Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và bước đầu xác định thành phần hóa học của một số cao chiết từ podocarpus sp ​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ BƯỚC ĐẦU XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ CAO CHIẾT TỪ PODOCARPUS SP Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : Th S Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực MSSV: 1151110422 : Nguyễn Thị Hồng Vân Lớp: 11DSH01 TP Hồ Chí Minh, 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nội dung đồ án thực hướng dẫn ThS Phạm Minh Nhựt Mọi tham khảo dùng đồ án trích dẫn rõ ràng tên tác giả, tên cơng trình, thời gian, địa điểm công bố Mọi chép không hợp lệ, vi phạm quy chế đào tạo, hay gian trá, xin chịu hồn tồn trách nhiệm Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Hồng Vân LỜI CẢM ƠN Tơi chân thành cảm ơn Ban Gíam Hiệu Trường Đại học Cơng Nghệ Tp Hồ Chí Minh, thầy cô giảng dạy Khoa Công nghệ sinh học- Thực phẩm- Mơi trường Với lịng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến thầy Phạm Minh Nhựt tận tâm hướng dẫn chúng em qua buổi học lớp buổi nói chuyện, thảo luận lĩnh vực sáng tạo nghiên cứu khoa học, định hướng nghiên cứu Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn thầy Cuối em xin cảm ơn thầy phịng thí nghiệm Khoa Cơng nghệ sinh học- Thực phẩm- Môi trường, bạn bè quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện để em hoàn thành đồ án Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Hồng Vân Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI C MỤC LỤC DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH SÁCH CÁC BẢNG DANH SÁCH HÌNH MỞ ĐẦU 1.Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu 3.Nội dung nghiên cứu 4.Phạm vi nghiên cứu CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu Podocarpus sp 1.1.3 Đặc điểm sinh học sinh thái học 1.1.4 Công dụng Podocarpus sp 1.2 Thành phần hóa học thực vật 1.3 Tổng quan hợp chất kháng khuẩn thực vật 1.3.1 Khái niệm hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn 1.3.2 Cơ chế kháng khuẩn 1.3.4 Khái niệm nồng độ ức chế tối thiểu MIC 1.4 Một số vi sinh vật gây bệnh điển hình i Đồ án tốt nghiệp 1.4.1 Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy 1.4.2 Nhóm vi sinh vật gây bệnh hội da CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm thời gian 2.1.1 2.1.2 2.2 Vật liệu 2.2.1 2.2.2 Vi sinh vật thị 2.2.3 Hóa chất, mơi trường 2.2.4 Dụng cụ, thiết bị 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp thu xử lý nguồn mẫu 2.3.2 Phương pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi khuẩn 2.3.3 Phương pháp bảo quản giữ giống 2.3.4 Phương pháp ngâm mẫu 2.3.5 2.3.6 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC 2.3.7 Phương pháp xác định thành phần hóa học 2.3.8 Phương pháp xử lý số liệu 2.4 Bố trí thí nghiệm 2.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng dung môi đến hiệu suất tách chiết cao 2.4.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn Podocarpus sp với dung môi khác 2.4.3 Thí nghiệm 3: Thử nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp phương pháp khuếch tán giếng thạch (agar well diffusion method) 2.4.4 Thí nghiệm 4: Xác định thành phần hóa học Podocarpus sp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết khảo sát ảnh hưở 3.2 Kết đánh giá hoạt tín dung mơi khác 3.3 Kết xác định nồng đ Podocarpus sp 3.4 Kết xác định thành ph ii Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 58 4.1 Kết luận 58 4.2 Đề nghị 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 iii Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ETEC: Enterotoxigenic Escherichia coli TSB: Trypton Soya Broth TSA: Trypticase Soya Agar MIC: Minimal Inhibitory concentration - Nồng độ ức chế tối thiểu DMSO: dimethysulfoside iv Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Kết đánh giá hoạt tính kháng khuẩn dung môi 20 chủng vi sinh vật 52 Bảng Kết nồng độ ức chế tối thiểu cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp 54 Bảng 3 Thành phần hóa học cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp 56 v Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH HÌNH Hình 1.Hình ảnh Podocarpus imbricatus Hình Hình ảnh Escherichia coli kính hiển vi 14 Hình Ảnh chụp Shigella sp mẫu phân 15 Hình Hình ảnh Salmonella 16 Hình Hình ảnh Vibrio cholerae 17 Hình Hình chụp Listeria monocytogenes kính hiển vi điện tử 18 Hình Hình ảnh Pseudomonas aeruginosa 19 Hình Cấu trúc hiển vi Staphylococcus aureus 20 Hình Hình ảnh Enterococcus feacalis 21 Hình Quy trình xử lý mẫu 24 Hình 2.Quy trình chung 28 Hình Quy trình khảo sát ảnh hưởng dung môi đến hiệu suất tách chiết cao 29 o Hình 4.Dịch lọc qua lần ngâm ethanol 50 30 o Hình Dịch lọc qua lần ngâm ethanol 70 31 o Hình Dịch lọc qua lần ngâm ethanol 90 31 Hình Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn hoạt tính kháng khuẩn 33 Hình Kết đánh giá hoạt tính kháng khuẩn 35 Hình Quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp 36 Hình 10 Kết MIC ETEC 38 Hình 11 Kết MIC E.coli O157:H7 38 Hình 12 Quy trình xác định thành phần hóa học 39 Hình 13 Thử nghiệm carbohydrate saponin 40 Hình 15 Thử nghiệm flavonoid 42 Hình 16 Thử nghiệm phenolic 43 Hình 17 Thử nghiệm tannin 44 Hình 18 Thử nghiệm steroid 45 Hình Hiệu suất tách chiết từ Podocarpus sp số dung mơi 46 Hình Hoạt tính kháng khuẩn Echerichia coli spp với dung môi khác kháng sinh Ciprofloxacin 500 g/ml 47 Hình 3 Hoạt tính kháng khuẩn Salmonella spp với dung môi khác kháng sinh Ciprofloxacin 500 g/ml 48 Hình Hoạt tính kháng khuẩn nhóm Shigella spp với dung mơi khác kháng sinh Ciprofloxacin 500 g/ml 49 Hình Hoạt tính kháng khuẩn nhóm Vibrio spp với dung môi khác kháng sinh Ciprofloxacin g/ml 50 Hình Hoạt tính kháng khuẩn nhóm Listeria spp nhóm vi sinh vật gây bệnh khác với dung môi khác kháng sinh Ciprofloxacin 500 g/ml 51 vi Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Từ ngày xưa, người biết tận dụng loại cỏ tự nhiên để phục vụ vào sống ngày làm thực phẩm,… đặc biệt chữa bệnh Tài nguyên thuốc số tài sản vô thiên nhiên ban tặng cho người Những thầy thuốc giỏi chữa nhiều bệnh hiểm nghèo thường có kiến thức uyên thâm thuốc công dụng chúng, thuốc sau đem phơi khô chủ yếu ngâm với nước sắc làm thuốc uống, thuốc trị nhiều bệnh thuốc dân gian tồn ngày Xã hội ngày phát triển tỷ lệ dịch bệnh ngày tăng đa dạng việc tạo loại thuốc có nguồn gốc tự nhiên có hiệu cao đồng thời khơng có tác dụng phụ điều cần thiết Trên giới Việt Nam có nhiều nhà khoa học nghiên cứu thuốc, sâu tìm hiểu hoạt chất có cỏ có thuốc dân gian Bên cạnh đó, bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa trở nên phổ biến phương pháp chữa trị chủ yếu sử dụng kháng sinh Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh dẫn đến rủi ro tượng kháng thuốc Do đó, việc tìm nguồn nguyên liệu tự nhiên có khả kháng khuẩn giúp ta tạo phương pháp điều trị cách hiệu đối với số bệnh thông thường Với sở khoa học ý nghĩa thực tiễn trên, thực đề tài: “Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn bước đầu xác định thành phần hóa học số cao chiết từ Podocarpus sp.” Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Podocarpus sp với nhiều dung môi khác Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Vũ Văn Dũng 1996 Cây rừng Việt Nam Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội, Việt Nam Cao Minh Nga, 2014 Thực tập vi sinh học Nhà xuất giáo dục,67,68 Bài giảng Dược liệu Tập I, 1998, Trường đại học y dược TPHCM Ngô Văn Thu, 2011 Bài giảng dược liệu, tập I Trường đại học Dược Hà Nội Phạm Thanh Kỳ cs, 1998 Bài giảng dược liệu, tập II Trường đại học Dược Hà Nội Đỗ Tất Lợi, 2004 Những thuốc vị thuốc Việt Nam Nhà xuất Y học Viện dược liệu, 2004 Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập I Nhà xuất khoa hoc kỹ thuật Viện Dược liệu (2004), “Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam”, tập II, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI Trumbo P, Schlicker S, Yates AA, Poos M; Food and Nutrition Board of the Institute of Medicine, The National Academies Dietary reference intakes for energy, carbohydrate, fiber, fat, fatty acids, cholesterol, protein and amino acids.J Am Diet Assoc Nguyen Tien Hiep, Pan Ke Loc, Nguyen Duc To Luu, PI Thomas, A Farjon, L Averyanov & J Regalado Jr 2004 Vietnam Conifers: Conservation Status Review 2004 Fauna & Flora International, Vietnam Programme, Hanoi 60 Đồ án tốt nghiệp Abdillahi, HS, et al (2011) Anti-inflammatory, antioxidant, anti-tyrosinase and phenolic contents of four Podocarpus species used in traditional medicine in South Africa Journal of Ethnopharmacology 136(3), 496-503 Jean BRUNETON Pharmacognosy, Phytochemistry, Medicinal Plants Technique & Documentation - Lavoisier, 1995 (Translated by Caroline K Hatton) Austin, B & D.A Austin 1993 Bacterial fish pathogens, Diseases in farmed and wild fish, 2nd edn Ellis Horwood Ltd., Chichester Jemmi, T., and Stephan, R.,2006, Listeria monocytogenes: food-borne pathogen and hygiene indicator Science Magazine Vol (25):571-580 Katie E Ferrell; Thorington, Richard W (2006) Squirrels: the animal answer guide Baltimore: Johns Hopkins University Press 91 Amoros, M., F Sauvager, L Girre, and M Cormier (1992), In vitro antiviral activity of propolis Apidologie 23:231–240 Pedro Aqueveque ctv, (2005) Favolon B, a New Triterpenoid Isolated from the Chilean Mycena sp Strain 96180, The Journal of Antibiotics 58, 61–64 Hisanori Akiyama ctv, (2001) Antibacterial action of several tannins against Staphylococcus aureus, Journal of Antimicrobial Chemotherapy 48, 487491 Cushnie T P Lamb A J; (2006) Antimicrobial activity of flavonoids, Int J Antimicrob Agents; 26(5):343-56 Michał Arabski ctv, (2012) Effects of Saponins against Clinical E coli Strains and Eukaryotic Cell Line, Journal of Biomedicine and Biotechnology Mon M M.,Maw S S and Oo Z K (2011), Screening of antioxidant, antitumor and antimicrobial herbal drugs/diets from some Myanmar traditional herbs, International Journal of Bioscience, Biochemitry and Bioinformatics 61 Đồ án tốt nghiệp Rozman T., Jersek B (2009), Antimicrobial activity ò rosemary extracts (Rosmarimus officinalis L.) against diferent species of Listeria, Acta agriculturae Slovenica Salem W M., Sayed W F., Haridy M and Hassan N H (2014), Antibacterial activity of Calotropis procera and Ficus sycomorus extracts on some pathogenic microorganisms, African Journal of Biotechnology Aibinu ctv (2007) “In vitro antimicrobial activity of crude extracts from plants Bryophyllum pinnatum and Kalanchoe crenata” Afr J Traditional, Complementary and Alternative Medicines, (3): 338 - 344 Moses A.G., Erastus G., Leonard G and Henry R., Preliminary Phytochemical screening of eight selected medicinal herbs used for the treatment of diabetes, Malaria and Pneumonia in Kisii Region, Southwest Kenya Euroean Journal of Applied Sciences Vol(5):01-06, 2013 Rayes A A.H (2012), Screening of some natural and cultivated plants in sudia arabia fight infections and inhibit growth of pathogenic bacteria, Faculty of Applied Sciences, Umm A1 – Qura University Makkah Saudi Arabia Wendakoon C., Calderon P., Gagnon D (2012), Evaluation of selected medicinal plants extracted in different ethanol concentrations for antibacterial activity against human pathogens, Journal of Medicinally Active Plants 62 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC A: KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA PODOCARPUS SP VỚI CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU A.1 Kết đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết ethanol 50% Chủng Salmonella enteritidis Salmonella typhii(K) Salmonella typhimurium Shigella boydii Shigella flexneri Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus Pseudomonass aeruginosa Staphylococcus aureus A.2 Kết đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết ethanol 70% Chủng ETEC Listeria innicua Salmonella dublin Shigella boydii Shigella flexneri Shigella sonnei Vibrio cholerae Vibrio harveyi Đồ án tốt nghiệp A.3 Kết đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết ethanol 90% từ Podocarpus sp Chủng Escherichia coli (K) Salmonella enteritidis Salmonella typhii(K) Salmonella typhimurium Shigella boydii Shigella flexneri Vibrio parahaemolyticus Pseudomonass aeruginosa Staphylococcus aureus A.4 Kết đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nước từ Podocarpus sp A.5 Kết đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết methanol 75% từ Podocarpus sp STT 10 Đồ án tốt nghiệp Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ XỬ LÍ SỐ LIỆU BẰNG PHẦN MỀM STATGRAPHIC B.1 Kết xử lí số liệu hiệu suất tách chiết cao dung mơi B.2 Kết xử lí số liệu dung mơi khác với nhóm Escherichia coli spp B.3 Kết xử lí số liệu dung mơi khác với nhóm Shigella spp B.4 Kết xử lí số liệu dung mơi khác với nhóm Vibrio spp Đồ án tốt nghiệp B.5 Kết xử lí số liệu dung mơi khác với nhóm vi sinh vật gây bệnh khác B.6 Kết xử lí số liệu dung môi khác với Listeria monocytogenes B.7 Kết xử lí số liệu dung mơi khác với Salmonella enteritidis Đồ án tốt nghiệp B.8 Kết xử lí số liệu dung mơi khác với Salmonella typhimurium B.9 Kết xử lí số liệu dung môi khác với Salmonella typhii (K) Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC C: KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU CỦA PODOCARPUS SP C.1 Kết xác định nồng độ ức chế tối thiểu cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp (nồng độ 50,100 mg/ml) STT Chủng Escherichia coli O157:H7 Escherichia coli 0208 Escherichia coli Enterotoxigenic E.coilETEC Listeria innicua Listeria monocytogenes Salmonella Dublin Salmonella enteritidis Salmonella typhii(K) Salmonella typhimurium Shigella boydii Shigella flexneri Shigella sonnei Vibrio alginolyticus Vibrio cholerae Vibrio harveyi Vibrio parahaemolyticus Pseudomonass aeruginosa Staphylococcus aureus 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Enterococcus feacalis C.2 Kết xác định nồng độ ức chế tối thiểu cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp (nồng độ 12,5, 25 mg/ml) STT Chủng Đồ án tốt nghiệp 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC D: HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CIPROFLOXACIN D.1 Hoạt tính kháng khuẩn Ciprofloxacin nồng độ 500 g/ml, nhóm Vibrio spp nồng độ g/ml STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC E: THUỐC THỬ SỬ DỤNG TRONG THÍ NGHIỆM E.1 Phương pháp pha thuốc thử phương pháp xác định thành phần hóa học Thành phần hóa học Carbohydrate Alkaloid 10 Đồ án tốt nghiệp Cardiac glycosides 11 ... hồi từ Podocarpus sp Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn số dung môi từ Podocarpus sp Khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu MIC Podocarpus sp Xác định thành phần hóa học số dung môi từ Podocarpus sp Phạm... hiệu đối với số bệnh thông thường Với sở khoa học ý nghĩa thực tiễn trên, thực đề tài: ? ?Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn bước đầu xác định thành phần hóa học số cao chiết từ Podocarpus sp. ” Mục tiêu... sát hoạt tính kháng khuẩn hoạt tính kháng khuẩn 33 Hình Kết đánh giá hoạt tính kháng khuẩn 35 Hình Quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp