13: Khả tạo cụm tế bào tế bào CD34 hai nhóm nghiên cứu Mẫu TBG từ máu dây rốn Mẫu TBG từ máu ngoại vi (n=330) (n=123) CFU-E (cụm) 0,03 0,1 < 0,05 BFU-E (cụm) 0,2 0,1 < 0,05 0,1 0,1 < 0,05 0,2 0,06 < 0,05 0,31 0,27 < 0,05 p* CFU-GM (cụm) CFU-GEMM (cụm) Tổng (cụm) (*) theo Mann-Whitney Nhận xét: tế bào CD34 có nguồn gốc từ máu dây rốn có khả tạo cụm CFU-E so với tế bào CD34 máu ngoại vi Đối với loại cụm BFU-E, 35 CFU-GM, CFU-GEMM khả tạo cụm tế bào CD34 máu dây rốn lại cao so với máu ngoại vi Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 Bảng 4.14: Đặc điểm thời gian lưu trữ tỷ lệ tế bào sống sau rã đông Thời gian lưu trữ đông lạnh (năm) Tỷ lệ tế bào sống sau rã đông (%) Mẫu TBG từ máu Mẫu TBG từ máu dây rốn ngoại vi (n=330) (n=123) 1,2 0,18 < 0,05 82,5 79,5 < 0,05 p* (*) theo Mann-Whitney Nhận xét: Thời gian lưu trữ đơng lạnh trung bình mẫu tế bào gốc máu dây rốn nghiên cứu dài so với mẫu máu ngoại vi Tuy nhiên tỷ lệ sống sau rã đông mẫu máu dây rốn cao so với máu dây rốn, khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 4.2 Bàn luận Toàn nghiên cứu dựa quy trình thương mại Stem cell Technology, sử dụng môi trường bán rắn MethoCult™ H4434 Classic Loại môi trường tối ưu hóa, chứa đầy đủ yếu tố cần đánh giá phù hợp cho phát triển tế bào gốc có nguồn gốc từ người Quy trình kỹ thuật tiến hành phòng sạch, xử lý áp lực dương, mẻ cấy ln có mẫu chứng (mẫu trắng chứa môi trường nuôi cấy, không bổ sung tế bào) cấy để đảm bảo kỹ thuật thực xét nghiệm không bị nhiễm khuẩn Trong nghiên cứu tất đĩa chứng không xuất khuẩn lạc, môi trường nuôi cấy sau 14 ngày không bị đục hay đổi màu nghiêm trọng Về tỷ lệ sống tế bào mẫu nuôi cấy nghiên cứu đánh giá song song kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy (sử dụng thuốc nhuộm 7- 36 AAD) xanh trypan Tuy nhiên số liệu dùng nghiên cứu số liệu thu thập đánh giá kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy Theo hướng dẫn AABB, yêu cầu tỷ lệ sống tế bào sản phẩm sau đông cần đạt từ 70% trở lên Đối với mẫu nghiên cứu đạt tỷ lệ sống thỏa mãn yêu cầu trên, thích hợp để đưa vào bước nghiên cứu coi tỷ lệ sống không gây ảnh hưởng đến chất lượng cụm khả tạo cụm mẫu nghiên cứu 4.2.1 Đặc điểm cụm tế bào có nguồn gốc từ máu dây rốn a/ Về hình thái 1a) 1b) 1c) Hình 4.1: Một số hình ảnh cụm tế bào sau 14 ngày nuôi cấy 1a) cụm hồng cầu; 1b) cụm bạch cầu; 1c) cụm hỗn hợp 37 Sau 14 ngày nuôi cấy điều kiện thích hợp, cụm tế bào gốc đạt hình thái điển hình Sử dụng hệ thống kính hiển vi đảo ngược để quan sát kết quả, ta dễ dàng nhận khác biệt màu sắc loại cụm khác So sánh với tiêu chuẩn hình thái loại cụm tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn theo hướng dẫn Stem cell Technology AABB nhận thấy tương đồng b/ Về số lượng Số lượng loại cụm đĩa nuôi cấy, chiếm ưu cụm BFU-E CFU-E (bảng 2, 3) Kết nghiên cứu tương tự nghiên cứu tác giả Nguyễn Bá Khanh cộng (2015), nghiên cứu giới Hye Ryun Lee công (2014) [4], [1] Đây điểm đặc trưng cho nuôi cấy cụm từ tế bào gốc tạo máu từ nguồn máu dây rốn Với ưu điểm mức độ non trẻ tế bào gốc máu dây rốn mang đến tiềm tăng trưởng mạnh mẽ cho tế bào vượt trội so với nguồn tế bào gốc trưởng thành từ máu ngoại vi hay dịch tủy xương nuôi cấy loại mơi trường Bên cạnh đó, có mặt cụm hỗn hợp (bảng 2, 3) khẳng định tiềm tăng sinh nguồn tế bào gốc Trong nghiên cứu này, số lượng cụm trung bình/1 đĩa ni cấy 42,7 cụm/đĩa Kết hồn tồn phù hợp với khuyến cáo nhắc đến nghiên cứu Bert Wognum với 30 - 80 cụm/đĩa xem kết tối ưu điều kiện nuôi cấy tế bào [17] Theo số báo cáo giới mối liên quan số lượng cụm trung bình khả mọc ghép bênh nhân, số lượng cụm trung bình nhiều khả mọc mảnh ghép cao liều ghép dựa số lượng cụm trung bình khuyến cáo 3,3-3,5 x104/kg [4],[21] Trong nghiên cứu với số lượng cụm trung bình 147,9 x104 (bảng 3) hồn tồn đảm bảo liều ghép, kể cho bệnh nhân người trưởng thành 4.2.2 Đặc điểm cụm tế bào có nguồn gốc từ máu ngoại vi a/ Về hình thái 38 Thực theo quy trình ni cấy giống nhau, sau 14 ngày tiến hành đọc kết ni cấy kính hiển vi đảo ngược nhận thấy đặc điểm hình thái nhóm người hiến bệnh nhân giống so sánh với tiêu chuẩn hình thái theo hướng dẫn Stem cell Technology AABB phù hợp 2a) 2b) 2c) Hình 4.2: Một số hình ảnh cụm tế bào sau 14 ngày ni cấy b/ Về số lượng 2a) cụm hồng cầu; 2b) cụm bạch cầu; 2c) cụm hỗn hợp Điểm khác biệt bật kết ni cấy nhóm so với nhóm máu dây rốn số lượng cụm CFU-E Như nhắc đến phần trước tính chất tế bào cụm CFU-E, tế bào gốc trưởng thành so với cụm khác việc xuất loại cụm kết hoàn toàn hợp lý Trong nghiên cứu này, em đưa so sánh hai nhóm đối tượng: người hiến bệnh nhân Mục đích tìm hiểu tính chất tế bào gốc hai nhóm đối 39 tượng có khác biệt rõ rệt không Trước hết mặt số lượng, số lượng loại cụm nhóm bệnh nhân nhóm người hiến khơng có khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê (bảng 8) điều phần thể tính chất tế bào gốc thu thập từ người hiến hay bệnh nhân tương đương 4.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết nuôi cấy cụm tế bào Trong q trình thực nghiên cứu, có ba yếu tố tập trung quan sát nhiều là: số lượng tế bào CD34+, số lượng tế bào có nhân thời gian lưu trữ mẫu a/ Số lượng tế bào CD34+ Đối với nhóm mẫu có nguồn gốc từ máu dây rốn, tương quan số lượng tế bào CD34+ mẫu thể rõ rệt nhóm máu ngoại vi Kết nghiên cứu cho thấy số lượng tế bào CD34+ có tương quan thuận, chặt chẽ với số lượng cụm tế bào mẫu có nguồn gốc từ máu dây rốn sau ni cấy (biểu đồ 1) Kết phù hợp với kết từ nghiên cứu in vitro cho thấy tế bào CD34+ máu dây rốn có lực với yếu tố có nguồn gốc từ tế bào đệm (SDF-1 stromal cell derived factor) cao so với tế bào tủy xương máu ngoại vi [1] Tế bào CD34+ máu dây rốn đáp ứng mạnh với interleukin (IL-3), IL-6 yếu tố tế bào gốc (SCF), tạo nên nhiều cụm tế bào nuôi cấy [21] Cịn nhóm mẫu có nguồn gốc máu ngoại vi, kết nghiên cứu bước đầu nhận thấy xu hướng tác động yếu tố đên số lượng cụm BFU-E b/ Số lượng tế bào có nhân Trong nghiên cứu nhóm tác giả thuộc Hemogenix 73 mẫu máu dây rốn, công bố năm 2015 số lượng tế bào có nhân khơng ảnh hưởng đến kết nuôi cấy cụm “tế bào có nhân” coi thuật ngữ chung để gọi nhiều loại tế bào khác có máu dây rốn như: tế bào bạch cầu hạt, hồng cầu, tiểu cầu [94] Tuy nhiên nghiên cứu em, kết lại thể chúng có xu hướng ảnh hưởng đến số lượng cụm mẫu tế bào gốc từ máu dây rốn theo hướng thuận (biều đồ 40 1) Sự khác biệt hai nghiên cứu chênh lệch cỡ mẫu Kết nghiên cứu 123 mẫu máu ngoại vi chưa tìm thấy mối tương quan số lượng tế bào có nhân với số lượng cụm c/ Thời gian lưu trữ đông lạnh Thời gian lưu trữ đông lạnh kéo dài thường dẫn đến lo ngại yếu tố nguy ảnh hưởng đến chất lượng mẫu, nhiên theo kết nghiên cứu thời gian lưu trữ khơng ảnh hưởng đến khả tạo cụm mẫu tế bào gốc máu dây rốn lưu (bảng 4.11) Kết tương tự kết Lee Hye Ryun cộng (2014) tiến hành đánh giá chất lượng mẫu lưu trữ thời gian năm [1] Điều có ý nghĩa quan trọng với hoạt động ngân hàng máu dây rốn ảnh hưởng đến thời gian cần bổ sung thêm mẫu Kết nghiên cứu với mẫu có thời gian lưu lên đến năm cho kết tương đương với mẫu lưu năm (bảng 4.10) Tính đến thời điểm này, quy trình lưu trữ bảo quản mẫu Ngân hàng Tế bào gốc, Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương hoàn toàn đảm bảo chất lượng mẫu Đối với mẫu tế bào gốc máu ngoại vi, so sánh thời gian lưu mẫu nhóm bệnh nhân nhóm người hiến nhận thấy có khác biệt Các mẫu thuộc nhóm bệnh nhân thường có xu hướng lưu trữ dài so với nhóm người hiến Sở dĩ có khác biệt bệnh nhân sau q trình kích tế bào gốc để gạn tách bắt đầu bước vào trình điều kiện hóa trước ghép nhóm người hiến bệnh nhân nhận tế bào gốc từ người hiến thực điều kiện hóa song song với q trình kích tế bào gốc để gạn tách người hiến Tuy nhiên, thời gian lưu trữ dài không làm ảnh hưởng đến chất lượng mẫu tế bào gốc Điều thể tỷ lệ sống sau rã đông hai nhóm khơng có khác biệt (bảng 4.7) số lượng cụm trung bình đĩa ni cấy khơng có chênh lệch lớn (bảng 4.8) Việc đưa kết có ý nghĩa quan trọng với bệnh nhân thực hiến điều kiện hóa nhiên chưa đạt lui bệnh để ghép tế bào gốc mẫu tế bào gốc lưu trữ đủ tiêu chuẩn để ghép 41 4.2.4 So sánh đặc điểm tạo cụm nhóm nghiên cứu Tất mẫu tế bào gốc lưu trữ nhằm mục đích sử dụng cho ghép, nhiên mẫu tế bào gốc từ máu dây rốn việc lưu trữ lâu dài mục đích thành lập ngân hàng sẵn sàng cung cấp tế bào gốc Còn mẫu từ máu ngoại vi mẫu có sẵn định dùng cho đối tượng xác định Đây lý làm cho kết mặt thời gian lưu mẫu nhóm máu dây rốn cao nhiều so với máu ngoại vi Từ kết thu nghiên cứu, em tiến hành phân tích tế bào CD34+ có tiềm tạo cụm tế bào hai nhóm nghiên cứu? Sau phân tích nhận thấy nhìn chung tế bào CD34+ có nguồn gốc từ máu dây rốn có tiềm tạo cụm BFU-E, CFU-GM, CFU-GEMM cao so với tế bào CD34+ từ máu ngoại vi, đặc biệt loại cụm hỗn hợp CFU-GEMM (bảng 4.14) Còn loại cụm CFU-E, tế bào CD34+ từ máu ngoại vi có tiềm tạo cụm cao so với tế bào CD34+ từ máu dây rốn Kết phù hợp với hiểu biết tính chất nguồn cung cấp tế bào gốc Theo đó, nguồn tế bào gốc từ máu dây rốn xem non trẻ nhất, có tiềm cao Điều thể rõ khả tạo cụm hỗn hợp CFU-GEMM cao vượt trội so với máu ngoại vi (bảng 4.14) 42 PHẦN KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu với 330 mẫu máu dây rốn 123 mẫu máu ngoại vi lưu trữ đông lạnh nhận thấy: - Đặc điểm tạo cụm tế bào mẫu tế bào gốc máu dây rốn: + Hình thái cụm tế bào gốc nghiên cứu phù hợp với tiêu chuẩn theo hướng dẫn nhà sản xuất môi trường nuôi cấy Stem cell Technology theo tiểu chuẩn AABB; + Số lượng cụm trung bình đơn vị máu dây rốn lưu trữ 149,1 x104 cụm Các cụm thường gặp là: BFU-E (77,4 x104 cụm), CFU-GM (62,8 x104 cụm) CFU-GEMM (7,9 x104 cụm); cụm gặp CFU-E (0,84 x104 cụm) - Đặc điểm tạo cụm mẫu tế bào gốc máu ngoại vi: + Hình thái cụm tế bào gốc nghiên cứu phù hợp với tiêu chuẩn theo hướng dẫn nhà sản xuất môi trường nuôi cấy Stem cell Technology theo tiểu chuẩn AABB; + Số lượng cụm trung bình đĩa nuôi cấy (d=35mm) mẫu máu ngoại vi lưu trữ là: ⁻ Nhóm bệnh nhân: trung bình 70,5 x104 cụm Các cụm thường gặp là: CFU-E (3,7 x104 cụm), BFU-E (39,2 x104 cụm), CFU-GM (26,4 x104 cụm) CFUGEMM (1,3 x104 cụm) ⁻ Nhóm người hiến: trung bình 60,4x104 cụm Các cụm thường gặp là: CFU-E (3,3 x104 cụm), BFU-E (33,3 x104 cụm), CFU-GM (22,5 x104 cụm) CFUGEMM (1,5 x104 cụm) - Tương quan đặc điểm tạo cụm tế bào với số yếu tố: + Số lượng cụm tế bào mẫu tế bào gốc từ máu dây rốn có mối tương quan thuận, chặt chẽ với số lượng tế bào CD34+ có mối tương quan thuận với số lượng tế bào có nhân + Thời gian lưu mẫu khơng ảnh hưởng đến kết tạo cụm mẫu tế bào gốc máu dây rốn ngoại vi 43 PHẦN KHUYẾN NGHỊ Nuôi cấy tạo cụm tế bào kỹ thuật hiệu quả, phù hợp để đánh giá chất lượng khả phát triển mẫu sau thời gian lưu trữ đông lạnh Cần thực xét nghiệm với tất mẫu có định ghép cho bệnh nhân Ngoài ra, cần tiếp tục tiến hành nghiên cứu để đánh giá chất lượng mẫu với thời gian lưu trữ dài cỡ mẫu lớn Có thể kết hợp với lâm sàng để nghiên cứu tương quan kết tạo cụm tế bào mẫu lưu trữ đông lạnh với hiệu mọc mảnh ghép bệnh nhân 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 11 12 13 14 Bạch Quốc Khánh (2014), Nghiên cứu hiệu ghép tế bào gốc tự thân điều trị bệnh đa tủy xương u lymphơ ác tính không hodgkin, Đại học Y Hà Nội, Lê Văn Đông Phạm Mạnh Hùng (2017), "Tế bào gốc trạng nghiên cứu, ứng dụng tế bào gốc Việt Nam", Trường Đại học Duy Tân 22-30 Trung tâm Thông tin Khoa học Cơng nghệ Tp Hồ Chí Minh (2013), Tế bào gốc tiềm ứng dụng, Sở Khoa học Cơng nghệ Tp Hồ Chí Minh, Phan Kim Ngọc (2008), Công nghệ tế bào gốc, Nhà xuất Giáo dục Việt Nam, Nguyễn Bá Khanh and Trần Ngọc Quế (2015), "Bước đầu nghiên cứu kết số yếu tố liên quan đến khả tạo cụm tế bào mẫu máu dây rốn lưu trữ Viện Huyết học-Truyền máu TW", Y học TP Hồ Chí Minh 19(4), 257-261 Đỗ Trung Phấn (2008), "Tế bào gốc bệnh lý tế bào gốc tạo máu", Nhà xuất Y học Flomenberg N, Devine SM and et al DiPersio JF (2005), "The use of AMD3100 plus G-CSF for autologous hematopoietic progenitor cell mobilization is superior to G-CSF alone", Blood 1061867-1874 Levesque J-P, Liu F and et al Simmons PJ (2004), "Characterization of hematopoietic progenitor mobilization in protease-deficient mice", Blood 10465-72 Zhu J and Emerson SG (2002), "Hematopoietic cytokines, transcription factors and lineage commitment", Oncogene 213295-3313 Zhou G, Chen J, Lee S, Clark T, et al (2001), "The pattern of gene expression in human CD34+ stem/progenitor cells", Proc Natl Acad Sci U S A 98(24), 13966–71 A.T Anguita-Compagnon, M.T Dibarrart, J Palma, L Paredes, et al (2010), "Mobilization and Collection of Peripheral Blood Stem Cells: Guidelines for Blood Volume to Process, Based on CD34-Positive Blood Cell Count in Adults and Children", Transplantation Proceedings 42339-44 Anna Hordyjewska et al (2014), "Characteristics of hematopoietic stem cells of umbilical cord blood", Cytotechnology 67(3), 387-96 Kristin M Page et al (2015), "Relationships Among Commonly Used Measures of Cord Blood Potency, ALDHbr Cell Content, and Colony Forming Cell Content in Cord Blood Units Prior to Cryopreservation: Towards An Improved Metric for Potency of Banked Cord Blood", American Society of Hematology 118(21), 4054 Natália Emerim Lemos et al (2017), "Quantification of peripheral blood CD34+ cells prior to stem cell harvesting by leukapheresis: a single center experience", Hematol transfus cell ther 40(3), 213-8 45 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Yao CL et al (2004), "A systematic strategy to optimize ex vivo expansion medium for human hematopoietic stem cells derived from umbilical cord blood mononuclear cells.", Exp Hematol 32(8), 720-7 Anna Hordyjewska, Lukasz Popiolek and and Anna Horecka (2014), "Characteristics of Hematopoietic stem cells of umbilical cord blood", Cytotechnology 67387-96 Bert Wognum, Ning Yuan, Becky Lai and and Cindy L.Miller (2013), "Basic Cell Culture Protocols: Colony Forming Cell Assays for Human Hematopoietic Progenitor Cells ", Methods in Molecular Biology 946267-283 Brunet de la Grange P, Ivanovic Z, Leprivey-Lorgeot V and Praloran V (2002), "Angiotensin II that reduces the colony forming ability of hematopoietic progenitors in serum free medium has an inverse effect in serum supplemented medium", Stem Cells 20(3), 269-71 Chang Y-J, Tseng Ch-P, Hsu L-F, Hsieh T-B, et al (2006), "Characterization of two populations of mesenchymal progenitor cells in umbilical cord blood", Cell Biol Int 30(6), 495-9 Z Dabrowski (1998), Blood physiology, PWN, Warsaw David Bryder, Derrick J Rossi and Irving L Weissman (2006), "Hematopoietic Stem Cells: The Paradigmatic Tissue-Specific Stem Cell", The American Journal of Pathology 169(2), 338-46 F Lanza, L Healy and D.R Sutherland (2001), "Structural and functional features of the CD34 antigen: an update", Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents 15(1), 1-13 Gallacher L, Murdoch B, Wu DM, Karanu FN, et al (2000), "Isolation and characterization of human CD34- Lin- and CD34? Lin- hematopoietic stem cells using cell surface markers AC133 and CD7", Blood 95(1), 2813-21 Gao L, Chen X, Zhang X, Liu Y, et al (2006), "Human umbilical cord bloodderived stromal cell, a new resource of feeder layer to expand human umbilical cord blood CD34+ cells in vitro", Blood Cells Mol Dis 36(2), 322-8 John P Greer (2014), Wintrobe’s Clinical Hematology, LIPPINCOTT WILLIAMS & WILKINS, a WOLTERS KLUWER busines, Grskovic B, Ruzicka K, Karimi A, Qujeq D, et al (2004), "Cell cycle analysis of the CD133+ and CD133- cells isolated from umbilical cord blood", Clin Chim Acta 343(1), 173-8 Gutierrez-Rodriguez M, Reyes-Maldonado E and Mayani H (2000), "Characterization of the adherent cells developed in dexter type long term cultures from human umbilical cord blood", Stem Cells 18(1), 46-52 Anna Hordyjewska, Łukasz Popiołek and Anna Horecka (2014), "Characteristics of hematopoietic stem cells of umbilical cord blood", Cytotechnology 67(3), 387-96 46 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 Hye Ryun Lee, Eun Young Song, Sue Shin, Eun Youn Roh, et al (2014), "Quality of cord blood cryopreserved for up to years", Korean Society of Hematology, Blood Research 49(1), 54-60 Jinquan T, Anting L, Jacobi HH, Glue C, et al (2001), "CXCR3 expression on CD34+ hemopoietic progenitors induced by granulocyte-macrophage colony stimulating factor: II Signaling pathways involved", J Immunol 167(1), 440513 John Patterson, Cally H Moore, Emily Palser, Jason C Hearn, et al (2015), "Detecting primitive hematopoietic stem cells in total nucleated and mononuclear cell fractions from umbilical cord blood segments and units", Journal of Translational Medicine 13(94), 1-16 Tarach JS (1999), "Hematopoietic stem cells of bone marrow and CD34 antigen", Acta Haematol Pol 30(1), 225-33 Kopec-Szlezak J and Podstawka U (2001), "Cord blood hematopoietic CD34+ cells", Acta Haematol Pol 32(1), 61-9 Martin Körbling and Emil J Freireich (2010), "25 years of peripheral blood stem cell transplantation", Blood 117(24)6411-6 Lee MW, Yang MS, Park JS, Kim HC, et al (2005), "Isolation of mesenchymal stem cells from cryopreserved human umbilical cord blood", Int J Hematol 81(2), 126-30 Natália Emerim Lemos, Mariela Granero Farias, Francyne Kubaski, Luciana Scotti, et al (2017), "Quantification of peripheral blood CD34+ cells prior to stem cell harvesting by leukapheresis: a single center experience", Hematol transfus cell ther 40(3), 213-8 Michael A Pulsipher, Pintip Chitphakdithai, John P Miller, Brent R Logan, et al (2009), "Adverse events among 2408 unrelated donors of peripheral blood stem cells: results of a prospective trial from the National Marrow Donor Program", Blood 1133604-11 Richard E Champlin, Norbert Schmitz, Mary M Horowitz, Bernard Chapuis, et al (2000), "Blood stem cells compared with bone marrow as a source of hematopoietic cells for allogeneic transplantation", Blood 953702-9 CSc RNDr Jiřina Hofmanová (2013), Genotoxicita a karcinogeneze, Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity, Smogorzewska EM, Barsky LW, Crooks GM and Wienberg KI (1997), "Purification of hematopoietic stem cells from human bone marrow and umbilical cord blood", Cent Eur J Immunology 22(1), 232-9 Stolarek M and Mysliwski A (2005), "Stem cells of cord blood", Post Biol Kom 32(1), 375-90 Stem cell technology (2011), "Atlas of hematopoietic clonies from cord blood", Tian H, Huang S, Gong F, Tian L, et al (2005), "Karyotyping, immunophenotyping, and apoptosis analyses on human hematopoietic precursor 47 44 cells derived from umbilical cord blood following long-term ex vivo expansion", Cancer Genet Cytogenet 157(1), 33-6 Zeman K, Fornalczyk-Wachowska E, Pokoca L, Kantorski J, et al (1996), "The composition of main lymphocyte’s subsets and NK cells in peripheral blood of the Polish population", Cent Eur J Immunology 21(1), 107–13 48 ... tế bào mẫu tế bào gốc máu dây rốn mẫu tế bào gốc máu ngoại vi; 2) Xác định mối tương quan đặc điểm tạo cụm tế bào với số số đặc điểm mẫu tế bào gốc như: số lượng tế bào có nhân, số lượng tế bào. .. tạo cụm tế bào hạn chế Xuất phát từ thực tế đó, em tiến hành đề tài: ? ?Nghiên cứu đặc điểm tạo cụm tế bào mẫu tế bào gốc tạo máu sau lưu trữ đơng lạnh? ?? với mục đích sau: 1) Xác định đặc điểm cụm. .. LUẬN Từ kết nghiên cứu với 330 mẫu máu dây rốn 123 mẫu máu ngoại vi lưu trữ đông lạnh nhận thấy: - Đặc điểm tạo cụm tế bào mẫu tế bào gốc máu dây rốn: + Hình thái cụm tế bào gốc nghiên cứu phù hợp