Phát Triển Sinh Khối Vi Rút Nhân Đa Diện (NPV) Trên Tế Bào Sâu Khoang Phục Vụ Sản Xuất Thuốc Trừ Sâu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LÊ THANH HẢI HÀ PH¸T TRIĨN SINH KhốI Virus NHÂN ĐA DIệN (NPV) TRÊN Tế BàO SÂU KHOANG PHụC Vụ SảN XUấT THUốC TRừ SÂU SINH HọC LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC HÀ NỘI - 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LÊ THANH HẢI HÀ PH¸T TRIểN SINH KhốI VIrus NHÂN ĐA DIệN (NPV) TRÊN Tế BàO SÂU KHOANG PHụC Vụ SảN XUấT THUốC TRừ SÂU SINH HäC Ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS Hồng Đình Hồ PGS.TS Lê Văn Trịnh Hà Nội - 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu nêu luận án trung thực, không trùng lặp với đề tài luận án khác chưa tác giả khác công bố Hà Nội, ngày tháng Tác giả i năm 2020 MỤC LỤC Diễn giải Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH ix MỞ ĐẦU 1.Tính cấp thiết đề tài nghiên cứu Mục đích, yêu cầu cần đạt đề tài 3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn Đối tượng phạm vi nghiên cứu Những đóng góp luận án CHƯƠNG CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Cơ sở khoa học đề tài nghiên cứu 1.2 Tổng quan tài liệu 1.2.1 Tình hình nghiên cứu nước 1.2.1.1 Nghiên cứu sâu khoang hại trồng 1.2.1.2 Nghiên cứu NPV sâu hại 1.2.1.3 Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào côn trùng 12 1.2.1.4 Nghiên cứu điều kiện phát triển sinh khối tế bào côn trùng 18 1.2.1.5 Nghiên cứu lây nhiễm NPV tế bào nhân nuôi 28 1.2.1.6 Nghiên cứu tinh thể vùi tạo dạng sử dụng chế phẩm NPV 32 1.2.2 Tình hình nghiên cứu nước 35 1.2.2.1 Nghiên cứu sâu khoang hại trồng 35 1.2.2.2 Nghiên cứu NPV sâu hại 36 1.2.2.3 Nghiên cứu nuôi nhân tế bào côn trùng 37 ii 1.2.2.4 Nghiên cứu phát triển sinh khối NPV 38 CHƯƠNG VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 43 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 43 2.1.2 Dụng cụ thiết bị nghiên cứu 43 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 44 2.2.1 Địa điểm nghiên cứu 44 2.2.2 Thời gian nghiên cứu 44 2.3 Nội dung nghiên cứu 44 2.4 Phương pháp nghiên cứu 44 2.4.1 Điều tra, đánh giá thu thập, tuyển chọn NPV sâu khoang 44 2.4.2 Nghiên cứu điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang lây nhiễm NPV tế bào nuôi nhân 48 2.4.2 Nghiên cứu điều kiện thích hợp để nhân sinh khối tế bào sâu khoang 50 2.4.2.2 Nghiên cứu lây nhiễm NPV sâu khoang tế bào nhân nuôi 54 2.4.3 Nghiên cứu tinh thể vùi tạo chế phẩm NPV dạng bột thấm nước 60 2.4.3.1 Nghiên cứu tinh thể vùi NPV sau lây nhiễm tế bào 60 2.4.3.2 Nghiên cứu phát triển chế phẩm NPV dạng bột thấm nước 61 2.4.3.3 Đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang chế phẩm tạo 2.4.4 Phương pháp tính tốn, xử lý số liệu 65 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Điều tra, đánh giá thu thập, tuyển chọn virus nhân đa diện (NPV) sâu khoang 66 3.1.1 Mức độ phổ biến khả gây chết sâu khoang virus nhân đa diện (NPV) đồng ruộng 66 3.1.2 Phân lập, tuyển chọn chủng NPV có hoạt lực cao 70 3.2 Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào sâu khoang lây nhiễm NPV tế bào nhân nuôi 77 3.2.1 Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào sâu khoang iii 78 3.2.1.1 Nghiên cứu điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang 78 3.2.1.2 Phát triển sinh khối tế bào sâu khoang qui mơ phịng thí nghiệm 88 3.2.2 Nghiên cứu phát triển sinh khối NPV sâu khoang tế bào nuôi nhân 92 3.2.2.1 Xác định điều kiện thích hợp cho lây nhiễm virus nhân đa diện ( NPV) 93 3.2.2.2 Mức độ phát triển sinh khối tế bào hình thành thể vùi trình lây nhiễm virus nhân đa diện (NPV) 101 3.2.2.3 Mức độ gây chết sâu khoang hình thành thể vùi NPV nhân tế bào sâu 105 3.2.2.4 Hiệu lực trừ sâu khoang chủng virus TL.1a nhân tế bào 107 3.3 Nghiên cứu tinh thể vùi NPV sâu khoang tạo chế phẩm dạng bột thấm nước 109 3.3.1 Tinh thể vùi NPV sâu khoang 109 3.3.2 Thử nghiệm tạo chế phẩm NPV sâu khoang dạng bột thấm nước 114 3.3.3 Đánh giá hiệu lưc phòng trừ sâu khoang chế phẩm tạo 117 3.3.3.1 Đánh giá hiệu lưc phòng trừ sâu khoang điều kiện phịng thí nghiệm 117 3.3.3.2 Đánh giá hiệu lưc phòng trừ sâu khoang bắp cải nhà lưới 117 3.3.3.3 Đánh giá hiệu lưc phịng trừ sâu khoang ngồi đồng ruộng 120 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 126 Đề nghị 127 DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 128 TÀI LIỆU THAM KHẢO 129 PHỤ LỤC iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, Diễn giải chữ viết tắt ADN Axit Deroxyribo Nucleic CT Công thức CV Coefficient of Variation (Hệ số biến động) FBS Fetal Bovin Serum (Huyết thanh) et al Những người khác MOI Multiplicity of Infection (Chỉ số lây nhiễm) nnk Những người khác NSNN Ngày sau nuôi nhân NSLN Ngày sau lây nhiễm NPV Nuclear Polyhedrosis Virus (Virus nhân đa diện) OB Occlusion Bodies (Thể vùi) PBS Photphatse Buffer Saline PIB Polyhedral shaped inclusion Bodies (Thể vùi nhân đa diện) QCVN Qui chuẩn Việt Nam TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam SDS Sodium Dodecyl Sulfate TB Trung bình v DANH MỤC BẢNG Diễn giải Trang Bảng 3.1 Mật độ sâu khoang phát sinh tỷ lệ sâu chết NPV trồng đồng ruộng (2014- 2015) 68 Bảng 3.2 Mức độ phổ biến NPV ký sinh sâu khoang trồng đồng ruộng (2014- 2105) 69 Bảng 3.3 Số thể vùi hình thành hiệu gây chết sâu khoang ngày sau lây nhiễm chủng NPV sau phân lập lần 72 Bảng 3.4 Số thể vùi hình thành hiệu gây chết sâu khoang sau lây nhiễm chủng NPV sau phân lập lần 74 Bảng 3.5 Số thể vùi hình thành hiệu gây chết sâu khoang chủng NPV điển hình sau phân lập lần thứ 75 Bảng 3.6 Số thể vùi hình thành hiệu gây chết sâu khoang chủng NPV lựa chọn 76 Bảng 3.7 Mật độ tế bào sâu khoang ngày sau nuôi nhân môi trường khác 79 Bảng 3.8 Mật độ tế bào sâu khoang nuôi nhân mức nhiệt độ khác 81 Bảng 3.9 Mật độ tế bào sâu khoang nuôi nhân mức pH môi trường khác 83 Bảng 3.10 Mật độ tế bào sâu khoang ni nhân mơi trường có bổ sung huyết FBS với tỷ lệ khác 85 Bảng 3.11 Mật độ tế bào sâu khoang nuôi nhân in vitro điều kiện thích hợp 86 Bảng 3.12 Mật độ tế bào sâu khoang nuôi nhân theo phương pháp tĩnh lắc bình lọc khuẩn 250ml 89 Bảng 3.13 Mật độ tế bào sâu khoang nuôi nhân với lượng 750ml mơi trường bình lọc khuẩn 1000ml theo phương pháp tĩnh lắc 91 Bảng 3.14 Số lượng thể vùi hình thành nhiễm NPV tế bào có mật độ khác 94 vi Bảng 3.15 Số lượng thể vùi hình thành nhiễm NPV tế bào theo số MOI khác 95 Bảng 3.16 Số lượng thể vùi hình thành sau thời gian ủ lây nhiễm NPV khác 97 Bảng 3.17 Số lượng thể vùi hình thành lây nhiễm NPV tế bào sâu khoang với loại môi trường khác 98 Bảng 3.18 Số lượng thể vùi hình thành lây nhiễm NPV tế bào sâu khoang nhiệt độ khác 99 Bảng 3.19 Số lượng thể vùi hình thành lây nhiễm NPV tế bào sâu khoang mức pH môi trường khác 101 Bảng 3.20 Mật độ tế bào sâu khoang số thể vùi hình thành sau ngày lây nhiễm NPV theo số MOI khác 104 Bảng 3.21 Hiệu lực trừ sâu khoang nguồn NPV tạo từ lây nhiễm tế bào sâu khoang 105 Bảng 3.22 Số lượng thể vùi hình thành từ nguồn NPV tạo từ lây nhiễm tế bào sâu khoang 106 Bảng 3.23 Hiệu lực trừ sâu khoang chủng NPV nhân sinh khối tế bào sâu khoang 108 Bảng 3.24 Số lượng thể vùi sâu khoang tỷ lệ thu hồi sau tinh theo phương pháp khác 111 Bảng 3.25 Các chủng NPV sâu khoang sử dụng phân tích phả hệ 113 Bảng 3.26 Thành phần phụ gia, chất lượng liều lượng sử dụng chế phẩm NPV dạng bột thấm nước 116 Bảng 3.27 Hiệu lực phòng trừ sâu khoang chế phẩm NPV sau ngày phun điều kiện phịng thí nghiệm 117 Bảng 3.28 Hiệu lực phịng trừ sâu khoang bắp cải chế phẩm NPV điều kiện nhà lưới 118 Bảng 3.29 Số lượng thể vùi hình thành sâu khoang bắp cải sau sử dụng chế phẩm NPV nhà lưới 119 vii Bảng 3.30 Hiệu lực trừ sâu khoang chế phẩm NPV-1 WP bắp cải đồng ruộng Vân Nội (Hà Nội) 121 Bảng 3.31 Hiệu lực trừ sâu khoang chế phẩm NPV-1 WP phun với liều lượng khác bắp cải đồng ruộng Vân Nội (Hà Nội) 122 Bảng 3.32 Hiệu lực trừ sâu khoang chế phẩm NPV-1 WP phun với liều lượng khác đậu tương đồng ruộng Mỹ Thành (Hà Nội) 124 Bảng 3.33 Hiệu lực trừ sâu khoang chế phẩm NPV-1 WP đậu tương Mỹ Thành (Hà Nội) 124 viii ... khả phát triển sinh khối tế bào sâu khoang lây nhiễm virus nhân đa diện (NPV) tế bào, phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học Vi? ??t Nam - Bổ sung dẫn liệu khoa học mức độ phổ biến NPV sâu khoang. .. chủng vi rút nhân đa diện (NPV) có hoạt lực cao phòng chống sâu khoang - Xác định kỹ thuật nuôi nhân tế bào sâu khoang lây nhiễm phát triển sinh khối NPV phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học... 3.2.1 Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào sâu khoang iii 78 3.2.1.1 Nghiên cứu điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang 78 3.2.1.2 Phát triển sinh khối tế bào sâu khoang qui mơ