Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp neomycin sulfate tạo ra từ gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường chuẩn​

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN ===  === TRẦN THỊ ÁNH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP NEOMYCIN SULFATE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY TRONG MƠI TRƢỜNG CHUẨN KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chun ngành: Sinh lý học ngƣời động vật Hà Nội, 2019 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN ===  === TRẦN THỊ ÁNH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP NEOMYCIN SULFATE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY TRONG MƠI TRƢỜNG CHUẨN KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời động vật Ngƣời hƣớng dẫn: ThS Hà Thị Minh Tâm Hà Nội, 2019 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin phép bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới ThS Hà Thị Minh Tâm - người bên động viên hướng dẫn em nhiều thời gian vừa qua Em xin chân thành cảm ơn giảng viên thuộc Khoa Sinh KTNN thầy, cô Viện Nghiên cứu Khoa học Ứng dụng cung cấp cho em nhiều kiến thức tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ em để em hồn thành khóa luận Và cuối cùng, khơng thể thiếu em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cha mẹ, người thân bạn bè - người bên cạnh chia sẻ, động viên giúp đỡ em suốt trình học tập thực nghiệm khóa luận Đây lần em tham gia nghiên cứu khoa học nên tránh khỏi hạn chế thiếu sót Vì vậy, em mong nhận góp ý chân thành q thầy, bạn bè để khóa luận tốt nghiệp em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2019 Sinh viên Trần Thị Ánh LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan khóa luận “Nghiên cứu khả giải phóng thuốc vật liệu cellulose nạp Neomycin Sulfate tạo từ Gluconacetobacter xylinus ni cấy mơi trường chuẩn” tơi viết Các số liệu kết nghiên cứu hoàn tồn khách quan, tơi thực nghiệm mà có không trùng lặp với kết cơng bố Những trích dẫn từ cơng bố trước có ghi rõ ràng Nếu sai tơi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm Hà Nội,ngày 20 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Trần Thị Ánh DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT STT MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU 1 Lí chọn đề tài Mục đích nghiên cứu 3 Đối tượng phạm vi nghiên cứu .3 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn NỘI DUNG Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Vật liệu cellulose (VLC) vi sinh vật tổng hợp vật liệu cellulose 1.1.1.Vật liệu cellulose (VLC) 1.1.2 Vi sinh vật tổng hợp VLC 1.1.3 Môi trường nuôi cấy G xylinus 1.2 Tổng quan thuốc Neomycin Sulfate (NS) 1.2.1 Công thức cấu tạo 1.2.2 Tính chất lý hóa 10 1.2.3 Dược lý dược động học 10 1.2.4 Chỉ định chống định 11 1.3 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 12 1.3.1 Vật liệu cellulose (VLC) 12 1.3.2 Thuốc Neomycin Sulfate 13 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Vật liệu nghiên cứu 14 2.1.1 Hóa chất dung mơi sử dụng nghiên cứu .14 2.1.2 Thiết bị sử dụng nghiên cứu 14 2.1.3 Vật liệu làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật tạo VLC 14 2.2 Phương pháp nghiên cứu 14 2.2.1 Chuẩn bị VLC 14 2.2.2 Chế tạo VLC nạp thuốc NS 17 2.2.3 Xác định lượng thuốc giải phóng thơng qua hệ thống thiết kế 19 2.2.4 Xử lý thống kê .20 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 21 3.1 Thu VLC thô tinh chế VLC .21 3.1.1 Thu VLC thô 21 3.1.2 Tinh chế VLC .21 3.2 Xác định lượng thuốc NS nạp vào VLC 23 3.3 Xác định tỉ lệ thuốc NS giải phóng từ hệ thống thiết kế .23 3.3.1 Mật độ quang NS tiến hành giải phóng thuốc từ hệ thống thiết kế 23 3.3.2 Tỉ lệ giải phóng NS VLC hệ thống thiết kế 26 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Ứng dụng VLC Bảng 1.2 Thành phần môi trường nuôi cấy thu VLC Bảng 1.3 Thành phần dinh dưỡng cao nấm men Bảng 2.1 Thành phần môi trường chuẩn tạo VLC 15 Bảng 2.2 Môi trường đệm pH = 7,4 .17 Bảng 2.3 Mật độ quang dung dịch NS nồng độ (n = 3) .18 Bảng 3.1 Lượng thuốc NS hấp thụ vào VLC (n = 3) 23 Bảng 3.2 Mật độ quang phổ tiến hành giải phóng thuốc từ hệ thống thiết kế (n = 3) 25 Bảng 3.3 Tỉ lệ giải phóng thuốc NS từ VLC hệ thống thiết kế (n=3) 26 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc VLC Hình 1.2 Cấu trúc sợi cellulose VLC .4 Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo NS .10 Hình 2.1 Quy trình tinh chế VLC 16 Hình 2.2 Phương trình đường chuẩn NS mơi trường pH = 7,4 18 Hình 3.1 VLC thô lên men từ môi trường chuẩn 21 Hình 3.2 VLC sau tinh chế .22 Hình 3.3 Thí nghiệm kiểm tra diện protein màng 22 Hình 3.4 Hiệu chỉnh pH 23 Hình 3.5 Dùng máy khuấy từ gia nhiệt, tốc độ khuấy 50 vòng/phút, nhiệt độ 37 ± 0,50C 24 Hình 3.6 Các mẫu rút để đo quang phổ 24 Hình 3.7 Giá trị OD trung bình giải phóng thuốc NS VLC 25 Hình 3.8 Tỷ lệ giải phóng thuốc NS VLC .27 MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Trong nhiều năm trở lại đây, nhà nghiên cứu đặc biệt quan tâm tới việc ứng dụng vật liệu sinh học đời sống, chăm sóc sức khỏe Trong quan tâm trọng vật liệu cellulose (VLC) Vật liệu cellulose (VLC) sản phẩm vi khuẩn tổng hợp ra, ví dụ chủng Gluconacetobacter xylinus (G xylinus) Chúng gồm phân tử glucose liên kết với liên kết β - 1,4 glucorit (rất giống với cellulose thực vật), nhiên, VLC không chứa hợp chất cao phân tử peptin, hemicellulose, ligin sáp nến Vì thế, ngồi độ dẻo dai, bền chắc, độ đàn hồi cao, khả chịu nhiệt tốt, chúng cịn có đặc tính vượt trội như: độ tinh khiết cao, có khả hút nước cao trạng thái ẩm phục hồi, tái chế hay phân hủy hoàn toàn Trong y học, chúng quan tâm có bề mặt tiếp xúc lớn gỗ bình thường, khơng độc, khơng gây dị ứng đặc biệt khả cản khuẩn [4, 6] Ngoài VLC cịn có tác dụng giữ thuốc kéo dài thời gian giải phóng thuốc Do vậy, VLC coi hướng đường tìm nguồn nguyên liệu Trên giới, VLC ứng dụng rộng rãi sống, ví dụ như: dùng VLC làm thực phẩm, màng lọc nước, dùng làm chất mang đặc biệt cho pin lượng cho tế bào cịn làm mơi trường chất sinh học, [13] Đặc biệt y học, VLC dùng làm chất bọc vật liệu vận tải thuốc sử dụng da, làm da tạm thời trình điều trị loét da, trị bỏng làm mạch máu nhân tạo điều trị bệnh tim mạch Và lĩnh vực làm đẹp, VLC dùng làm mặt nạ dưỡng da cho người [8, 13] Ở Việt Nam, việc dùng VLC nghiên cứu ứng dụng chưa phổ biến Các nghiên cứu ứng dụng dừng lại bước đầu, chưa sâu vào bước Các nhà khoa học ni cấy thu VLC từ nhiều loại môi trường Tuy nhiên, giới, VLC lên men từ môi trường chuẩn - Đặt lên máy khuấy từ gia nhiệt nhiệt độ 37 ± 0,50C với tốc độ 50 vòng/phút - Sau khoảng thời gian 0,5 giờ, giờ, giờ, giờ, giờ, giờ, 10 giờ, 12 giờ, 24 tiến hành rút mẫu Mỗi mẫu rút ml bổ sung lại vào bình ml dung dịch đệm tương ứng - Các mẫu rút đem đo mật độ quang phổ - Lặp lại thí nghiệm lần sau tính tốn để lấy giá trị trung bình  Tỉ lệ giải phóng thuốc tính theo cơng thức [20]: R% = Trong đó: R: Tỷ lệ giải phóng thuốc Ct: Nồng độ NS dung dịch thời điểm t V1: Thể tích dung dịch đệm giá trị pH khác (900 ml) n: Số lượng mẫu lấy từ dung dịch giải phóng V2: Thể tích dung dịch đệm thêm vào (5 ml) m: Khối lượng thuốc hấp thu vào VLC 2.2.4 Xử lý thống kê Các số liệu thu lần đo thí nghiệm đưa vào phần mềm Excel 2010 biểu diễn dạng số trung bình ± độ lệch chuẩn Để biết khác biệt giá trị trung bình hai mẫu có ý nghĩa thống kê hay khơng ta dùng toán kiểm định giả thiết cách sử dụng hàm: t – Test: Two Sample Assuming Unequal Variences t – Test: Two Sample Assuming Equal Variences với mức ý nghĩa α = 0,05, khác biệt coi ý nghĩa thống kê p < 0,05 20 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thu VLC thô tinh chế VLC 3.1.1 Thu VLC thô Sau khoảng - ngày, thu VLC thơ có độ dày 0,3 cm - 0,5 cm từ dịch ni cấy tĩnh G xylinus Hình 3.1 a Màng xuất bề mặt dung dịch dinh dƣỡng b VLC thô c VLC thô d = 1,7 cm Hình 3.1 VLC thơ lên men từ mơi trƣờng chuẩn Qua Hình 3.1 thấy, VLC thơ tạo thành có màu trắng ngà, nhiều nước, dai, nhẵn dễ dàng tách khỏi dung dịch dinh dưỡng 3.1.2 Tinh chế VLC VLC thô sau tinh chế theo quy trình hình 2.1 đem đánh giá độ tinh theo tiêu chí nêu Ngồi ra, VLC tinh phải có màu trắng trong, mềm dẻo, linh hoạt, độ bền cao khả đàn hồi tốt, không bị biến đổi màu xử lý 21 nhiệt độ cao, Hình 3.2 a VLC tinh d = cm Hình 3.2 VLC sau tinh chế * Thí nghiệm kiểm tra độ tinh VLC Hình 3.3 Thí nghiệm kiểm tra diện protein màng Sau cho thuốc thử vào ống thí nghiệm có chứa VLC lắc lên dung dịch khơng bị vẩn đục Điều chứng tỏ VLC tinh 22 3.2 Xác định lƣợng thuốc NS nạp vào VLC Sau đo mật độ quang mẫu sau VLC nạp thuốc, tính tốn và xử lý số liệu Excel ta thu kết sau (Bảng 3.2): Bảng 3.1 Lƣợng thuốc NS hấp thụ vào VLC (n = 3) Độ dày màng (cm) 0,3 0,5 Như vậy, ta thấy VLC dày 0,3 cm hấp thụ thuốc (1,817 ± 0,0006501 mg) tốt VLC có độ dày 0,5 cm (1,7956 ± 0,00097 mg) 3.3 Xác định tỉ lệ thuốc NS giải phóng từ hệ thống thiết kế 3.3.1 Mật độ quang NS tiến hành giải phóng thuốc từ hệ thống thiết kế * Pha môi trường đệm pH khác Hình 3.4 Hiệu chỉnh pH 23 * Đo mật độ quang mẫu rút thời điểm VLC dày 0,3 0,5 cm sau nạp thuốc xong cho vào bình chứa 900 ml dung dịch đệm với pH khác Sau đặt bình lên máy khuấy từ gia nhiệt rút mẫu thời gian tương ứng Hình 3.5 Dùng máy khuấy từ gia nhiệt, tốc độ khuấy 50 vịng/phút, nhiệt độ 37 ± 0,50C Hình 3.6 Các mẫu đƣợc rút để đo quang phổ Sau đo xử lý số liệu Excel ta giá trị OD (y) trung bình Bảng 3.2 24 Bảng 3.2 Mật độ quang phổ tiến hành giải phóng thuốc từ hệ thống thiết kế (n = 3) Độ dày VLC (cm) Mật độ qu pH 0,5 0,0178 ± 0,0012 0,3 pH = 0,0155 ± 0,0018 0,5 0,018 ± 0,001 0,3 pH = 4,5 0,016 ± 0,0021 0,5 0,028 ± 0,0014 0,3 pH = 6,8 0,025 ± 0,0014 0,5 Từ số liệu Bảng 3.3 thu đồ thị biểu diễn giá trị OD trung bình giải phóng thuốc NS VLC sau (Hình 3.8): Hình 3.7 Giá trị OD trung bình giải phóng thuốc NS VLC 25 Số liệu Bảng 3.2 Hình 3.7 cho thấy giá trị OD trung bình tăng nhanh theo thời gian đến khoảng tăng chậm 24 OD mức cao Chứng tỏ tốc độ giải phóng NS VLC tăng nhanh đầu (chủ yếu khoảng - giờ) sau tăng chậm đạt cực đại 24 3.4.2 Tỉ lệ giải phóng NS VLC hệ thống thiết kế Từ giá trị OD trung bình bảng 3.2 ta tính tỉ lệ giải phóng NS VLC Kết sau (Bảng 3.3): Bảng 3.3 Tỉ lệ giải phóng thuốc NS từ VLC hệ thống thiết kế (n=3) Độ dày VLC (cm) pH 0,3 pH = 0,5 0,3 pH = 0,5 0,3 pH = 0,5 26 Từ số liệu Bảng 3.3 thu đồ thị biểu diễn tỉ lệ giải phóng thuốc NS VLC sau (Hình 3.9): Hình 3.8 Đồ thị tỉ lệ giải phóng thuốc NS VLC Số liệu Bảng 3.3 Hình 3.8 cho thấy: Trong khoảng từ - đầu tỉ lệ giải phóng thuốc tăng nhanh, sau tăng chậm 24 đạt cực đại Và mơi trường đệm có pH = 6,8 tỷ lệ giải phóng NS VLC cao pH = 4,5 pH = Ở pH = 6,8 ta thu tỉ lệ giải phóng thuốc đạt cực đại 24 giờ: màng dày 0,3 cm 71,02 ± 0,0091% màng 0,5 cm 63,06 ± 0,0056% Với pH = 4,5 tỉ lệ giải phóng thuốc đạt cực đại VLC 0,3 cm 57,94 ± 0,0053%, VLC 0,5 cm 54,11 ± 0,0052% 24 thấp tỉ lệ thuốc giải phóng môi trường pH = 6,8 Và thấp pH = 2, 24 tỉ lệ giải phóng đạt cực đại, nhiên, VLC 0,3cm đạt 52,82 ± 0,0024% VLC 0,5 cm đạt 45,71 ± 0,0061% Khi so sánh giá trị tỉ lệ trung bình hàm t - Test: Two Sample Asuming Unequal Variance với mức ý nghĩa α = 0,05, thu kết p < 0,05 có nghĩa sai khác tỷ lệ giải phóng thuốc sau 24 loại màng môi trường pH khác có ý nghĩa thống kê 27 Như vậy, VLC giải phóng NS pH = 6,8 cao mơi trường cịn lại đồng thời ta thấy VLC dày 0,3 cm giải phóng NS tốt so với màng dày 0,5 cm Điều giải thích rằng: - Thuốc NS hoạt động tối ưu điều kiện pH - nên pH khác 2, 4,5 6,8 tỉ lệ thuốc giải phóng mơi trường pH = 6,8 cao - Ở độ dày màng khác 0,3 cm 0,5 cm màng 0,3 cm mỏng hơn, đường thuốc ngắn nên khoảng thời gian tỉ lệ giải phóng thuốc màng 0,3 cm cao 28 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết trên, đưa số kết luận sau:  VLC thu nuôi cấy Gluconacetobacter xylinus môi trường chuẩn có độ tinh khiết cao, mềm dẻo, linh hoạt, độ bền cao, khả thấm hút giải phóng tốt  VLC nạp thuốc Neomycin Sulfate dày 0,3 cm có khả giải phóng cao VLC dày 0,5 cm  Mơi trường đệm có pH = 6,8 mơi trường tốt để giải phóng thuốc Neomycin Sulfate Kiến nghị Mở rộng nghiên cứu VLC lên men từ Gluconacetobacter xylinus khả giải phóng loại thuốc khác sở để mở rộng tiềm ứng dụng VLC, ngồi kéo dài thời gian giải phóng từ tăng sinh khả dụng loại thuốc 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1].Bộ Y tế, “Dược thư quốc gia Việt Nam”, NXB Y học, 2018 [2] Bộ Y tế (2009), “Dược Điển Việt Nam IV”, NXB Hà Nội, 2009 [3] Nguyễn Thúy Hương, Phạm Thành Hổ (2003), “Chọn lọc dịng Acetobacter xylinum thích hợp cho loại mơi trường dùng sản xuất cellulose vi khuẩn với quy mơ lớn”, Tạp chí Di truyền học & Ứng dụng, 3:49-54 [4] Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, “Phương pháp nghiên cứu sinh lý học Thực vật”, NXB ĐHQG Hà Nội [5].Nguyễn Văn Mùi (2001), “Thực hành Hóa sinh học”, NXB ĐHQG Hà Nội [6] Nguyễn Thị Nguyệt, “Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng Bacterial Cellulose làm mặt nạ dưỡng da” Luận án thạc sỹ sinh học ĐHSP Hà Nội, 2008 [7] Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như Quỳnh (2012), “Nghiên cứu vi khuẩn A xylinum tạo màng Bacteril Cellulose ứng dụng điều trị bỏng”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 50 (4), 453 - 462 [8] Nguyễn Văn Thanh (2006), “Nghiên cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ Acetobactor xylinum”, Đề tài Khoa học Công nghệ cấp Bộ Y tế [9] Nguyễn Xuân Thành, Triệu Nguyên Trung, Phan Thị Huyền Vy, Bùi Minh Thy, Phùng Thị Kim Huệ (2018), “Tối ưu hóa hiệu suất nạp thuốc famotidin vật liệu cellulose vi khuẩn lên men từ dịch trà xanh theo phương pháp đáp ứng bề mặt mơ hình Box-Behnken”, Tạp chí Dược học (501 - tr3) Tài liệu tiếng Anh [10] Selman A., Waksman (1949), "Neomycin - production and antibiotic properties" Journal of Clinical Investigation 28 (5): 934 30 [11] Blanchard C et al (2015), “Neomycin Sulfate Improves the Antimicrobial Activity of Mupirocin-based Antibacterial Ointments”, Antimicrob Agents Chemother, pii: AAC, 02083 - 15 [12] Lina Fu, Yue Zhang, Chao Li, Zhihong Wu, Qi Zhuo, Xia Huang, Guixing Qiu, Ping Zhou and Guang Yang (2012), “Skin tissue repair materials from bacterial cellulose by a multilayer fermantation method” [13] Lin Huang, Xiuli Chen, Thanh Nguyen Xuan, Huiru Tang, Liming Zhang (2013), “Yang Nano - cellulose 3D - networks as controlled release drug carriers”, 1(23), 2976 - 84 [14] Amita H Patel L and Riddhi M Dave (2015), “Formulation anh evaluation of sustained release in situ ophthalmic gel of neomycin sulphate”, Bulletin of Pharmaceutical Research ;5(1):1-5 [15] Muhammad MA et al (2014), “A review of bacterial cellulose-based drug delivery systems: their biochemistry, current approaches and future prospects”, Journal of Pharmacy and Pharmacology, 66, pp 1047 – 1061 [16] Hestrin S., Schramm M (1954), “Synthesis of cellulose by Acetobacter xylinum, Preparation of freeze - dried cells capable of polymerizing glucose to cellulose”, Biochem J 58 (2): 345 - 352 Jong S C et al (2015), “Novel neomycin sulfate-loaded hydrogel [17] dressing with enhanced physical dressing properties and wound-curing effect”, Drug Deliv [18] United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, National Nutrient Database for Standard Reference Release 28 “Basic Report: 43406, Yeast extract spread” [19] Thanh Xuan Nguyen et al (2014), “Chitosan – coated nano – liposomes for the oral delivery of berberin hydrochloride”, J Mater Chem B, 2, 7149 -7159 Pedersoli WM et al (1994), “Disposition and bioavailability of [20] 31 neomycin in Holstein calves”, J Vet Pharmacol Ther 17 (1), - 11 Tài liệu Internet https://www.rxlist.com/neomycin-sulfatedrug.htm#medguide [21] [22] https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/62403 32 ... phóng từ tăng sinh khả dụng thuốc Tôi định chọn đề tài nghiên cứu: ? ?Nghiên cứu khả giải phóng thuốc vật liệu cellulose nạp Neomycin Sulfate tạo từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy môi trƣờng chuẩn”... đoan khóa luận ? ?Nghiên cứu khả giải phóng thuốc vật liệu cellulose nạp Neomycin Sulfate tạo từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy mơi trường chuẩn” tơi viết Các số liệu kết nghiên cứu hoàn toàn... - KTNN ===  === TRẦN THỊ ÁNH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP NEOMYCIN SULFATE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY TRONG MƠI TRƢỜNG CHUẨN KHĨA LUẬN