Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa và ức chế quá trình tổng hợp hắc tố ở loài ô dược (lindera myrrha)​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HỐ VÀ ỨC CHẾ Q TRÌNH TỔNG HỢP HẮC TỐ Ở LỒI Ơ DƯỢC (Lindera myrrha) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN HOÀNG DŨNG ThS LÊ QUỲNH LOAN Sinh viên thực MSSV: 1311100730 : VÕ THỊ THUẬN Lớp: 13DSH02 TP Hồ Chí Minh, 2017 Đồ án tốt nghiệp CAM ĐOAN Người thực đề tài xin cam đoan đề tài cơng trình nghiên cứu riêng người thực đề tài hướng dẫn khoa học TS Nguyễn Hoàng Dũng Ths Lê Quỳnh Loan Các số liệu, kết luận án trung thực Mọi tài liệu tham khảo dùng đề tài trích dẫn rõ ràng tên tác giả, tên cơng trình, thời gian, địa điểm công bố Tất nội dung, chép không hợp lệ, vi phạm quy chế đào tạo, không trung thực, người thực đề tài xin chịu hồn tồn trách nhiệm TP Hồ Chí Minh, Ngày 18 tháng năm 2017 Sinh viên thực Võ Thị Thuận i Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Lời em xin chân thành cám ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Công Nghệ TP.HCM, Ban chủ nhiệm môn Công nghệ sinh học thầy, cô môn Công nghệ sinh học trường Đại học Công Nghệ TP.HCM tận tình truyền đạt kiến thức quý báu kĩ để em hoàn thành tốt q trình học tập, hồn thành khóa luận làm tảng chuẩn bị cho công việc sau Trong suốt khoảng thời gian làm đề tài tốt nghiệp phòng Vi sinh - Viện Sinh học Nhiệt đới Em xin chân thành gửi lời cám ơn đến: TS Hồng Quốc Khánh, trưởng phịng vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học Công Nghệ Việt Nam, Thầy tạo cho em làm đề tài TS Nguyễn Hoàng Dũng gợi ý đề tài, tận tình hướng dẫn chi tiết cơng việc, theo sát dẫn, động viên em, hỗ trợ kinh phí suốt q trình làm khóa luận ThS Lê Quỳnh Loan hướng dẫn tận tình, giúp đỡ hỗ trợ em suốt thời gian làm đề tài tốt nghiệp Thầy Ngô Đức Duy tạo điều kiện, hỗ trợ em làm đề tài tốt nghiệp Em xin chân thàh cám ơn Nguyễn Hồi Hương, phịng Vi sinh, khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, Trường Đại học Công Nghệ TP HCM tận tình giúp đỡ em trình nhận đề tài Cám ơn tập thể lớp 13DSH02 em trao đổi, học tập suốt bốn năm trường Đại học Công Nghệ TP.HCM, cám ơn tập thể phòng Vi sinh – Viện Sinh học Nhiệt đới động viên hết lòng giúp đỡ em suốt q trình thực khóa luận Cuối cùng, gửi lời cám ơn sâu sắc đến Ba Mẹ sinh nuôi dạy con, cám ơn anh chị gia đình ln bên cạnh động viên em suốt trình học tập trưởng thành ii Đồ án tốt nghiệp Vì kiến thức thân cịn hạn chế, q trình nghiên cứu, hồn thiện đề tài em khơng tránh khỏi sai sót, kính mong nhận ý kiến đóng góp từ phía q Thầy Cơ Tp Hồ Chí Minh, Ngày 18 tháng năm 2017 Sinh viên thực Võ Thị Thuận iii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC CAM ĐOAN LỜI CÁM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH MỞ ĐẦU đề…………………………………………………………………1 cứu…………………………………………………… cứu…………………………………………………… cứu…………………………………………………… cứu………………………………………………….4 được………………………………………………………… Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài………………………………….5 Kết cấu Đồ án tốt nghiệp……………………………………………… CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .6 1.1 Giới thiệu chung chi Lindera (Họ Lauraceae) iv Đồ án tốt nghiệp 1.1.1 Chi Lindera (Họ Lauraceae) 1.1.2 Nghiên cứu thành phần hoá học 1.2 Tổng quan ô dƣợ 1.2.1 Phân loại khoa học 1.2.2 Đặc điểm thực vật 1.2.3 Thành phần hoá học 1.2.4 Công dụng theo y học dân gian 1.3 Tổng quan trình 1.3.1 Ảnh hưởng tia cực tím (UV) người 1.3.2 1.3.3 Vai trò melanin 1.3.4 1.3.5 Con đường tổng hợp hoá học melanin 1.3.6 Các lại bênh liên quan đến sắc tố 1.3.7 Một số hoạt chất ức chế trình tổng hợp melanin 1.4 Tổng quan chiết xuấ 1.4.1 Chiết xuất dược liệu 1.4.2 Phương pháp chiết xuất 1.4.3 1.5 Hoạt tính kháng oxy ho 1.5.1 Khái niệm gốc tự 1.5.2 Phương pháp nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá 1.6 Sắc ký lỏng hiệu c CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm thời gian n 2.2 Vật liệu nghiên cứu 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.2.2 2.2.3 v Đồ án tốt nghiệp 2.3 Quy trình thực 40 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 41 2.4.1 Phương pháp thu xử lý mẫu 41 2.4.2 Quy trình chiết thu nhận cao chiết 41 2.4.3 Phương pháp xác định thành phần hoá học 43 2.4.4 Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự (DPPH assay) .47 2.4.5 Phương pháp nuôi cấy tế bào (B16F10) 49 2.4.6 Phương pháp xác định độc tính 49 2.4.7 Phương pháp xác định hàm lượng melanin 49 2.4.8 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC 50 2.4.9 Xử lý số liệu 51 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52 3.1 Kết thu nhận cao tổng methanol ô dƣợc 52 3.2 Định tính thành phần cao tổng methanol ô dƣợc 53 3.3 Kết hoạt tính kháng oxy hố cao tổng methanol ô dƣợc ………………………………………………………………………… 54 3.4 Khảo sát tác dụng dƣợc lên độc tính tế bào u sắc tố B16F10……………………………………………………………………… 56 3.5 Khảo sát tác dụng dƣợc lên q trình tổng hợp melanin 57 3.6 Kết chiết thu nhận cao phân đoạn 58 3.7 Kết định tính thành phần hoá học cao phân đoạn .59 3.8 Kết hoạt tính kháng oxy hố cao chiết phân đoạn .61 3.9 Khảo sát tác dụng phân đoạn cao lên độc tính ức chế melanin tế bào u sắc tố B16F10 63 3.10 Kết xác định thành phần hoá học phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 64 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67 4.1 Kết luận 67 4.2 Đề nghị 68 vi Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DHICA 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid DHI 5,6-dihydroxyindole DHICA 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid DMSO Dimethyl sulfoxide DOPA 3,4-dihydroxyphenylalanine DPPH 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl HPLC High Pressure Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) IC50 Half maximal Inhibitory Concentration (Nồng độ chất mà ức chế 50% gốc tự do, tế bào enzyme) 3-(4,5MTT dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide Post- PIH inflammatory hyperpigmentation TRP-1 DHICA oxidation TRP-2 DOPA chrome tautomerase vii Đồ án tốt nghiệp UV Ultraviolet (Tia cực tím) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Dung môi khác dung chiết xuất nhóm hoạt chất dược liệu 28 Bảng 3.1 Kết định tính nhóm chất hữu cao tổng methanol ô dược 53 Bảng 3.2 Kết xác định thành phần hố học mẫu cao phân đoạn dược 59 viii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hình ảnh số lồi thuộc chi Lindera Hình 1.2 Một số hợp chất Sesquiterpenoids xác định chi Lindera Hình 1.3 Một số hợp chất alkaloids xác định chi Lindera Hình 1.4 Cây dược 11 Hình 1.5 Cấu trúc phân tử melanin (1,3,5-triazine-2,4,6-triamine) 14 Hình 1.6 Cấu tạo da 14 Hình 1.7 Cơng thức hoá học loại melanin 17 Hình 1.8 Hai nhóm melanin 17 Hình 1.9 Sơ đồ đường tổng hợp melanin 18 Hình 1.10 Các bệnh da tăng sắc tố 20 Hình 1.11 Các bệnh giảm sắc tố 21 Hình 1.12 Hydroquinone 23 Hình 1.13 Niacinamide (Vitamin B3) 23 Hình 1.14 Arbutin (4-Hydroxyphenyl-α-D-glucopyranoside) 24 Hình 1.15 Azelaic acid 25 Hình 1.16 Kojic acid 26 Hình 1.17 Vitamin C 26 Hình 1.18 Một số hợp chất ức chế trình tổng hợp melanin 27 ix Đồ án tốt nghiệp Bảng Kết khảo sát khả bắt gốc tự cao nước thu Nồng độ (µg/ml) 7,8125 15,625 31,25 62,5 125 250 500 (+)Vitamin C (100 µg/ml) (-) Ethanol Nonlinear Regression Data Source: Data in Notebook6 Equation: Hyperbola, Modified Hyperbola III f=a-b/(1+c*x)^(1/d) R R 0.9982 Coefficient a31104.525727689864.1744 b31091.995527689865.9170 c d Analysis of Variance: Uncorrected for the mean of the observations: DF Regression Residual Total 0.0093 760.5390 11 Đồ án tốt nghiệp Corrected for the mean of the observations: DF Regression Residual Total Statistical Tests: PRESS 105.0394 Durbin-Watson Statistic Normality Test K-S Statistic = 0.2817 Constant Variance Test Power of performed test with alpha = 0.0500: 1.0000 Regression Diagnostics: Row Influence Diagnostics: Row 95% Confidence: Row Std Res Cook's Dist Leverage Predicted 12 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC C: THỐNG KÊ KẾT QUẢ TÁC DỤNG CỦA CAO METHANOL Ô DƢỢC LÊN QUÁ TRÌNH TỔNG HỢP MELANIN Bảng Tác dụng cao methanol dược lên q trình tổng hợp melanin Nồng độ mẫu (µg/ml) 12,5 25,0 50,0 100,0 200,0 PBS Arbutin (200 µg/ml) 13 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC D: THỐNG KÊ KẾT QUẢ KHẢO SÁT TÁC DỤNG CỦA CAO METHANOL Ơ DƢỢC LÊN ĐỘC TÍNH TẾ BÀO Bảng Tác dụng cao methanol dược lên độc tính tế bào Nồng đ (µg 12 25 50 10 20 PB Arb (200 µ 14 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC E: CÁC GIAI ĐOẠN CHIẾT CÁC PHÂN ĐOẠN CAO Ô DƢỢC Hình Các giai đoạn chiết phân đoạn (A) Chiết lỏng – lỏng, (B) Dịch chiết phân đoạn, (C) Cô quay chân không dịch chiết, (D) Cao phân đoạn thu sau cô quay 15 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC F: HÌNH ẢNH THỬ NGHỆM KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HOÁ CỦA MẪU CAO CHIẾT Ô DƢỢC BẰNG PHƢƠNG PHÁP DPPH 0,25 0,125 0,0625 0,03125 0,015625 Hình Phản ứng DPPH cao Methanol (A) (+) (-) Hình Phản ứng DPPH cao phân đoạn (A) cao hexan, (B) cao chloroform, (C) cao ethyl acetate, (D) cao nƣớc, (+) đối chứng dƣơng vitamin C, (-) đối chứng âm ethanol 16 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC G: THỐNG KÊ KẾT QUẢ GIÁ TRỊ IC50 CỦA MẪU CHUẨN VÀ CÁC MẪU CAO CHIẾT Ô DƢỢC Bảng 10 Giá trị IC50 cảu đoạn cao chiết mẫu chuẩn Vitamin C Các phân đoạn IC50 (µg/ml) 17 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC H: CÁC THUỐC THỬ DÙNG TRONG Q TRÌNH XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HỐ HỌC F1 Thử nghiệm định tính Carbohydrate  Molisch: Thuốc thử Molisch: Hoà tan 5g α-napthon vào ethanol 95% Định mức đến 100ml  Fehling: Thuốc thử Fehling A: hoà tan 34,6g CuSO4.5H2O vào 500ml nước cất Thuốc thử Fehling B: Hoà tan 125g KOH 173g Kali Natri tartrate.7H 2O vào 500 ml nước cất F2 Thử nghiệm định tính Alkaloid  Mayer: Hoà tan 1,358g HgCl2 60ml nước, sau đổ vào dung dịch 5g KI pha 10ml nước Định mức đến 100ml  Wagner: Hoà tan 2g iodine 6g KI vào 100ml nước cất 18 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC G: HÌNH ẢNH KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH THÀNH PHẦN HỐ HỌC TRONG MẪU CAO CHIẾT C Nước C Ethyl acetate C Chlor -form C Methanol Hình Hình ảnh thử nghiệm Fehling định tính Carbohydrate C Methanol C Chloroform C Ethyl acetate (A) C.Nước C.Methanol C.Chloro C.Ethyl C.Nước form acetate (B) Hình Hình ảnh thử nghiệm Molish (A) Benedict (B) định tính Carbohydrate C Methanol C.Chloro form C Ethyl acetate C.Nước C Methanol C Chloro C Ethyl C Nước form acetate Hình Hình ảnh thử nghiệm Wagner (A) Mayer (B) định tính Alkaloid 19 Đồ án tốt nghiệp C.Methnol C Chloroform C.Ethyl acetate C.Nước Hình Hình ảnh thử nghiệm Foam định tính Saponin C Methnol C.Chloro C.Ethyl -form C.Nƣớc acetate Hình Hình ảnh thử nghiệm Bontranger định tính Glycoside (A) 4 (B) (C) Hình 10 Hình ảnh định tính Flavonoid (A) thử nghiệm Alkaline, (B) thử nghiệm Shinoda, (C) thử nghiệm Ferric chloride 1-cao methnol, 2-cao chloroform, 3-cao ethyl acetate, 4-cao nước C Methanol C Chloroform C.Ethyl acetate C.Nƣớc Hình 11 Hình ảnh định tính Phenolic tannin thử nghiệm Gelatin 20 Đồ án tốt nghiệp C Methanol C Chloroform C Ethyl acetate C Nước Hình 12 Hình ảnh định tính chất nhầy Hình 13 Hình ảnh định tính chất béo thử nghiệm Spot C Methanol C.Ethyl acetate C Chloroform C.Nước Hình 14 Hình ảnh thử nghiệm Biuret định tính Protein 21 Đồ án tốt nghiệp 22 ... cứu - Khảo sát hoạt tính kháng oxy hố cao chiết ô dược - Khảo sát khả ức chế q trình tổng hợp hắc tố cao chiết dược Nhiệm vụ nghiên cứu 4.1 Giai đoạn - Tiến hành chiết, cô quay chân không thu... nhiều hoạt tính sinh học tốt như: Borneol, Linderane, Linderalactone Tuy nhiên, khả kháng oxy hố ức chế q trình tổng hợp hắc tố ô dược chưa nghiên cứu chuyên sâu Do vậy, đề tài ? ?Khảo sát hoạt tính. .. Định tính thành phần hố học từ cao methanol - Thử hoạt tính kháng oxy hóa từ cao methanol thu Đồ án tốt nghiệp - Khảo sát tác dụng dược lên q trình tổng hợp melanin - Khảo sát tác dụng ô dược