Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp neomycin sufate tạo ra từ gluconacetobacter xilinus nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo​

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN ===  === CAO THỊ MAI NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP NEOMYCIN SUFATE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XILINUS NUÔI CẤY TRONG MƠI TRƢỜNG NƢỚC VO GẠO KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời động vật HÀ NỘI - 2019 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN ===  === CAO THỊ MAI NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP NEOMYCIN SUFATE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XILINUS NI CẤY TRONG MƠI TRƢỜNG NƢỚC VO GẠO KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời động vật Ngƣời hƣớng dẫn khoa học THS HÀ THỊ MINH TÂM HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn cô: ThS Hà Thị Minh Tâm – Người bảo, tận tình hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ em nhiều để em thực hồn thành tốt khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn tới thầy, cô giáo tổ môn, khoa SinhKTNN, Viện nghiên cứu khoa học Ứng dụng trường đại học Sư phạm Hà Nội tạo điêu kiện giúp đỡ em trình thực nghiệm để em hồn thành khóa luận Trong q trình thực nghiên cứu thân em có nhiều cố gắng nhiên kiến thức em hạn chế Do đó, đề tài nghiên cứu em khơng tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận tất góp ý, phản hồi quý thầy cô bạn sinh viên đề tài nghiên cứu em hoàn thiện Cuối em xin bày tỏ tới người bạn gia đình em quan tâm, cổ vũ tinh thần khích lệ em, tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian qua Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Cao Thị Mai LỜI CAM ĐOAN Tôi: Cao Thị Mai xin cam đoan tính trung thực đề tài: Thứ nhất: Đề tài “Nghiên cứu khả giải phóng thuốc vật liệu cellulose nạp Neomycin sufate tạo từ Gluconacetobacter xilinus nuôi cấy môi trường nước vo gạo” cơng trình nghiên cứu riêng đạo hướng dẫn trực tiếp ThS Hà Thị Minh Tâm Thứ hai: Các số liệu, kết nêu khóa luận trung thực chưa công bố đâu Thứ ba: Chắc chắn đề tài không trùng với đề tài khác Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Cao Thị Mai VLC ThS OD PC h MỤC LỤC MỞ ĐẦU L chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Nhiệm vụ nghiên cứu Đối tượng phạm vi nghiên cứu .3 nghĩa khoa học nghĩa thực ti n Phương pháp nghiên cứu .4 CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .5 1.1 Tổng quan vật liệu cellulose (VLC) Đặc điểm cấu trúc VLC 1.1.2 Tính chất độc đáo VLC 1.1.3 Ứng dụng VLC .6 1.2 Tổng quan thuốc Neomycin sulfate .7 1.2.1 Neomycin sulfate 1.2.2 Tính chất lí hóa 2.3 Dược l chế tác dụng 1.2.4 Chỉ định chống định thuốc Neomycin sulfate .9 1.3 Tình hình nghiên cứu giới Việt Nam 10 1.3.1 Trên giới 10 1.3.2 Tại Việt Nam .11 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Vật liệu nghiên cứu 12 2.2 Máy móc, thiết bị nghiên cứu 12 2.3 Phương pháp nghiên cứu 13 2.3.1 Bố trí thí nghiệm 13 2.3.2 Chuẩn bị VLC 13 2.3.3.Đánh giá độ tinh khiết màng 14 2.3.4 Phương pháp dựng đường chuẩn 15 2.3.5 Phương pháp chế tạo VLC nạp Neomycin sulfate 16 2.3.6 Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng VLC nạp thuốc Neomycin sulfate 18 2.3.7 Phương pháp thống kê xử lý kết 19 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 20 3.1 Kết tạo VLC từ môi trường nước vo gạo 20 3.2 Tinh chế VLC 21 3.3 Xác định lượng thuốc Neomycin sulfate nạp vào VLC 21 3.4 Xác định lượng thuốc Neomycin sulfate giải phóng khỏi VLC 22 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần môi trường lên men tạo VLC 13 Bảng 2.2 Mật độ quang (OD) trung bình dung dịch Neomycin sulfate nồng độ khác bước sóng 277nm 15 Bảng 2.3 Môi trường đệm PBS (pH = 7,4) 17 Bảng 3.1 Kết thu VLC tươi 20 Bảng 3.2 Lượng thuốc hấp thụ vào VLC với độ dày khác 21 Bảng 3.3 Mật độ quang tiến hành giải phóng thuốc thời điểm khác môi trường pH khác .23 Bảng 3.4 Tỉ lệ giải phóng thuốc VLC có độ dày 0,3 cm 0,5 cm môi trường pH khác khoảng thời gian khác (%) (n =3) .25 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo neomycin [1] .7 Hình Sơ đồ biểu di n quy trình ni cấy thu nhận VLC 14 Hình 2.2 Phương trình đường chuẩn Neomycin mơi trường dung dịch đệm PBS (pH = 7,4) 16 Hình 3.1 Nuôi cấy VLC từ môi trường nước vo gạo 20 Hình 3.2 VLC sau tinh chế .21 Hình 3.3 Lượng thuốc Neomycin sulfate giải phóng khỏi VLC 22 Hình 3.4 Biểu đồ so sánh mật độ quang (OD) lượng thuốc giải phóng VLC 0,3 cm 0,5 cm môi trường pH khác (n = 3) 23 MỞ ĐẦU Lý chọn đ tài Neomycin phát vào năm 949 Selman Waksman phịng thí nghiệm Neomycin loại kháng sinh aminoglycoside chống lại vi khuẩn thể phổ rộng mà việc sử dụng giới hạn đường uống bơi [1] Neomycin có hấp thu miệng tối thiểu việc sử dụng khơng liên quan đến trường hợp tổn thương gan cấp tính Neomycin sử dụng để giảm nguy nhi m trùng trình phẫu thuật đường ruột bạn, Neomycin sử dụng để giảm triệu chứng hôn mê gan Trong việc sử dụng không cần thiết lạm dụng loại kháng sinh dẫn đến làm giảm hiệu thuốc Neomycin sử dụng với chế độ ăn uống đặc biệt để điều trị vấn đề nghiêm trọng định não Tình trạng gây nhiều chất tự nhiên (amoniac) Thông thường, gan loại bỏ amoniac, bệnh gan gây nhiều amoniac tích tụ thể Thuốc giúp điều trị bệnh não cách tiêu diệt số vi khuẩn đường ruột tạo amoniac Q trình sử dụng Neomycin sulfate có tác dụng làm giảm bớt nguy nhi m trùng sau phẫu thuật đường ruột Nó sử dụng để điều trị phát triển mức vi khuẩn đường ruột nhỏ, Neomycin độc với thận (gây tổn thương thận), so sánh với Aminoglycosid khác Trường hợp ngoại lệ số lượng Neomycin nhỏ chất bảo quản số vắc-xin thường 25 μg liều Neomycin sulfate tác nhân kháng khuẩn hữu ích để điều chị vết thương Tuy nhiên, số nhược điểm kem Neomycin sulfate gây làm ảnh hưởng đến phương pháp điều trị khả thảm thấu qua da đạt không cao 45%, nhanh bị khô bề mặt da….[ ] Vật liệu Cellulose (VLC) sản phẩm số loài vi khuẩn, đặc biệt chủng Gluconacetobacter xylinus Mặc dù có chung cơng thức phân tử (C6H10O5) n với cellulose thực vật (PC), VLC khơng có lignin, hemiaelluloses pectin, thường có cellulose có nguồn gốc thực vật; lọc VLC trình d dàng, lượng thấp lọc PC V1: Thể tích dung dịch đệm giá trị pH khác n: Số lượng mẫu lấy từ dịch giải phóng V2: Thể tích dung dịch đệm thêm vào m: khối lượng thuốc màng ban đầu 2.3.7 Phương pháp thống kê xử lý kết Các số liệu kết nghiên cứu phân tích xử lí thơng qua phần mềm Excel 20 biểu thị số trung bình ± độ lệch chuẩn Số trung bình cộng kết lần lặp lại thí nghiệm Những khác biệt coi có nghĩa thống kê giá trị p < 0,05 19 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết tạo VLC từ môi trƣờng nƣớc vo gạo VLC tạo nhờ vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus: Ban đầu vi khuẩn tiếp xúc thích nghi với môi trường, pH môi trường giảm nhẹ axit vi khuẩn sinh Đến ngày thứ 2, thấy xuất lớp màng có màu trắng đục lẫn nhiều tạp chất, chứa nhiều nước, chất dẻo dai Lớp màng tiếp tục dày lên môi trường hết chất dinh dưỡng Vật liệu cellulose d tách khỏi môi trường nuôi cấy Nhờ vào độ dày môi trường khác thời gian nuôi cấy khác nên ta thu vật liệu có độ dày khác Như mà ta tạo màng có độ dày mong muốn Sau khoảng thời gian ni cấy, vật liệu có độ dày khác thể Bảng 3.1 Bảng 3.1 Kết thu VLC tƣơi Lô a, b, Hình 3.1 Ni cấy VLC từ mơi trƣờng nƣớc vo gạo a, VLC ủ t nh buồng nuôi cấy tế bào 260C b, VLC lên men ngày thứ 20 3.2 Tinh chế VLC Sau thu, VLC cần phải tinh chế nhằm loại bỏ tạp chất môi trường nuôi cấy, trung hòa phá hủy độc tố vi khuẩn, giúp màng hấp thụ thuốc cách tối đa Tinh chế VLC bước quan trọng thiếu trước màng đưa vào giải phóng thuốc Hình 3.2 VLC sau tinh chế 3.3 Xác định lƣợng thuốc Neomycin sulfate nạp vào VLC Sử dụng VLC tạo có độ dày 0,3 cm 0,5 cm sau tiến hành rung động 2h, 400C lấy dung dịch đo quang phổ máy UV – 2450 để xác định lượng thuốc hấp thụ vào màng, từ xác định nồng độ thuốc, xác định lượng thuốc dung dịch Lượng thuốc hấp thụ vào màng thể Bảng 3.2 Bảng 3.2 Lƣợng thuốc hấp thụ vào VLC với độ dày khác Độ dày VLC (cm) 0,3 0,5 21 3.4 Xác định lƣợng thuốc Neomycin sulfate giải phóng khỏi VLC Sau hấp thụ thuốc tối đa, VLC đưa vào bình chứa dung dịch đệm có pH tương ứng là: 2,0; 4,5; 6,8 với bình dung tích khoảng 900 ml Sử dụng máy thử độ hòa tan với tốc độ khuấy 50 vòng/phút, nhiệt độ 37°C để xác định lượng thuốc Neomycin sulfate giải phóng Với mốc thời gian giải phóng: 0,5h; 1h; 2h; 4h; 6h; 8h; 12h; 24h tương ứng với rút ml mẫu đo quang phổ lúc ta bổ sung ml dung dịch đệm a, b, Hình 3.3 Lƣợng thuốc Neomycin sulfate giải phóng khỏi VLC a, VLC đƣợc giải phóng máy thử độ hòa tan b, Mẫu rút mốc thời gian để đo quang phổ (OD) Giá trị OD (y) trung bình sau lặp thí nghiệm lần Bảng 3.3 22 Bảng 3.3 Mật độ quang tiến hành giải phóng thuốc thời điểm khác môi trƣờng pH khác Thời gian Độ dày VLC pH 0,3 cm 0,5 cm 0,3 cm 4,5 0,5 cm 0,3 cm 6,8 0,5 cm Dựa vào Bảng 3.3: sử dụng phần mềm Excel 20 để vẽ đồ thị khả giải phóng thuốc Neomycin sulfate VLC -Neomycin sulfate vật liệu có độ dày 0,3 cm 0,5 cm; khoảng thời gian môi trường pH khác thể Hình 3.4: 0,25 OD 0,2 pH=2 0.3cm Hình 3.4 Biểu đồ so sánh mật độ quang (OD) lượng thuốc giải phóng VLC 0,3 cm 0,5 cm môi trường pH khác (n = 3) 23 Quan sát kết từ Bảng 3.3 Hình 3.4 ta rút nhận xét: Các môi trường đệm pH 2; 4,5; 6,8 giá trị OD (y) trung bình thuốc Neomycin sulfate giải phóng từ VLC có xu hướng tăng dần khơng có tượng giảm mạnh qua mẫu vật liệu 0,3 cm 0,5 cm giá trị tăng tới thời điểm định Chứng tỏ lượng thuốc Neomycin sulfate giải phóng liên tục qua pH chủ yếu thời điểm 6-8 đầu, sau khoảng thời gian 6-8 lượng thuốc giải phóng ít, đến thời điểm từ khoảng trở không đáng kể Từ sơ đồ ta thấy thời điểm giải phóng thuốc Neomycin sulfate từ VLC đạt cực đại tốt khoảng thời điểm 24 D dàng nhận thấy môi trường pH mẫu vật liệu độ dày 0,3 cm 0,5 cm pH = 6,8 giải phóng tốt mơi trường pH cịn lại, chứng tỏ mơi trường trung tính thích hợp cho hịa tan Neomycin sulfate Giữa VLC có độ dày 0,3 cm VLC có độ dày 0,5 cm VLC 0,3 cm lượng thuốc giải phóng cao Do VLC có độ dày nên đường thuốc khỏi màng chậm Từ giá trị Bảng 3.3 áp dụng công thức (1), (2), (3) (4) ta xác định tỉ lệ giải phóng thuốc VLC có độ dày, thời gian mơi trường pH khác Kết ghi lại Bảng 3.4 24 Bảng 3.4 Tỉ lệ giải phóng thuốc VLC có độ dày 0,3 cm 0,5 cm môi trƣờng pH khác khoảng thời gian khác (%) (n =3) pH Độ 0,3 cm 0,5 cm 4,5 0,3 cm 0,5 cm 6,8 0,3 cm 0,5 cm Nhận xét: Theo số liệu từ bảng 3.4 qua mốc thời gian ta thấy tỉ lệ thuốc giải phóng tăng dần, mơi trường đệm pH = 6,8 màng có khả giải phóng thuốc cao sau tới pH = 4,5 thấp pH = Ở hầu hết VLC dày 0,3 cm VLC dày 0,5 cm lượng thuốc giải phóng hầu hết đạt cực đại khoảng 24 môi trường đệm Ở pH = ta thu kết tỉ lệ giải phóng cao 24 VLC 0,3 cm 52,47% VLC 0,5 cm 45,58% 25 Tương tự, pH = 4,5 ta thu kết tỉ lệ giải phóng thuốc đạt cực đại 24 giờ, VLC 0,3 cm 57,14% VLC 0,5 cm 53,57% pH = 6,8 tỉ lệ giải phóng thuốc đạt cực đại VLC 0,3 cm 69,36%, VLC 0,5 cm 61,88% Như vậy, lượng thuốc giải phóng nhiều VLC có độ dày 0,3 cm môi trường pH = 6,8 đạt 69,36% Sử dụng hàm t-Test (Two Sample Asuming Unequal Variances) để so sánh giá trị tỉ lệ trung bình với mức nghĩa α = 0.05, thu kết P < 0.05 ta thấy sai khác tỉ lệ giải phóng thuốc sau 24 loại màng có nghĩa thống kê Như sử dụng VLC làm hệ thống vận chuyển phân phối thuốc, thời gian giải phóng kéo dài tới 24 ngồi thể, dùng VLC để giải phóng thuốc Neomycin sulfate qua đường uống, giúp thuốc giải phóng kéo dài, tăng sinh khả dụng 26 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Qua q trình thực nghiên cứu đề tài khóa luận, thân em thu hoạch số kết sau: VLC tạo từ Gluconacetobacte xilinus lên men từ mơi trường nước vo gạo có độ dày 0,3 cm sau 4-5 ngày 0,5 cm sau 6-8 ngày; Lượng thuốc Neomycin sulfate giải phóng tốt khoảng 6-8 đầu cao thời điểm 24 giờ; Trong suốt q trình giải phóng thuốc, VLC có độ dày 0,3 cm giải phóng thuốc cao so với màng có độ dày 0,5 cm cao mơi trường đệm có pH = 6,8 đạt 69,36% Kiến nghị: Tạo điều kiện hội để tiếp tục nghiên cứu khả hấp thụ giải phóng thuốc Neomycin sulfate VLC tạo chủng Gluconacetobacter xylinus từ nhiều loại môi trường khác Tiếp tục đưa nghiên cứu khả hấp thụ giải phóng loại thuốc khác VLC nhằm giảm hạn chế tăng ưu điểm loại thuốc 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tiếng Việt Bộ Y tế (2007), Dược thư quốc gia Việt Nam, Nxb Y học Đặng Thị Hồng Phân lập, tuyển chọn nghiên cứu số đặc tính sinh học vi khuẩn Acetobacter xylinum chế tạp màng sinh học (CVK) Luận án thạc sỹ Sinh học ĐHSP Hà Nội, 2007 Đinh Thị Kim Nhung Nghiên cứu số đặc điểm sinh học vi khuẩn Acetobacter ứng dụng chúng lên men axetic theo phương pháp chìm Luận án phó tiến sỹ khoa học sinh học, 1996 Nguy n Thị Nguyệt Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng Bacterial cellulose làm mặt nạ dưỡng da Luận án thạc sỹ sinh học ĐHSP Hà Nội, 2008 Nguy n Thu Hương, “ Chọn lọc dịng Acetobacter xylinum thích hợp cho môi trường dùng sản suất cellulose” Tạp chí Di truyền học ứng dụng, số 3, 2003 Nguy n Văn Thanh (2006), “Nghiên cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ Acetobactor xylinum”, đề tài cấp bộ, Bộ Y tế - Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh Nguy n Văn Mã, La Việt Hồng,Ong Xuân Phong (2013), Phương pháp nghiên cứu sinh lí học thực vật B Tiếng Anh Amin MCIM, Ahmad N, et al (20 2), “Bacterial cellulose film coating as drug delivery system: physicochemical, thermal and drug release properties”, SainMalaysiana, , 56 – 568 Almeida I.F et al (20 4), “Bacterial cellulose membranes as drug delivery systems: An in vivo skin compatibility study”, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 86 (3), 332-336 10 Bhavana V et al (20 6), “Study on the drug loading and release potential of bacterial cellulose”, Cellulose Chem Technol, 50(2), –223 11 Blanchard C et al (20 5), “Neomycin sulfate improves the antimicrobial activity of mupirocin based antibacterial ointments”, Antimic Chemother, pii: AAC, – 15 12.Brown R M ( 999), “Pure Appl”, Chem, (5) 13 Huang L et al (20 3), “Nano-cellulose 3D-networks as contro drug carriers”, J Mater Chem B, (23), 2976-2984 Klemm D et al (200 ), “Bacterial synthesized cellulose – arti vessels for microsurgery”, Prog Polym Sci, 26, 56 –1603 15 Klemm D et al (2009), “Nanocellulose materials – different cellulose, different functionality”, Macromol Symp, 280, 60–71 16 Lin Huang, Xiuli Chen, Thanh Nguyen Xuan, Huiru Tang, Liming Zhang and Guang Yang Nano-cellulose 3D-networks as controlled-release drug carriers năm 20 Srivastava A K et al (2005), “Floating microspheres of Cimetidin: Formulation, characterization and in vitro evaluation”, Actapharm, 55, 277 – 285 Silva NHCS et al (20 4), “Topical caffeine delivery using biocellulose membranes: a potential innovative system for cellulite treatment”, Cellulose, 21, 665- 674 Trovatti E et al (20 ), “Biocellulose membranes as supports for dermal release of lidocaine”, Biomacromolecules, 2, 62 - 4168 20 Wan, Y.Z., Luo, H., He, F., Liang, H., Huang, Y., & Li, X L (2009), “Mechanical, moisture absorption, and biodegradation behaviours of bacterial cellulose fibre-reinforced starch biocomposites”, Composites Science and Technology 69(7-8): 1212-1217 21 Wippermann, J., Schumann, D., Klemm, D., Kosmehl, H., SalehiGelani, S., & Wahlers, T (2009), “Preliminary Results of Small Arterial Substitute Performed with a New Cylindrical Biomaterial Composed of Bacterial Cellulose”, European Journal of Vascular and Endovascular Surgery 37(5): 592-596 22 Franco I (2000), “Oral Cimetidin for the management of genital and perigenital warts in children”, J Urol., 64, 074 – 1075 23 Nguyen TX et al (20 4), “Chitosan-coated nano-liposomes for the oral delivery of berberine hydrochloride”, J Mater Chem B, 2, 49– 7159 ... Gluconacetobacter xilinus nuôi cấy môi trường nước vo gạo ” Mục đích nghiên cứu Tạo vật liệu cellulose từ Gluconacetobacte xilinus nuôi cấy từ môi trường nước vo gạo Thiết kế hệ thống gồm VLC nạp thuốc khảo... Thứ nhất: Đề tài ? ?Nghiên cứu khả giải phóng thuốc vật liệu cellulose nạp Neomycin sufate tạo từ Gluconacetobacter xilinus nuôi cấy môi trường nước vo gạo” cơng trình nghiên cứu riêng tơi đạo... ===  === CAO THỊ MAI NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE NẠP NEOMYCIN SUFATE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XILINUS NUÔI CẤY TRONG MƠI TRƢỜNG NƢỚC VO GẠO KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP