Hiện nay chất lượng nước tại các ao nuôi tôm ở vùng đầm phá Tam Giang - Cầu Hai đang giảm sút nghiêm trọng. Do đó việc đánh giá và tuyển chọn các chủng vi sinh vật bản địa có khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ cao, đồng thời tạo các chế phẩm để xử lý ao nuôi là có ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Bài viết trình bày sự ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến hoạt tính amylase và sự tích lũy sinh khối của chủng vi khuẩn V94 và chủng xạ khuẩn X65.
UED JOURNAL OF SOCIAL SCIENCES, HUMANITIES AND EDUCATION VOL.3, NO.2 (2013) NGHIÊN CỨU MỘT SỐ NHÓM VI SINH VẬT PHÂN GIẢI TINH BỘT TRONG AO NUÔI TÔM Ở ĐẦM SAM - CHUỒN, PHÚ VANG, THỪA THIÊN HUẾ RESEARCHING ON SOME GROUPS OF STARCH - DEGRADING MICROORGANISMS IN SHRIMP CULTURE PONDS AT SAM - CHUON LAGOON, PHU VANG DISTRICT, THUA THIEN HUE PROVINCE Phạm Thị Ngọc Lan, Nguyễn Hữu Hoàng Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế Email: Ngoclanz@yahoo.com TÓM TẮT Hiện chất lượng nước ao nuôi tôm vùng đầm phá Tam Giang - Cầu Hai giảm sút nghiêm trọng Do việc đánh giá tuyển chọn chủng vi sinh vật địa có khả phân giải hợp chất hữu cao, đồng thời tạo chế phẩm để xử lý ao ni có ý nghĩa khoa học thực tiễn Từ mẫu bùn ao nuôi tôm, phân lập tuyển chọn tuyển chọn chủng vi khuẩn V94 chủng xạ khuẩn X65 có khả phân giải tinh bột mạnh Kết nghiên cứu cho thấy, thời gian nuôi cấy tối ưu chủng V94 72 chủng X65 108 giờ, hai chủng sinh trưởng tốt khoảng pH từ trung tính đến kiềm yếu, nhiệt độ 30 - 35 0C nồng độ muối NaCl 0,5 - 15‰ Hai chủng cịn có khả phân giải mạnh protein, cellulose lipid Đặc biệt hơn, chủng X65 có khả kháng với loại vi sinh vật kiểm định, kháng mạnh với đối tượng gây bệnh cho tôm Vibrio sp Vibrio parahaemolyticus Từ khóa: vi sinh vật, tinh bột, địa, Phú Vang ABSTRACT Currently, the water quality at many shrimp ponds in Tam Giang-Cau Hai lagoon is being declined Thus, assessing and selecting the indigenous microorganisms with high ability to degrade organic materials as well as the production of bio-preparations for treating shrimp ponds possess a practical and scientific significance From some sludge samples of many shrimp ponds, we isolated V94 bacterial strain and X65 actinomycetes strain having high ability to degrade starch Results showed that the optimal growth times for V94 and X65 were 72 and 108 hrs, respectively; the pH, temperature and concentration of NaCl for their optimal growth were neutral to low pH, 30-350C and 0,5 15‰, respectively Both strains also had the ability to strongly degrade protein, cellulose and lipid Moreover, X65 strain had the ability of antibacterian to microorganisms especially two shrimps pathogens, Vibrio sp and Vibrio parahaemolyticus Key words: microorganism; starch; indigenous; Phu Vang Đặt vấn đề Trong năm gần đây, nghề nuôi tôm đầm phá Tam Giang - Cầu Hai phát triển mạnh mẽ, đặc biệt vùng ao nuôi thuộc đầm Sam - Chuồn, Phú Vang, Thừa Thiên Huế Hiện trạng môi trường nước ao nuôi ngày ô nhiễm nặng số nguyên nhân lượng thức ăn dư thừa nhiều, thời gian thay nước không hợp lý tôm chết dịch bệnh [1] Điều tác động tiêu cực đến suất thu hoạch mà gây ảnh hưởng xấu cho môi trường sinh thái Do phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả sử dụng chuyển hóa hợp chất hữu gây ô nhiễm nguồn nước có ý nghĩa lớn hướng nghiên cứu môi trường phát triển bền vững Đồng thời sở cho việc sản xuất chế phẩm vi sinh 12 địa làm ao ni, góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường [2], [3], [4] Đối tượng phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng nghiên cứu Các chủng vi khuẩn xạ khuẩn có khả phân giải tinh bột phân lập từ bùn ao nuôi tôm đầm Sam - Chuồn, Phú Vang, Thừa Thiên Huế Các vi sinh vật kiểm định: Bacillus pumilus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Vibrio sp Vibrio parahaemolyticus 2.2 Phương pháp nghiên cứu * Xác định hoạt tính enzyme amylase phương pháp khuếch tán thạch - Nguyên tắc: Enzyme phản ứng với chất môi trường thạch làm cho môi trường trở nên suốt Độ lớn vịng phân giải TẠP CHÍ KHOA HỌC XÃ HỘI, NHÂN VĂN VÀ GIÁO DỤC TẬP 3, SỐ (2013) phản ánh hoạt tính enzyme Methyl Cellulose) dầu nành - Phương pháp tiến hành: Nuôi cấy vi sinh vật môi trường dịch thể để thu dịch lọc enzyme Chuẩn bị môi trường thạch – tinh bột để tạo giếng enzyme Sau ủ dịch enzyme nhiệt độ 300C thời gian 72 giờ, tiến hành nhuộm màu thuốc thử Lugol để xác định vòng phân giải tinh bột [5] Khả kháng khuẩn: Tiến hành nuôi cấy vi sinh vật, thu dịch lọc để kiểm tra khả kháng khuẩn Môi trường kiểm định sau khử trùng để nguội đến khoảng 450C, cho vi sinh vật kiểm định vào phân vào đĩa petri Khi thạch nguội, tạo giếng, nhỏ dịch lọc kiểm tra vào, đặt lạnh 40C từ -5 giờ, nuôi 300C sau 12 - 24 giờ, xác định hiệu số vịng vơ khuẩn * Thăm dò ảnh hưởng số điều kiện ni cấy đến hoạt tính amylase tích lũy sinh khối chủng vi sinh vật Tiến hành nuôi cấy chủng vi khuẩn xạ khuẩn tuyển chọn môi trường dịch thể tương ứng (môi trường Vinogradski chủng V94 môi trường Gause I chủng X65) với nguồn carbon thay tinh bột điều kiện thời gian, pH môi trường, nhiệt độ nồng độ muối NaCl khác Sau nuôi cấy, ly tâm tách riêng phần dịch lọc sinh khối Xác định hoạt tính amylase phương pháp khuếch tán thạch xác định sinh khối theo phương pháp cân * Nghiên cứu đặc tính sinh lý, sinh hóa chủng vi sinh vật Khả phân giải protein, celllulose lipid: Tiến hành theo phương pháp khuếch tán thạch Khảo sát với protein, thay nguồn nitrogen casein với cellulose lipid, thay nguồn carbon tương ứng CMC (Carboxyl Kết biện luận 3.1 Tuyển chọn Với 206 chủng vi khuẩn 96 chủng xạ khuẩn có khả phân giải tinh bột phân lập từ mẫu bùn ao nuôi tôm đầm Sam - Chuồn, tiến hành tuyển chọn phương pháp khuếch tán thạch, kết thu chủng vi khuẩn V94 chủng xạ khuẩn X65 có hoạt tính amylase mạnh Hai chủng chọn cho nghiên cứu 3.2 Ảnh hưởng số điều kiện nuôi cấy đến hoạt tính amylase tích lũy sinh khối chủng vi khuẩn V94 chủng xạ khuẩn X65 3.2.1 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy Các chủng vi sinh vật nuôi cấy môi trường dịch thể tương ứng với khoảng thời gian khác Sau xác định hoạt tính amylase sinh khối khơ Bảng Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hoạt tính amylase tích lũy sinh khối chủng V94 X65 Thời gian (giờ) 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 Chủng V94 Chủng X65 D - d (mm) SKK (mg/ml) D - d (mm) SKK (mg/ml) 26,00 + 0,33 28,50 + 0,00 30,00 + 0,33 33,00 + 0,67 34,00 + 0,00 25,00 + 0,33 23,50 + 0,67 19,50 + 0,33 16,50 + 0,67 13,50 + 0,67 9,63 + 0,22 12,67 + 0,30 16,28 + 0,12 18,37 + 0,24 20,68 + 0,50 19,14 + 0,21 16,95 + 0,20 15,05 + 0,12 14,34 + 0,14 12,46 + 0,14 15,00 + 0,33 17,50 + 0,00 19,00 + 0,33 21,00 + 0,33 22,00 + 0,00 24,00 + 0,00 29,00 + 0,67 35,00 + 0,33 30,50 + 0,67 25,00 + 0,67 3,23 + 0,12 4,49 + 0,21 5,22 + 0,11 5,50 + 0,10 6,43 + 0,13 7,81 + 0,16 8,17 + 0,12 8,79 + 0,12 8,41 + 0,17 7,83 + 0,13 ("D -d": đường kính vịng phân giải, "SKK": sinh khối khô) 13 UED JOURNAL OF SOCIAL SCIENCES, HUMANITIES AND EDUCATION Kết thu cho thấy thời gian nuôi cấy tối ưu chủng V94 72 chủng X65 108 Tốc độ sinh trưởng sinh khối cực đại chủng V94 cao hẳn so với chủng X65 Tuy nhiên chủng X65 lại cho hoạt tính amylase mạnh VOL.3, NO.2 (2013) 3.2.2 Ảnh hưởng pH môi trường Chủng V94 X65 nuôi cấy môi trường dịch thể tương ứng với mức pH khác Hoạt tính amylase sinh khối khô thể Bảng Bảng Ảnh hưởng pH mơi trường đến hoạt tính amylase tích lũy sinh khối chủng V94 X65 pH 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 Chủng V94 D - d (mm) SKK (mg/ml) 19,50 + 0,67 6,28 + 0,12 24,00 + 0,67 13,01 + 0,25 32,00 + 0,33 19,69 + 0,18 36,50 + 0,00 21,09 + 0,17 34,50 + 0,33 20,45 + 0,16 28,00 + 0,00 17,04 + 0,13 21,50 + 0,67 10,45 + 0,18 Chủng X65 D - d (mm) SKK (mg/ml) 19,50 + 0,67 4,22 + 0,13 24,00 + 0,67 6,84 + 0,13 36,00 + 0,67 8,94 + 0,15 29,50 + 0,00 8,41 + 0,11 20,00 + 0,33 7.38 + 0,16 17,50 + 0,67 6,23 + 0,18 14,50 + 0,33 4,34 + 0,21 ("D -d": đường kính vịng phân giải, "SKK": sinh khối khô) Kết Bảng cho thấy pH tối ưu cho sinh trưởng phân giải tinh bột chủng V94 pH 7,5 chủng X65 pH 7,0 Cả chủng thích hợp với khoảng pH từ trung tính đến kiềm, chủng V94 ưa kiềm so với chủng X65 Mặt khác, khoảng pH khảo sát chủng sinh trưởng tốt, phổ thích nghi rộng cho phép chúng thể khả phân giải tinh bột ao nuôi với điều kiện pH khác 3.2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy Tiến hành nuôi cấy tĩnh chủng V94 X65 môi trường dịch thể tương ứng với mức nhiệt độ từ 200C đến 400C Sau xác định hoạt tính amylase sinh khối khơ Bảng Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt tính amylase tích lũy sinh khối chủng V94 X65 Nhiệt độ (0C) 20 25 30 35 40 Chủng V94 Chủng X65 D-d SKK (mg/ml) D - d (mm) SKK (mg/ml) 15,50 + 4,43 + 0,10 14,00 + 1,54 + 0,11 (mm) 18,00 + 5,27 + 0,17 17,00 + 2,62 + 0,11 0,33 0,67 25,00 + 7,54 + 0,13 24,00 + 4,39 + 0,16 0,00 0,00 23,50 + 8,27 + 0,12 26,00 + 3,83 + 0,10 0,00 0,00 16,50 + 4,64 + 0,21 19,50 + 2,78 + 0,15 0,67 0,67 0,33 0,33sinh khối khô) ("D -d": đường kính vịng phân giải, "SKK": Kết cho thấy, chủng vi khuẩn V94 tích lũy sinh khối mạnh nhiệt độ nuôi cấy 350C chủng X65 300C, chủng thể khả sinh trưởng hoạt tính enzyme amylase mạnh khoảng nhiệt độ 30 - 350C 3.2.4 Ảnh hưởng nồng độ muối NaCl Vi sinh vật nuôi cấy môi trường dịch thể tương ứng với nồng độ NaCl khác nhau, sau xác định hoạt tính amylase sinh khối khô Bảng Ảnh hưởng nồng độ NaCl đến hoạt tính amylase tích lũy sinh khối chủng V94 X65 Nồng độ NaCl (‰) 0,5 14 Chủng V94 D - d (mm) SKK (mg/ml) 35,00 + 0,33 21,09 + 0,12 36,00 + 0,00 21,45 + 0,11 Chủng X65 D - d (mm) SKK (mg/ml) 33,50 + 0,33 8,89 + 0,14 34,50 + 0,33 9,61 + 0,18 TẠP CHÍ KHOA HỌC XÃ HỘI, NHÂN VĂN VÀ GIÁO DỤC 10 15 20 25 30 37,00 + 0,33 34,50 + 0,67 28,50 + 0,00 25,00 + 0,33 20,50 + 0,33 TẬP 3, SỐ (2013) 20,24 + 0,10 15,44 + 0,35 11,13 + 0,28 7,55 + 0,28 2,37 + 0,23 35,00 + 0,00 36,00 + 0,33 25,00 + 0,67 21,00 + 0,00 18,50 + 0,33 10,24 + 0,12 8,39 + 0,14 6,85 + 0,13 5,72 + 0,13 4,87 + 0,16 ("D -d": đường kính vịng phân giải, "SKK": sinh khối khơ) X65 V94 Hình Vòng phân giải tinh bột dịch enzyme amylase tách từ chủng V94 X65 nuôi cấy điều kiện tối ưu Kết cho thấy chủng V94 X65 thích nghi với khoảng nồng độ muối NaCl rộng khoảng 0,5 - 15‰ Ở nồng độ muối cao 20 - 30‰ hai chủng có khả sinh trưởng, phát triển thể hoạt tính amylase mạnh Đây ưu điểm trội chủng giống để chúng thể khả phân giải tinh bột sử dụng làm chế phẩm xử lý ao ni 3.2.5 Đặc tính sinh lý, sinh hóa vi sinh vật - Khả phân giải hợp chất hữu Tiến hành ni cấy để thăm dị khả phân giải protein, cellulose lipid chủng V94 X65 phương pháp khuếch tán thạch đĩa Kết thể qua Bảng Hình Bảng Khả phân giải hợp chất hữu chủng V94 X65 Cơ Chất Protein Cellulose Lipid Chủng V94 KTVPG (mm) ĐKVPG (mm) 27,00 + 0,33 23,50 + 0,00 28,00 + 0,00 35,00 + 0,33 39,00 + 0,67 35,00 + 0,33 Chủng X65 KTVPG (mm) ĐKVPG (mm) 30,00 + 0,00 22,50 + 0,33 24,00 + 0,67 28,00 + 0,67 22,00 + 0,33 23,50 + 0,33 (KTVPG: kích thước vạch phân giải, ĐKVPG: đường kính vịng phân giải) Kết cho thấy, chủng V94 X65 khả phân giải tinh bột mạnh, chúng cịn có khả phân giải mạnh nguồn chất protein, cellulose lipid Khả phân giải mạnh với nhiều chất hữu khác chủng lợi lớn việc tạo chế phẩm xử lý ô nhiễm ao nuôi tôm V9 V9 Pr otein Cellul ose V9 Lip id X6 X6 X6 5 Hình Vòng phân giải protein, cellulose lipid dịch enzyme tách từ chủng V94 X65 15 UED JOURNAL OF SOCIAL SCIENCES, HUMANITIES AND EDUCATION - Khả kháng khuẩn Tiến hành thăm dò khả kháng khuẩn chủng V94 X65 loại vi sinh vật VOL.3, NO.2 (2013) kiểm định gồm B pumilus, S aureus, E coli, Vibrio sp V parahaemolyticus Kết thể qua Bảng Hình Bảng Khả kháng khuẩn chủng V94 X65 vi sinh vật kiểm định Hiệu số vịng vơ khuẩn (mm) Chủng V94 Chủng X65 0,00 22,00 + 0,33 0,00 23,00 + 0,00 0,00 27,00 + 0,67 0,00 24,50 + 0,33 0,00 29,50 + 0,33 Vi sinh vật kiểm định B pumilus (G+) S aureus (G+) E coli (G-) Vibrio sp (G-) V parahaemolyticus (G-) Vibrio sp Vibrio parahaemolytic us Hình Vịng vơ khuẩn dịch nuôi cấy chủng X65 Vibrio sp V parahaemolyticus Các thí nghiệm thăm dị bước đầu cho thấy, chủng vi khuẩn V94 khơng có khả kháng với chủng vi sinh vật kiểm định, chủng xạ khuẩn X65 lại có khả kháng với loại vi sinh vật kiểm định, đặc biệt kháng mạnh với đối tượng gây bệnh cho tôm Vibrio sp V parahaemolyticus Kết luận - Hai chủng vi khuẩn V94 xạ khuẩn X65 có khả phân giải tinh bột mạnh phân lập từ bùn ao nuôi tôm đầm Sam - Chuồn, Phú Vang, Thừa Thiên Huế - Thời gian nuôi cấy tối ưu chủng V94 72 chủng X65 108 Hai chủng sinh trưởng tốt khoảng pH từ trung tính đến kiềm yếu, nhiệt độ 30 - 350C, nồng độ NaCl tối thích 0,5 - 15 ‰ - Hai chủng V94 X65 có khả phân giải mạnh protein, cellulose lipid Chủng X65 có khả kháng với loại vi sinh vật kiểm định, đặc biệt kháng mạnh với chủng Vibrio gây bệnh cho tôm TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Nguyen Van Hop, Hoang Thai Long, Nguyen Hai Phong, Thuy Chau To (2005), Water quality of Tam Giang Cau Hai Lagoon: status, concerns and control solution, Proceedings of National Conference on Thua Thien Hue lagoon, Ministry of Science and Technology and Thua Thien Hue people's Committee: 231 - 245 [2] Ngô Thị Tường Châu, Nguyễn Ngọc Thanh (2007), Khả phân giải protein chủng vi khuẩn phân lập từ nước thải nuôi tôm Thừa Thiên Huế, Hội nghị Khoa học Quốc gia Sinh thái Tài nguyên Sinh vật, NXB Khoa học & Kỹ thuật, Hà Nội, Trang 333 - 338 [3] Phạm Thị Ngọc Lan, Nguyễn Công Minh (2005), Ảnh hưởng số điều kiện nuôi cấy đến hoạt động phân giải protein vi khuẩn phân lập từ ao nuôi tôm phá Tam Giang - Cầu Hai, tỉnh Thừa Thiên Huế, Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống, NXB Khoa học & Kỹ thuật, Hà Nội, Trang 1117 – 1120 [4] Phạm Thị Ngọc Lan, Huỳnh Ngọc Thành (2012), “Nghiên cứu nấm mốc có khả phân giải tinh bột phân lập từ ao nuôi tôm đầm Sam - Chuồn, Thừa Thiên Huế”, Tạp chí Khoa học, Đại học Huế, tập 63, số Trang 157 - 165 16 TẠP CHÍ KHOA HỌC XÃ HỘI, NHÂN VĂN VÀ GIÁO DỤC TẬP 3, SỐ (2013) [5] Phạm Thị Ngọc Lan (2012), Thực tập vi sinh vật học, NXB Đại học Huế 17 ... parahaemolyticus Kết luận - Hai chủng vi khuẩn V94 xạ khuẩn X65 có khả phân giải tinh bột mạnh phân lập từ bùn ao nuôi tôm đầm Sam - Chuồn, Phú Vang, Thừa Thiên Huế - Thời gian nuôi cấy tối ưu chủng... Thành (2012), ? ?Nghiên cứu nấm mốc có khả phân giải tinh bột phân lập từ ao nuôi tôm đầm Sam - Chuồn, Thừa Thiên Huế? ??, Tạp chí Khoa học, Đại học Huế, tập 63, số Trang 157 - 165 16 TẠP CHÍ KHOA... Với 206 chủng vi khuẩn 96 chủng xạ khuẩn có khả phân giải tinh bột phân lập từ mẫu bùn ao nuôi tôm đầm Sam - Chuồn, tiến hành tuyển chọn phương pháp khuếch tán thạch, kết thu chủng vi khuẩn V94