Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc diclofenac natri của vật liệu cellulose tạo ra từ gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường chuẩn​

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN NGUYỄN TÚ HƢƠNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC DICLOFENAC NATRI CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NI CẤY TRONG MƠI TRƢỜNG CHUẨN KHĨA LUẬ N TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời động vật Hà Nội, 20 tháng năm 2019 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN NGUYỄN TÚ HƢƠNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC DICLOFENAC NATRI CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NI CẤY TRONG MƠI TRƢỜNG CHUẨN KHĨA LUẬ N TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời động vật Ngƣời hƣớng dẫn: ThS HÀ THỊ MINH TÂM Hà Nội, 20 tháng 05 năm 2019 LỜI CẢM ƠN Lời đầu, cho phép em bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban Giám hiệu Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2; quý thầy, cô khoa Sinh-KTNN; quý thầy, cô Viện Nghiên cứu khoa học ứng dụng Trƣờng ĐHSP Hà Nội giúp đỡ em hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Em xin gửi lời biết ơn chân thành tới ThS Hà Thị Minh Tâm Vì lần vào làm nghiên cứu khoa học nên bƣớc đầu cịn nhiều bỡ ngỡ thiếu sót mặt kiến thức nhƣ kỹ năng, nhiên đƣợc bảo tận tình nên em hồn thành tốt khóa luận Khơng có thành công mà không gắn liền với hỗ trợ, em mong nhận đƣợc góp ý từ quý thầy, cô bạn sinh viên để khóa luận tốt nghiệp em hồn chỉnh Em xin chân thành cám ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Nguyễn Tú Hƣơng LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan khóa luận “Nghiên cứu khả hấp thụ thuốc Diclofenac natri vật liệu cellulose tạo từ gluconacetobacter xylinus nuôi cấy môi trƣờng chuẩn” đề tài nghiên cứu em dƣới hƣớng dẫn tận tình Ths.Hà Thị Minh Tâm Các kết quả, số liệu có đƣợc q trình nghiên cứu thân em, khơng có trùng lặp đề tài Em xin chịu trách nghiệm lời cam đoan thân có sai sót! Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2019 Sinh viên DANH MỤC TỪ Nguyễn Tú Hƣơng VIẾT TẮT BC : Cellulose vi khuẩn cs : Cộng MTC : Môi trƣờng chuẩn PC : Plant cellulose OD : Optical density VLC : Vật liệu cellulose G xylinus : Gluconacetobacter xylinus MỤC LỤC MỞ ĐẦU NỘI DUNG CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu tổng quan đối tƣợng lĩnh vực nghiên cứu 1.1.1 Giới thiệu Diclofenac 1.1.2 Tổng quan Bacterial cellulose 1.1.3 Đặc điểm phân loại Gluconacetobacter xylinum 1.2 Trình bày tổng quan tình hình nghiên cứu ngồi nƣớc 1.2.1 Trên giới 1.2.2 Ở Việt Nam CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 2.2 Phạm vi nghiên cứu 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Vật liệu nghiên cứu 2.3.2 Phương pháp chế tạo vật liệu BC 2.3.3 Phương pháp xử lý thống kê 13 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 14 3.1 Kết tạo loại vật liệu BC .14 3.1.1 Tạo màng BC từ môi trường lên men 14 3.1.2 Thu màng BC thô 14 3.1.3 Xử lý màng BC trước hấp thụ 15 3.1.4 Đánh giá độ tinh khiết màng BC 15 3.1.5 Xây dựng phương trình đường chuẩn thuốc Diclofenac 17 3.1.6 Khảo sát khả hấp thụ màng BC 17 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .23 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng nghiên cứu Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu Bảng 2.3 Thành phần thuốc khối lượng tương ứng Bảng 3.1 Giá trị OD hấp thụ thuốc màng BC (n=3) (OD – 283 nm) 19 Bảng 3.2 Lượng thuốc hấp thụ vào màng BC thời điểm 20 Bảng 3.3 Hiệu suất hấp thụ thuốc loại màng BC 21 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo thuốc Diclofenac Hình 3.1 Màng BC hình thành 14 Hình 3.2 Rửa màng vòi nước 15 Hình 3.3 Màng BC tinh chế 16 Hình 3.4 Màng BC chia vào bình tam giác 16 Hình 3.5 Phương trình đường chuẩn diclofenac 17 Hình 3.6 Chuẩn bị dịch đo quang phổ 18 Hình 3.7 Lượng thuốc hấp thụ vào màng BC có khác biệt 20 Hình 3.8 Hiệu suất hấp thụ thuốc loại màng BC .21 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Diclofenac đƣợc biết loại thuốc chống viêm khơng steroid Thuốc Diclofenac có tác dụng hạ sốt, giảm đau chống viêm, ức chế hoạt tính cyclogenase Vì vậy, giảm tạo thành prostanglandin, prostacyclin thromboxane chất trung gian trình viêm Ngồi ra, Diclofenac điều hịa đƣờng lipoxygenase kết tụ tiểu cầu Diclofenac gây hại cho đƣờng tiêu hóa làm giảm khả tổng hợp Prostaglandin gây ức chế tạo mucin (là chất bảo vệ cho đƣờng tiêu hóa) Prostaglandin chất có vai trị trì tƣới máu thận Các thuốc chống viêm không steroid ức chế tổng hợp Prostaglandin gây viêm cầu thận, hội chứng thận hƣ hoại tử nhú đặc biệt biểu rõ ngƣời bệnh thận, ngƣời suy tim Với ngƣời bệnh trên, thuốc chống viên không steroid gây suy thận cấp suy tim cấp.[5] Trong tự nhiên xuất số vi khuẩn sinh màng cellulose Nuôi cấy vi khuẩn môi trƣờng chứa glucose, glycerol số nguồn cacbon hữu khác chúng có hình thành bề mặt lớp màng cellulose sinh học khiết, hay gọi màng sinh học Bacterial cellulose (BC) BC cấu tạo sợi microfibril tạo thành bó sợi song song hình thành mạng cellulose có độ bền học, đô tinh khiết thấm hút cao BC sản phẩm trao đổi chất sơ cấp, tạo màng bảo vệ BC nguồn polymer mới, giải pháp giúp cho nhiều nhà khoa học tìm nhiều nguồn nguyên liệu nay, ứng dụng cho nhiều lĩnh vực khác nhau.[5] Với mục đích đánh giá đƣợc khả hấp thu thuốc Ranitidin vật liệu BC khảo sát đặc tính lý hóa vật liệu BC trƣớc sau hấp thụ thuốc, thực đề tài “Nghiên cứu khả hấp thụ thuốc Diclofenac natri vật liệu Cellulose tạo từ Gluconacetobacter xilinus nuôi cấy môi trƣờng chuẩn” Mục đích nghiên cứu - Mục đích nghiên cứu: Thiết kế đƣợc hệ thống màng BC lên men từ môi trƣờng chuẩn đƣợc nạp thuốc diclofenac natri Nghiên cứu khả hấp thụ thuốc tạo màng BC hấp thụ thuốc nhiều - Nhiệm vụ nghiên cứu: Chế tạo vật liệu BC, xử lý vật liệu BC trƣớc hấp thụ thuốc diclofenac natri, xác định lƣợng BC tạo thành, đánh giá độ tinh khiết vật liệu BC Khảo sát tối ƣu hóa khả hấp thụ thuốc diclofenac natri vào vật liệu BC Khảo sát đặc tính thuốc diclofenac natri trƣớc sau đƣợc hấp thụ thuốc Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu khả hấp thụ thuốc Diclofenac natri vật liệu Cellulose tạo từ Gluconacetobacter xilinus nuôi cấy môi trƣờng chuẩn Ý nghĩa khoa học thực tiễn - Ý nghĩa khoa học: Xây dựng đƣợc quy trình tạo màng BC lên men môi trƣờng chuẩn - Ý nghĩa thực tiễn: Từ kết nghiên cứu chọn đƣợc trƣờng hợp hấp thụ thuốc tốt Từ kết nghiên cứu áp dụng vào thực tiễn đời sống Tính đề tài Nâng cao khả hấp thụ thuốc diclofenac natri điều trị giảm đau, chống viêm Khắc phục nhƣợc điểm thuốc từ kết nghiên cứu áp dụng vào điều trị bệnh NỘI DUNG CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu tổng quan đối tƣợng lĩnh vực nghiên cứu 1.1.1 Giới thiệu Diclofenac -Tên quốc tế: Diclofenac -Tên biệt dƣợc: Cambia, Cataflam, Voltaren-XR, Zipsor, Zorvolex, Voltaren, Dyloject - Cơng thức: Cơng thức phân tử: C14H11Cl2NO2 Hình 1.1 Công thức cấu tạo thuốc Diclofenac - Dạng thuốc hàm lƣợng: Diclofenac thƣờng đƣợc dùng dạng muối natri Liều lƣợng tính theo diclofenac natri: Viên nén: 25mg; 50mg; 100mg Viên đạn: 25mg; 100mg Ống tiêm: 75mg/2ml; 75mg/3ml Thuốc gel bơi ngồi: 10mg/g EE: phần trăm thuốc hấp thụ vào màng Qt: lƣợng thuốc lý thuyết (mg) Qd: lƣợng thuốc lại (mg) 2.3.3 Phương pháp xử lý thống kê Xử lý liệu qua phần mềm excel 2016 phần mềm JMP phiên 9.0 Kết sau xử lý biểu diễn dạng số trung bình ± độ lệch chuẩn Kiểm định giả thiết giá trị trung bình mẫu cách sử dụng test thống kê Những khác biệt có ý nghĩa thống kê với trị số p < 0,05 13 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết tạo loại vật liệu BC 3.1.1 Tạo màng BC từ môi trường lên men Sau tuần, vi khuẩn G xylinus sử dụng chất dinh dƣỡng nhằm tổng hợp cellulose, màng BC hình thành bề mặt mơi trƣờng Độ dày màng tùy thời gian nuôi cấy 3.1.2 Thu màng BC thô - Tùy thời gian nuôi cấy thu màng có độ dày 1cm 0,5cm - Màng dẻo, chứa nhiều nƣớc, dễ tách khỏi mơi trƣờng Hình 3.1 Màng BC hình thành 14 3.1.3 Xử lý màng BC trước hấp thụ - Hấp BC thô NaOH nóng 3% nồi hấp khử trùng, nhiệt độ 1130C 10 phút, thu màng có màu vàng nâu cấy - Xử lý BC trƣớc hấp thụ để loại bỏ tạp chất môi trƣờng nuôi Màng đặt dƣới vòi nƣớc, xả nhẹ nƣớc bề mặt màng đến màng trắng Thử quỳ tím kiểm tra mơi trƣờng trung tính Thu đƣơc BC tinh khiết Hình 3.2 Rửa màng vòi nước 3.1.4 Đánh giá độ tinh khiết màng BC Màng BC tinh khiết loại 0,5cm 1cm lần lƣợt đƣợc cắt nhỏ cho vào bình thêm 50ml nƣớc cất 15 Hình 3.3 Màng BC tinh chế Hình 3.4 Màng BC chia vào bình tam giác Chia màng BC cắt vào bình tam giác đổ dung dịch thuốc Diclofenac natri - Lắc máy rung siêu âm 10 phút, chế độ lắc 200 vịng/phút 16 3.1.5 Xây dựng phương trình đường chuẩn thuốc Diclofenac Dùng phần mền Excel 2010, dựng đồ thị biểu diễn lập phƣơng trình đƣờng chuẩn diclofenac, hình 3.4.1 Hình 3.5 Phương trình đường chuẩn diclofenac Phƣơng trình đƣờng chuẩn: y=0,2432x – 0,1655 (R2 = 0,996) Trong đó, x: Nồng độ diclofenac mg/ml y: Giá trị OD tƣơng ứng với nồng độ x R: Hệ số tƣơng quan bình thƣờng 3.1.6 Khảo sát khả hấp thụ màng BC - Cho màng vào bình chứa 100ml dung dịch Diclofenac Sau cho màng vào bình, đặt bình vào máy lắc với chế độ lắc 200 vịng/phút 17 Hình 3.6 Chuẩn bị dịch đo quang phổ Sau khoảng thời gian 0,5 giờ, giờ, 1,5 giờ, lấy dung dịch đo quang phổ máy UV -2450 để xác định lƣợng thuốc vào màng, thể rõ bảng sau: 18 Bảng 3.1 Giá trị OD hấp thụ thuốc màng BC (n=3) (OD – 283 nm) Độ Đặc dày điểm màng màng 0,5cm Màng giữ nguyên Màng ép loại nƣớc 50% 1cm Màng giữ nguyên Màng ép loại nƣớc 50% Số liệu bảng 3.1 cho ta thấy giá trị OD có giảm nhƣng giảm nhẹ hay gần nhƣ khơng giảm sau Điều chứng tỏ lƣợng thuốc hấp thụ vào màng đạt cực đại Lƣợng thuốc hấp thụ vào màng cellulose vi khuẩn với độ dày khác thời điểm thể rõ bảng 3.2 hình 3.7 19 Bảng 3.2 Lượng thuốc hấp thụ vào màng BC thời điểm Các loại màng Màng chuẩn Khối lƣợng thuốc hấp thụ Từ bảng 3.2 ta thấy lƣợng thuốc hấp thụ vào màng khác không giống Màng cellulose vi khuẩn có độ dày 0,5 cm hấp thụ nhiều so với màng cellulose vi khuẩn có độ dày 1cm loại màng Màng 0,5cm Màng 1cm Hình 3.7 Lượng thuốc hấp thụ vào màng BC có khác biệt Hiệu suất thuốc hấp thụ vào màng cellulose vi khuẩn khác với độ dày màng khác với thời gian thể bảng 3.2 hình 3.8 20 Bảng 3.3 Hiệu suất hấp thụ thuốc loại màng BC Các loại màng Màng chuẩn Hình 3.8 Hiệu suất hấp thụ thuốc loại màng BC Từ bảng 3.3 ta lập biểu đồ cột so sánh hiệu suất hấp thụ thuốc vào màng BC với độ dày 0,5cm 1cm ứng với loại màng (màng giữ nguyên, màng ép loại nƣớc 50%) Qua số liệu Bảng 3.2, Bảng 3.3, phân bố biểu đồ cột Hình 3.7 Hình 3.8 cho thấy: Ở màng, hiệu suất hấp thụ thuốc màng có độ dày 0.5 cm lớn hiệu suất hấp thụ thuốc màng có độ dày 1cm Có chênh lệch hiệu suất 21 nhƣ màng có độ dày 0,5 cm mỏng màng có độ dài 1cm, sợi cellulose hơn, liên kết màng 0,5cm lỏng lẻo nên màng dễ hấp thụ thuốc - Ở loại màng, hiệu suất hấp thụ màng ép loại nƣớc 50% cao màng giữ nguyên màng mỏng, màng chứa nƣớc, liên kết màng lỏng lẻo màng xuất nhiều khoảng trống dễ hấp thụ thuốc Vì vậy, ta suy hiệu suất hấp thụ thuốc tỷ lệ thuận so với khối lƣợng hấp thụ nên màng hấp thụ đƣợc nhiều thuốc hiệu suất màng lớn xuất trƣờng hợp ngƣợc lại - Sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê 22 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Sau hồn thành xong khóa luận chúng thu đƣợc số kết nhƣ sau: Tạo đƣợc màng BC tinh khiết có độ dày lần lƣợt 0,5cm 1cm môi trƣơng chuẩn Cho màng BC nạp thuốc Diclofenac, thu đƣợc số kết luận: - Màng chuẩn hấp thụ cao Trong khoảng thời gian, loại môi trƣờng thời gian hấp thụ, màng BC có độ dày 0,5cm hấp thụ thuốc cao màng BC có độ dày 1cm Trong loại môi trƣờng thời gian hấp thụ, màng BC ép loại nƣớc 50% hấp thụ thuốc cao màng BC nguyên chất Khả hấp thụ thuốc diclofenac màng BC đạt cực đại 2giờ Kiến nghị: Tiến hành nghiên cứu khả hấp thụ thuốc Diclofenac màng BC môi trƣờng chuẩn nhằm mở rộng nguồn nguyên liệu phục vụ cho trình tạo màng BC quy mô nghiên cứu lớn Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ, chế độ lắc, sấy, hấp thời gian đến khả nạp thuốc diclofenac màng BC Từ đó, đƣa yếu tố tốt tiến hành thí nghiệm tối ƣu hóa khả hấp thụ BC 23 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Đặng Thị Hồng (2007), “Phân lập, tuyển chọn nghiên cứu số đặc tính sinh học vi khuẩn Acetobactẻ xylinum chế tạo màng sinh học (BC), Luận án thạc sĩ Sinh học ĐHSP Hà Nội [2] Đinh Thị Kim Nhung (1996), “Nghiên cứu số đặc điểm sinh học vi khuẩn Acetobacter ứng dụng chúng lên men axetic theo phƣơng pháp chìm” Luận án phó tiến sỹ khoa học sinh học [3] Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Nhƣ Quỳnh (2012) “ Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum tạo màng Bacterial cellulose ứng dụng điều trị bỏng” Tạp trí Khoa học Cơng nghệ 50 (4) (2012) 453-462 [4] Lê Hậu (2002) “Điều chế vi hạt Diclofenac phóng thích hoạt chất kéo dài thiết bị tầng sơi” Nghiên cứu Y học TP Hồ Chí Minh (tập 6).1-5 [5].Nguồn internet Tài liệu tiếng Anh [6] Halina Stanislaw Bielecki, Alina Krystynowies Marianna, Turkiewies, Kalinowska (1981), “Bacterial cellulose”, Technical University of Ldz, Stefanowskieg, Poland, 901-924 [7] Almeida I F et al (2014), „Bacterial cellulose membranes as drug delivery systems: An in vivo skin compatibility stydy”, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 86(3), pp, 332- 336 ... men từ môi trƣờng chuẩn đƣợc nạp thuốc diclofenac natri Nghiên cứu khả hấp thụ thuốc tạo màng BC hấp thụ thuốc nhiều - Nhiệm vụ nghiên cứu: Chế tạo vật liệu BC, xử lý vật liệu BC trƣớc hấp thụ thuốc. .. diclofenac natri trƣớc sau đƣợc hấp thụ thuốc Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu khả hấp thụ thuốc Diclofenac natri vật liệu Cellulose tạo từ Gluconacetobacter xilinus nuôi cấy môi trƣờng chuẩn Ý nghĩa... thuốc, thực đề tài ? ?Nghiên cứu khả hấp thụ thuốc Diclofenac natri vật liệu Cellulose tạo từ Gluconacetobacter xilinus nuôi cấy môi trƣờng chuẩn” Mục đích nghiên cứu - Mục đích nghiên cứu: Thiết kế