Khảo sát hệ enzyme cellulase thu nhận từ cộng đồng vi khuẩn trong dạ cỏ bò để phân giải rơm qua xử lý​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HỆ ENZYME CELLULASE THU NHẬN TỪ CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN TRONG DẠ CỎ BÒ ĐỂ PHÂN GIẢI RƠM QUA XỬ LÝ Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS HOÀNG QUỐC KHÁNH CN.NGÔ ĐỨC Sinh viên thực hiện: DUY LƯU THÁI MSSV: 1051110075 HỊA Lớp: 10DSH02 TP Hồ Chí Minh, 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đồ án tốt nghiệp kết nghiên cứu riêng hướng dẫn TS Hoàng Quốc Khánh CN Ngô Đức Duy, không chép Nội dung luận văn có tham khảo sử dụng tài liệu, thông tin đăng tải tác phẩm, tạp chí trang web theo danh mục tài liệu đồ án Nếu sai xin chịu hoàn toàn trách nhiệm kỷ luật khoa nhà trường đề Sinh viên thực Lưu Thái Hòa LỜI CẢM ƠN Trong thời gian làm đồ án tốt nghiệp Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thủ Đức, hướng dẫn tận tình Thầy Cơ, anh chị bạn, em hồn thành tốt báo cáo Em xin cảm ơn chân thành đến: Thầy TS Hồng Quốc Khánh, trưởng phịng Vi Sinh ứng dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học Công Nghệ Việt Nam, Thầy tạo điều kiện cho em làm đồ án tốt nghiệp đây, nhiệt tình hướng dẫn hỗ trợ để em thực tốt đồ án tốt nghiệp Thầy Ngô Đức Duy phòng Vi Sinh ứng dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học Công Nghệ Việt Nam tận tình bảo giúp đỡ em suốt thời gian thực đồ án tốt nghiệp Ban giám hiệu Trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM tồn thể Thầy Cơ khoa Cơng Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường người tận tình dạy dỗ, tạo điều kiện để chúng em học tập tốt, tận tình giúp đỡ, quan tâm đến việc học tập chúng em suốt năm qua Các anh chị phịng Thí Nghiệm Vi Sinh Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học Công Nghệ Việt Nam cung cấp cho em số liệu mà em cần, em làm qui trình thực nghiệm Tất bạn lớp 10DSH02 thân yêu an ủi động viên hồn thành tốt khóa luận này, bạn quan tâm, giúp đỡ chia sẻ thứ với suốt thời sinh viên Và xin cám ơn Bố Mẹ, chị hai, em gái, người thân ln động viên con, giúp có nghị lực để hồn thành đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC BIỂU ĐỒ v DANH MỤC SƠ ĐỒ vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vi LỜI MỞ ĐẦU .1 1.Tính cấp thiết đề tài 2.Tình hình nghiên cứu 3.Mục đích nghiên cứu 4.Nhiệm vụ nghiên cứu 5.Phương pháp nghiên cứu 6.Các kết đạt đề tài 7.Kết cấu đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu cộng đồng vi khuẩn cỏ bò 1.1.1 Hệ vi sinh vật cỏ bò 1.1.2.Vi khuẩn phân giải cellulose cỏ bò 1.1.3 Điều kiện vật lý cỏ bò 1.2 Giới thiệu hệ enzym cellulase 10 1.2.1 Định nghĩa 10 1.2.2 Phân loại 10 1.2.3 Cấu tạo cellulase 11 1.2.4 Tính chất 11 1.2.5 Các chất ức chế 12 i 1.2.6 Cellulosome 12 1.3 Phân giải rơm qua xử lý 13 1.3.1 Thành phần rơm 13 1.3.2 Cấu trúc rơm tự nhiên 14 1.3.3 Các phương pháp tiền xử lý rơm rạ 15 1.3.4 Con đường phân giải rơm 17 1.4 Hiện trạng sử dụng rơm rạ Việt Nam nước giới .18 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Nguyên vật liệu 20 2.2 Thiết bị, hóa chất 21 2.2.1 Thiết bị 21 2.2.2 Hóa chất 21 2.3 Phương pháp nghiên cứu 24 2.3.1 Quy trình tăng sinh chọn lọc 25 2.3.2 Quy trình tăng sinh khảo sát nhiệt độ phát triển hệ vi sinh vật 26 2.3.3 Quy trình tăng sinh khảo sát pH phát triển hệ vi sinh vật 27 2.4 Xác định hàm lượng, hoạt tính enzyme cellulase 28 2.4.1 Quy trình phát sinh tổng hợp enzyme endoglucanase thạch đĩa CMC 28 2.4.2 Định lượng hàm lượng protein tổng dịch nuôi cấy theo phương pháp Bradford 28 2.4.3 Định lượng hoạt tính cellulase tổng số theo phương pháp Filter Paper 30 2.5 Khảo sát nhiệt độ, pH thích hợp hệ enzyme cellulase 31 2.5.1 Ảnh hưởng pH lên hoạt tính cellulase 32 ii 2.5.2 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính cellulase 32 2.6 Khảo sát trình enzyme cellulase thủy phân cellulose từ rơm rạ 32 2.6.1 Định lượng đường khử phương pháp DNS 33 2.6.2 Khả phân giải rơm rạ 34 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 35 3.1 Kết tăng sinh môi trường PCS 35 3.2 Kết khảo sát nhiệt độ phát triển hệ vi sinh vật .38 3.3 Kết khảo sát pH phát triển hệ vi sinh vật 39 3.4 Kết hàm lượng protein tổngtheo phương pháp Bradford 42 3.5 Kết đo hoạt tính cellulase tổng số theo phương pháp Filter Paper 43 3.5.1 Kết khảo sát ảnh hưởng pH lên hoạt tính cellulase 43 3.5.2 Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính cellulase 44 3.6 Kết đo lượng đường khử sau phân giải rơm theo phương pháp DNS 46 3.7 Kết phân giải rơm rạ 48 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49 4.1.Kết luận 49 4.2.Đề nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CMC carboxymeth yl cellulose DNS Acid Dinitro – Salicylic FP phương pháp filter paper mg miligram ml mililiter iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Dung dịch đệm citrate 22 Bảng 2.2 Dung dịch đệm phosphate 22 Bảng 2.3 Thông số xây dựng đường chuẩn albumin 29 Bảng 2.4 Thông số xây dựng đường chuẩn glucose 30 Bảng 3.1 Kết kiểm tra ngày phân giải giấy lọc mơi trường PCS vịng 35 38 38 39 phân giải đĩa thạch CMC 37℃, pH 7,0 Bảng 3.2 Kết khảo sát phân hủy giấy lọc CMC 37℃, pH 7,0 Bảng 3.3 Kết khảo sát phân hủy giấy lọc CMC 39℃, pH 7,0 Bảng 3.4 Kết khảo sát phân hủy giấy lọc CMC 41℃, pH 7,0 Bảng 3.5 Kết khảo sát phân hủy giấy lọc CMC pH khác .40 Bảng 3.6 Nồng độ protein tổng mẫu vi sinh vật cỏ bò 42 Bảng 3.7 Giá trị OD540nm mẫu khảo sát hoạt tính cellulase thay đổi pH từ 43 6,0 – 6,9 39℃ Bảng 3.8 Giá trị OD540nm mẫu khảo sát hoạt tính cellulase thay đổi nhiệt độ 44 37℃, 39℃, 41℃ pH tối ưu Bảng 3.9 Kết hoạt tính cellulase tổng số theo phương pháp FP 45 Bảng 3.10 Kết hàm lượng glucose dịch sau phân giải rơm mẫu enzyme cellulase 47 Bảng 3.11 Khả phân giải rơm mẫu enzyme cellulase 48 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Nồng độ protein tổng mẫu vi sinh vật cỏ bò 42 Biểu đồ 3.2 Hoạt tính cellulase tổng số mẫu enzyme cellulase 45 Biểu đồ 3.3 Hàm lượng glucose tạo thành dịch sau phân giải rơm mẫu enzyme cellulase 47 Biểu đồ 3.4 Khả phân giải rơm mẫu enzyme cellulase 48 v DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Quy trình thu nhận enzyme cellulase 20 Sơ đồ 2.2 Tóm tắt tồn thí nghiệm 24 Sơ đồ 2.3 Quy trình tăng sinh chọn lọc mẫu 25 Sơ đồ 2.4 Quy trình khảo sát nhiệt độ phát triển hệ vi sinh vật 26 Sơ đồ 2.5 Quy trình khảo sát pH phát triển hệ vi sinh vật 27 Sơ đồ 2.6 Quy trình phân giải rơm hệ enzyme cellulase 32 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hệ tiêu hóa trâu bị Hình 1.2.Protazoa với vi khuẩn bào tử nấm Hình 1.3.Ruminococcus flavefaciens Hình 1.4 Thành phần lignocellulose 13 Hình 1.5 Cấu trúc hiển vi lignocellulose 14 Hình 1.6 Cấu trúc lignocellulose 15 Hình 1.7 Cơ chế hoạt động enzyme cellulase theo Erikson 17 36 Hình 3.1 Chín mẫu cỏ bị tăng sinh 37℃, pH 7,0 Hình 3.2.Vịng phân giải đĩa thạch CMC mẫu cò bò 37℃, pH 7,0 sau 07 ngày tăng sinh môi trường PCS 37 Hình 3.3.Vịng phân giải đĩa thạch CMC mẫu cò bò 37℃, pH 7,0 sau 10 ngày tăng sinh môi trường PCS 37 Hình 3.4.Vịng phân giải đĩa thạch CMC mẫu cò bò 37℃, pH 7,0 sau 13 ngày tăng sinh môi trường PCS 37 vi Đồ án tốt nghiệp ➢ Sau ngày ➢ Sau 10 ngày Đồ án tốt nghiệp ➢ Sau 13 ngày ❖ mẫu cỏ bò 37°C, pH 7.0 chọn đầu tiên: 4, 5, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 22, 24 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC 3: Một số hình ảnh kết kiểm tra ngày phân giải giấy lọc đường kính vịng phân giải CMC bước tối ưu nhiệt độ phát triển ❖ Tại 37℃, pH 7.0 (tham khảo phụ lục 2) ❖ ➢ Sau ngày Tại 39℃, pH 7.0 Kết kiểm tra ngày phân giải giấy lọc từ bình tăng sinh PCS Kết kiểm tra đường kính vịng phân giải CMC ➢ Sau 10 ngày Đồ án tốt nghiệp Sau 13 ngày ❖ Tại 41°C, pH 7.0 ➢ Sau ngày Kết kiểm tra ngày phân giải giấy lọc từ bình tăng sinh PCS Kết kiểm tra đường kính vịng phân giải CMC Đồ án tốt nghiệp ➢ Sau 10 ngày ➢ Sau 13 ngày Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC 4: Một số hình ảnh kết kiểm tra ngày phân giải giấy lọc đường kính vịng phân giải CMC bước tối ưu pH phát triển ➢ Sau ngày Mẫu ngày phân gi M4 M5 M15 M16 Đồ án tốt nghiệp M17 M19 M20 M22 M24 10 Đồ án tốt nghiệp ➢ Sau 10 ngày Mẫu 10 ngày phân giải giấy lọc Đường kính vịng phân giải CMC M4 M5 M15 M16 11 Đồ án tốt nghiệp M17 M19 M20 M22 M24 12 Đồ án tốt nghiệp ➢ Sau 13 ngày 13 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC 5: Tối ưu điều kiện mơi trường cho hoạt tính enzyme cellulase theo phương pháp FPA Mẫu M4 M5 M15 M16 M17 M19 M20 M22 M24 ∆OD = ODsau phản ứng – ODenzyme+đệm – OD giấy lọc+đệm Từ (mg/ml) Hàm lượng đường ml mẫu= (∆ phương trình +0.055)∗ ∗ 0.74∗ Trong đó: n: độ pha lỗng enzyme (3 lần) V: thể tích mẫu đo OD (1 ml) m: khối lượng mẫu (0,5 ml) 14 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC 6: Đo lượng đường khử sau phân giải rơm theo phương pháp DNS Từ phương trình đường chuẩn glucose ta suy ta hàm lượng đường X ( +0.055)∗ ∗ (mg/ml) Hàm lượng đường ml mẫu= 0.74∗ Trong đó: n: độ pha lỗng enzyme (9,09lần) V: thể tích mẫu đo OD (1ml) m: khối lượng mẫu (1ml) • Giá trị OD 540nm sau 2, 3, ngày enzyme phân giải rơm qua xử lý Mẫu M15 M19 M24 PHỤ LỤC 7: Khả sử dụng rơm rạ % Rơm thủy phân= Mẫu M15 M19 M24 15 ị ℎủ ℎâ ∗ 100 đầ Đồ án tốt nghiệp OD PHỤ LỤC 8: Dựng đường chuẩn Bradford Glucose ➢ Đường chuẩn glucose 16 Đồ án tốt nghiệp ➢ Đường chuẩn albumin ( g/ml) 10 20 30 40 OD 50 17 ... CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu cộng đồng vi khuẩn cỏ bò 1.1.1 Hệ vi sinh vật cỏ bò 1.1.2 .Vi khuẩn phân giải cellulose cỏ bò 1.1.3 Điều kiện vật lý cỏ bò 1.2... triển cộng đồng vi sinh cỏ bị có khả sinh hệ enzyme cellulase Thu nhận tối ưu hóa điều kiện mơi trường ảnh hưởng lên hoạt tính enzyme hệ enzyme cellulase có khả phân giải cellulose Thu nhận hệ enzyme. .. 4.Nhiệm vụ nghiên cứu Chọn lọc cộng đồng vi khuẩn sinh hệ enzyme cellulase từ cỏ bị Tối ưu hóa điều kiện phát triển cộng đồng vi khuẩn cỏ bò Chọn lọc hệ enzyme cellulase tiềm Tối ưu hóa nhiệt