Giá trị của các xét nghiệm chẩn đoán Covid19 soạn bởi PGS. TS. BS. Cao Minh Nga ĐH Y Dược TP. Hồ Chí Minh, trình bày tại Hội nghị Gan Mật TP. Hồ Chí Minh tháng 102020. Xin vui lòng không sao chép dưới bất cứ hình thức nào Mọi thông tin trong tài liệu căn cứ theo các thông tin được công bố tại thời điểm biên soạn (102020).
PGS TS Cao Minh Nga Khoa Y - ÑH Y Dược TP HCM I Mở đầu II Tính chất virus học SARS-CoV-2 III Các xét nghiệm chẩn đoán COVID-19 IV Kết luận I Mở đầu COVID-19 (bệnh hơ hấp cấp tính) SARS-CoV-2 (chủng virus Corona mới) gây từ 12/2019, đại dịch toàn cầu Thời kỳ ủ bệnh: 2-14 ngày, trung bình 5-7 ngày Lâm sàng: nhiễm không triệu chứng nặng, tử vong ( 2,7%) Xét nghiệm chẩn đoán COVID-19 sớm quản lý tốt lâm sàng, kiểm soát ổ dịch Xét nghiệm khẳng định nguyên: phát SARS-CoV-2 kỹ thuật real-time RT-PCR giải trình tự gen từ bệnh phẩm I Mở đầu Virus corona (CoV) có giống chính: alpha, beta, gamma, delta loại lây nhiễm cho người (HCoV) là: 229E (alpha coronavirus) Gây cảm lạnh thông thường NL63 (alpha coronavirus) 20% số ca nhiễm trùng hô hấp hàng năm OC43 (beta coronavirus) thường gặp thứ sau rhinovirus HKU1 (beta coronavirus) SARS-CoV SARS, 2002 Gây bệnh nặng, MERS-CoV Hội chứng thuộc giống (genera) hô hấp Trung Đông, từ 2012 beta coronavirus SARS-CoV-2 COVID-19, 2019 * Nhiều CoV gây bệnh động vật (tổn thương ruột/gia súc) II Tính chất virus học SARS-CoV-2 Cấu trúc & thành phần: - virus RNA có màng bọc, lớn (125nm) - RNA sợi đơn, khơng phân đoạn - có chế đọc sửa RNA tỷ lệ đột biến tương đối thấp - Có protein cấu trúc loại kháng nguyên (KN) : Spike (S): protein gai màng bọc Envelope (E): protein nhỏ màng bọc Membrane (M): protein lớn màng bọc Nucleocapsid (N): protein nucleocapsid II Tính chất virus học SARS-CoV-2 Cấu trúc & thành phần: loại protein (kháng nguyên) S, M, E & N II Tính chất virus học SARS-CoV-2 Cấu trúc genome SARS-CoV-2: - sợi đơn RNA, không phân đoạn, chiều dài 29,7 lớn số virus RNA - Khung đọc mở gen mã hóa protein cấu trúc: S, E, M, N - Gen không cấu trúc: RdRp (RNA-dependent RNA polymerase), Orf1a, Orf1ab First line screening assay: E gene assay Confirmatory assay: RdRp gene assay III Các xét nghiệm chẩn đoán COVID-19 Các phương pháp (pp) chẩn đốn () bệnh nhiễm virus: - pp virus học: nuôi cấy virus nuôi cấy tế bào - pp miễn dịch học: phản ứng KN - kháng thể (KT) - pp sinh học phân tử: phát gen đặc hiệu virus (RNA/DNA) Cách phân loại khác: - trực tiếp: phát virus thành phần virus (KN, RNA/DNA) giai đoạn sớm, xác định - gián tiếp: phát đáp ứng miễn dịch ký chủ nhiễm virus KT hỗ trợ , dịch tễ học III Các xét nghiệm chẩn ñoaùn COVID-19 XN phát SARS-CoV-2, gồm: * Trực tiếp: phát virus hay thành phần virus - Ni cấy virus: phát virus cịn sống - XN khuếch đại acid nucleic (NAAT) hay sinh học phân tử - XN phát kháng nguyên: chẩn đoán nhanh * Gián tiếp: phát đáp ứng miễn dịch người nhiễm virus - XN kháng thể Diễn giải xét nghiệm chẩn đoán COVID-19 10 From: Sethuraman et al, JAMA Published online May 6, 2020 doi:10.1001/jama.2020.8259 III Các xét nghiệm chẩn đoán COVID-19 Ni cấy virus (phân lập virus): - phân lập virus nuôi cấy tế bào - khơng khuyến cáo chẩn đốn thường qui - cần sở có an tồn sinh học cấp (BSL-3) - cần nhân viên đào tạo chuyên sâu - có kết sau – tuần - cần xác định tiếp tục xét nghiệm đặc hiệu Ứng dụng: nghiên cứu, điều chế vaccine III Các xét nghiệm chẩn đoán COVID-19 Xét nghiệm sinh học phân tử hay khuếch đại acid nucleic (NAAT - Nucleic acid amplification test): Kỹ thuật thường sử dụng: - Real-time RT-PCR (Real-time Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) Viết tắt: rRT-PCR hay qRT-PCR (quantitative RT-PCR) - Giải trình tự gene III Các xét nghiệm chẩn đoán COVID-19 Xét nghiệm sinh học phân tử 2.1 Real-time RT-PCR (rRT-PCR hay qRT-PCR) - Khuyến cáo chẩn đoán thường qui: sàng lọc & khẳng định trường hợp nghi nhiễm SARS-CoV-2 cấp - Các gene đích XN: E, N, S, RdRP, ORF1a ORF1ab + Chẩn đoán tối ưu: gene đích SARS-CoV-2, + Có thể: gene đích (vùng dịch tễ) III Các xét nghiệm chẩn đoán COVID-19 Xét nghiệm sinh học phân tử 2.1 Real-time RT-PCR (rRT-PCR hay qRT-PCR) Dương tính giả: - có kết dương tính yếu, số XN tạo tín hiệu giả giá trị Ct cao - sai sót kỹ thuật: Khi kết XN chưa thỏa đáng: lấy mẫu XN lại III Các xét nghiệm chẩn đoán COVID-19 Xét nghiệm sinh học phân tử: Âm tính giả: - chất lượng BP chứa vật liệu BN; - BP lấy muộn từ khởi bệnh (> tuần), lấy BP vào thời điểm tải lượng virus thấp; - BP không xử lý và/hoặc vận chuyển thích hợp; - lý kỹ thuật vốn có XN, ví dụ: + ức chế PCR + đột biến virus III Các xét nghiệm chẩn đoán COVID-19 Xét nghiệm sinh học phân tử 2.2 Giải trình tự gene cho SARS-CoV-2 Để điều tra diễn tiến dịch bệnh: - thay đổi quy mô dịch bệnh theo thời gian, - lây lan theo không gian dịch bệnh - kiểm tra giả thuyết đường lây truyền Để định chọn kỹ thuật chẩn đoán, thuốc vaccine Tuy nhiên, chi phí khối lượng cơng việc cao, thực phịng thí nghiệm chun sâu, nghiên cứu - III Các xét nghiệm chẩn đoán COVID-19 Xét nghiệm phát KN đặc hiệu SARS-CoV-2: Là XN tin cậy mà tốn kém, đơn giản nhanh Không khuếch đại mục tiêu đích NAAT nhạy (0-94%) độ đặc hiệu cao (>97%) WHO: chấp nhận cho chẩn đoán LS XN đạt yêu cầu độ nhạy > 80%, độ đặc hiệu 97% so với kỹ thuật tham chiếu NAAT Các test chẩn đoán KN giúp XN SHPT & chẩn đoán nhanh COVID-19 Hiệu XN cao tải lượng virus cao vào thời điểm lấy mẫu: - giai đoạn đầu nhiễm SARS-CoV-2 - vòng ngày sau khởi phát triệu chứng Kết DƯƠNG TÍNH GIẢ: với HCoV khác SARS-CoV-2 structure and assay target Confidential Assay target ＝ NP（Nucleocapsid protein) https://phil.cdc.gov/Details.aspx?pid=23311 NP is released from RNA in virions by pretreatment with detergent NP is measured/detected by sandwich immunoassay Dinesh et al (2020) Structural basis of RNA recognition by the SARS-CoV-2 nucleocapsid phosphoprotein bioRxiv https://dx.doi.org/10.1101/2020.04.02.022194 22 III Các xét nghiệm chẩn đoán COVID-19 Xét nghiệm phát KN Có loại: - Test phịng xét nghiệm: Ví dụ: XN miễn dịch men hóa phát quang (Nhật bản) (Chemiluminescence Enzyme Immunoassay (CLEIA) assay) - Test nhanh (RDT - Rapid Diagnostic Tests): + thực gần người bệnh + KN (protein) đích: thường kháng nguyên N (số lượng lớn) + thường test sắc ký miễn dịch (Immuno-chromatography: ICA) + cho kết vịng 30 phút Ví dụ: Test STANDARD COVID-19 Ag Các dấu ấn sinh học nhiễm SARS-CoV-2 Thời gian từ nhiễm Levels Ủ bệnh Th/k cấp sớm Bình phục Th/k cấp muộn Viral RNA IgM IgG Kháng nguyên Viral detection tests Host immune response detection tests From:C Galli and D Daghfal, Serological approaches for the diagnosis of SARS-CoV-2 infection (White Paper) III Các xét nghiệm chẩn ñoaùn COVID-19 Xét nghiệm phát kháng thể (KT): Khơng sử dụng cho mục đích sàng lọc & chẩn đoán xác định nhiễm SARS-CoV-2 Kết DƯƠNG TÍNH: nhiễm SARS-CoV-2 Kết ÂM TÍNH: - khơng bị nhiễm SARS-CoV-2 - nhiễm đáp ứng miễn dịch chưa đủ mạnh hoặc: chưa đủ thời gian tạo KT sau phơi nhiễm XN phát KT giúp: - Nghiên cứu & giám sát dịch tễ học COVID-19 - Hỗ trợ chẩn đốn, ví dụ: Độ nhạy kết hợp IgG & RNA > 99% Tóm tắt: Phân biệt phương pháp xét nghiệm V Kết luận Có nhiều phương pháp xét nghiệm chẩn đoán COVID-19 Real-time RT-PCR (rRT-PCR hay qRT-PCR): xét nghiệm sàng lọc & khẳng định chẩn đoán thường qui XN phát kháng nguyên: ngày hồn thiện, hữu ích cho thực tiễn lâm sàng XN phát kháng thể: không sử dụng cho mục đích sàng lọc & chẩn đốn xác định nhiễm SARS-CoV-2 Ni cấy virus & giải trình tự gene: sử dụng cho mục đích nghiên cứu & sản xuất vaccine Tài liệu tham khảo WHO Diagnostic testing for SARS-CoV-2 Interim guidance, 11-9-2020 WHO Antigen-detection in the diagnosis of SARS-CoV-2 infection using rapid immunoassays Interim guidance, 11-92020 Bộ Y tế QUYẾT ĐỊNH việc phê duyệt Kế hoạch xét nghiệm phát nhiễm SARS-CoV-2 giai đoạn dịch COVID-19 4042 / QĐ-BYT, 21-9-2020 Đỗ Thị Thu Thủy Cập nhật phương pháp xét nghiệm SARSCoV-2 CDC Hoa Kỳ Việt Nam, 12-10-2020 Claudio Galli Giới thiệu xét nghiệm IgG Ab Abbott Diagnostics, 2020 Tài liệu chuyên môn Fujirebio SARS-CoV-2 antigen assays, 2020 Thanks for your attention! ... nhanh COVID-19 Hiệu XN cao tải lượng virus cao vào thời điểm lấy mẫu: - giai đoạn đầu nhiễm SARS-CoV-2 - vòng ngày sau khởi phát tri? ??u chứng Kết DƯƠNG TÍNH GIẢ: với HCoV khác SARS-CoV-2 structure... diagnosis of SARS-CoV-2 infection (White Paper) III Các xét nghiệm chẩn đoán COVID-19 Quy trình xét nghiệm phát nhiễm SARS-CoV-2 cấp tính người có nghi ngờ lâm sàng với COVID-19 (WHO, 1 1-9 -2 020) III... dụng: - Real-time RT-PCR (Real-time Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) Viết tắt: rRT-PCR hay qRT-PCR (quantitative RT-PCR) - Giải trình tự gene III Các xét nghiệm chẩn đoán COVID-19