Thẩm định quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin synflorix™​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ──────*****────── LÊ THỊ HÒA THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH NHẬN DẠNG 10 TÝP KHÁNG NGUYÊN PHẾ CẦU TRONG VẮC XIN SYNFLORIX™ LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2015 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ──────*****────── LÊ THỊ HỊA THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH NHẬN DẠNG 10 TÝP KHÁNG NGUYÊN PHẾ CẦU TRONG VẮC XIN SYNFLORIX™ Chuyên ngành : Động vật học (Vi sinh vật học) Mã số LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Phạm Văn Hùng Hà Nội - 2015 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận văn “Thẩm định quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu vắc xin Synflorix™” cơng trình nghiên cứu cá nhân thực hướng dẫn TS Phạm Văn Hùng Các nội dung nghiên cứu kết trình bày luận văn trung thực rõ ràng Hà Nội, ngày 29/10/2015 Học viên Lê Thị Hịa Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Lời xin đươcc̣ bày tỏlòng biết ơn sâu sắc tới giáo viên hướng dẫn: TS Phạm Văn Hùng, Phó viện trưởng Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm Y tế đa ̃tận tình hướng dẫn truyền d ạy nhiều kiến thức quý báu đồng thời đôngc̣ viên t ạo điều kiện thuận lợi cho tơi qtrinhh̀ nghiên cứu hồn thành lṇ văn Tôi xin chân thành cảm ơn th ầy, cô giáo đồng nghiệp Viện Sinh Thái Tài Nguyên Sinh Vật-Viện Hàn Lâm Khoa học Công Nghệ Việt Nam giúp đỡ, chia sẻ truyền đạt cho tơi nhiều kiến thức bổ ích q trình tơi học tập Viện Tơi xin chân thành cảm ơn tới anh, chị đồng nghiệp Khoa Quản lý chất lượng Viện kiểm định quốc gia vắc xin sinh phẩm y tế động viên, chia sẻ hỗ trợ cơng việc để tơi có điều kiện học tập thực tốt đề tài nghiên cứu luận văn Nhân dịp xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Ban Lãnh đạo Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm Y tế, Ths Lưu Anh Thư đồng nghiệp Khoa Kiểm định vắc xin Vi khuẩn, phòng Tổ chức cán bộ, phòng Khoa học Đào tạo đa ̃ hỗ trợ tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình học tập, làm việc để tơi hồn thành luận văn Đặc biệt, tơi xin dành những tinhh̀ cảm thân thương gửi tới gia đinhh̀ tôi, những người đa ̃luô n bên , ủng hộ , đơngc̣ viên tơi suốt q trình học tập hoàn thành luận văn Xin trân trọng cảm ơn ! Học viên Lê Thị Hòa Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt BSA CV DT ELISA EU GMP GSK ICH IEC ISO IU KKT KN KT LAL LOD LOQ OD Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN PCV PD PPV PS SD SOP NICVB NTHi TB TMB TRS TT TTB WHO USP Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Phế cầu khuẩn số bệnh gây phế cầu khuẩn 1.1.1 Phế cầu khuẩn .4 1.1.2 Một số bệnh gây phế cầu khuẩn 1.2 Vắc xin phế cầu vắc xin Synflorix™ 1.2.1 Vắc xin phế cầu 1.2.2 Vắc xin Synflorix™ 10 1.3 Phương pháp phân tích miễn dịch sử dụng emzym đánh dấu .15 1.3.1 Nguyên lý chung 15 1.3.2 Một số phương pháp ELISA 15 1.4 Thẩm định quy trình 18 1.4.1 Định nghĩa thẩm định quy trình 18 1.4.2 Phân loại thẩm định quy trình 19 1.4.3 Các thông số thẩm định quy trình 23 1.5 Thẩm định quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu vắc xin Synflorix TM phương pháp ELISA 27 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Đối tượng nghiên cứu 28 2.3 Phương pháp nghiên cứu 30 2.3.1 Thiết kế thử nghiệm 30 2.3.2 Cỡ mẫu 30 2.3.3 Quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu vắc xin Synflorix TM phương pháp ELISA 30 2.3.4 Xây dựng quy trình thẩm định cho thơng số tiêu chuẩn chấp thuận thông số cần thẩm định 34 2.3.5.Cách tính tốn giá trị cut-off cho thơng số 36 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ 37 3.1 Giới hạn phát 37 3.2 Độ mạnh 44 3.3 Độ đặc hiệu 48 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 60 4.1 Thử nghiệm có giá trị 60 4.2 Giới hạn phát 60 4.3 Độ mạnh 62 4.4 Độ đặc hiệu 63 KẾT LUẬN 64 KIẾN NGHỊ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn nghiên cứu này, giới hạn phát quy trình độ pha lỗng lớn mẫu thử mà phản ứng còn dương tính Trong nghiên cứu này, dựa vào giá trị OD thu độ lặp lại, tiến hành pha loãng bậc 10 týp kháng nguyên phế cầu Nhóm nghiên cứu phải tiến hành thử nghiệm nhiều lần với độ pha lỗng khác để thiết kế thử nghiệm giới hạn phát cho týp kháng nguyên phế cầu độ pha loãng tương ứng phần kết nêu, kết giới hạn phát thể sau: Bảng 4.1 Giới hạn phát týp kháng nguyên phế cầu STT 10 Giới hạn phát týp kháng nguyên phế cầu nằm khoảng từ độ pha loãng 1/40 đến 1/640 Như vậy, khả phát kháng nguyên quy trình cao có khác về giới hạn phát giữa týp kháng nguyên Sở dĩ có khác giữa giới hạn phát 61 týp kháng nguyên hàm lượng kháng nguyên giữa týp vắc xin thành phẩm khác sản phẩm tạo thành phản ứng kết hợp kháng nguyên - kháng thể không bị rửa trôi quy trình kháng nguyên khác 4.3 Độ mạnh Độ mạnh quy trình thể qua việc đánh giá độ lặp lại, độ xác trung gian điều kiện hay thay đổi điều kiện thử nghiệm mẫu thử, quy trình đều cho kết Với độ lặp lại, người tiến hành lần thử nghiệm lô vắc xin Synflorix™ làm thử nghiệm đúp cho lần Kết lần thử nghiệm nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu: 1, 4, 7F, 14, 19F, 5, 9V, 6B, 18C 23F đều lớn giá trị cut-off cho kết dương tính (bảng 3.12) Kết lần thử nghiệm ổn định nằm khoảng TB ± 2SD tương ứng với khoảng tin cậy 95% CV týp kháng nguyên phế cầu đều nhỏ 20 Để xác định độ xác trung gian, chúng tơi thiết kế có thay đổi về thời gian người thực Nghiên cứu thực lần thử nghiệm người mẫu vắc xin ngày khác làm thử nghiệm đúp cho lần So sánh kết quả, người thực khác nhau, thời gian tiến hành khác kết OD trung bình tất týp vắc xin Synflorix™ đều lớn giá trị cut-off dương tính với kháng nguyên phế cầu Kết người thực phân tích phần mềm phân tích thống kê SPSS týp kháng nguyên phế cầu không khác biệt có ý nghĩa thống kê kết thử nghiệm Như vậy, với quy trình, thực mẫu thử, trang thiết bị, hai người thử nghiệm khác khoảng thời gian khác 62 đều cho kết lặp lại lần thử nghiệm người thực cho kết tương đương (dương tính), quy trình nhận dạng đạt độ mạnh 4.4 Độ đặc hiệu Độ đặc hiệu khả xác định chất cần tìm có mẫu thử có mặt thành phần khác tá dược, tạp chất, sản phẩm phụ gia , để đánh giá độ đặc hiệu nhóm nghiên cứu sử dụng mẫu thử mẫu có chứa 10 týp kháng nguyên phế cầu (vắc xin Synflorix™); mẫu thử mẫu thêm (thêm lượng 10 týp kháng nguyên phế cầu biết vào vắc xin thương hàn - Typhim vi có chất với kháng nguyên phế cầu polysaccharide có hàm lượng kháng nguyên Vi 1,0 μg/ml theo tỉ lệ 1:1); mẫu thử mẫu trắng (mẫu không chứa 10 týp kháng nguyên phế cầu mẫu vắc xin thương hàn Vi Typhim Vi) Kết bảng từ 3.13 đến 3.22 cho thấy, mẫu trắng tất giá trị OD trung bình mẫu đều nhỏ giá trị cut-off qua lần thực thử nghiệm chứng tỏ xảy phản ứng âm tính tức khơng có mặt 10 týp kháng nguyên phế cầu týp 1, 4, 7F, 14, 19F, 5, 9V, 6B, 18C 23F; mẫu thêm mẫu Synflorix™ giá trị OD trung bình hai mẫu đều lớn giá trị cut-off; hai mẫu đều dương tính với 10 týp kháng nguyên phế cầu týp 1, 4, 7F, 14, 19F, 5, 9V, 6B, 18C 23F; mặt khác kết OD thu mẫu thêm mẫu Synflorix™ tương đương nhau, tức có kháng nguyên phế cầu tham gia phản ứng kết hợp đặc hiệu với kháng thể tương ứng Như vậy, quy trình thử nghiệm cho kết dương tính có mặt chất cần nhận dạng (mẫu vắc xin Synflorix TM) , có lẫn thành phần khác (mẫu có chứa vắc xin Synflorix TM vắc xin Typhim Vi) âm tính khơng có mặt chất cần nhận dạng (mẫu vắc Typhim Vi) điều cho thấy quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu đạt độ đặc hiệu 63 KẾT LUẬN Quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu vắc xin Synflorix™ có độ tin cậy cao với: Giới hạn phát Giới hạn phát kháng nguyên phế cầu nằm khoảng từ độ pha loãng 1/40 đến 1/640 Độ mạnh thử nghiệm Quy trình đạt độ mạnh thay đổi điều kiện thực quy trình, giống thực thử nghiệm thường quy Các kết thu sau những thay đổi đều khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê Độ đặc hiệu Độ đặc hiệu quy trình đánh giá thơng qua việc nhận dạng kháng nguyên phế cầu mẫu có chứa nhiều thành phần khác nhau, đều cho kết dương tính 64 KIẾN NGHỊ Quy trình “nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu vắc xin Synflorix™” đạt yêu cầu về giới hạn phát hiện, độ mạnh, độ đặc hiệu theo tiêu chuẩn WHO Đề nghị sử dụng quy trình để kiểm tra nhận dạng vắc xin Synflorix™ Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm Y tế 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Bộ môn Vi sinh y học - trường Đại học Y Hà Nội (2007),“Vi sinh y học”, nhà xuất Y học, Hà nội, tr 160-163 [2] Bộ Y tế (2009), "Dược điển Việt Nam IV", nhà xuất Y học, Hà Nội, mục 15.11.Phụ lục 323 [3] Đặng Đức Hậu (2008), “Xác xuất thống kê”, nhà xuất giáo dục, y tế, tr 80-89, 141-143 [4] Hoàng Thanh Dương (2009), “Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp”, văn phòng Công nhận chất lượng, Tổng cục Tiêu chuẩn đo lường chất lượng [5] Học viện quân y (1992),“Vi sinh vật học”, nhà xuất giáo dục đào tạo chuyên nghiệp, Hà nội, tr 242-243 [6] [7] Học viện quân y (2008),“Vi sinh vật y học”, nhà xuất Quân đội nhân dân, tr 96 Học viện quân y (1999), “Bệnh học truyền nhiễm”, nhà xuất y học, Hà nội, tr.15-17 [8] Lê Văn Hiệp (2006), “Vắc xin học vấn đề bản”, nhà xuất y học tr 286 [9] Lê Văn Phủng (2009), “Vi khuẩn y học”, nhà xuất Giáo dục Việt Nam tr 33-37 [10] Nguyễn Lê Huyền Trang (2014), “Hướng dẫn thầm định thử nghiệm”, tài liệu nội Viện kiểm định quốc gia vắc xin sinh phẩm y tế [11] Viện Kiểm định quốc gia vắc xin sinh phẩm y tế ( 2014), “Bộ tiêu chuẩn xuất xưởng vắc xin- sinh phẩm”, tài liệu lưu hành nội bộ, tr.150 – 155 [12] Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia (2010), “Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật”, nhà xuất khoa học kỹ thuật, tr.10-59 Tài liệu tiếng anh Anh DD, Kilgore PE, Slack MP, Nyambat B, le Tho H, Yoshida LM, [13] Nguyen HA, Nguyen CD, Chong CY, Nguyen D, Ariyoshi K, Clemens JD, Jodar L (2009), “Surveillance of pneumococcal-associated disease among hospitalized children in Khanh Hoa Province, Vietnam”, Clin Infect Dis, 48:57–64 Black RE, Cousens S, Johnson HL, Lawn JE, Rudan I, Bassani DG, Jha [14] P, Campbell H, Walker CF, Cibulskis R, Eisele T, Liu L, Mathers C (2010), “Global, regional, and national causes of child mortality in 2008: a systematic analysis”, Lancet, 375:1969–1987 Bogaert D, Ha NT, Sluijter M, Lemmens N, De Groot R, Hermans PW [15] (2002), “Molecular epidemiology of pneumococcal carriage among children with upper respiratory tract infections in Hanoi, Vietnam”, J [16] Clin Microbiol, 40:3903–3908 Chung Keel Lee (2011), “Validation system and inspection”, WHO global Learning Opptunities for vaccine quanlity, KFDA [17] European Medicines Agency (2009), “Assessment report for Synflorix”, London, UK [18] GAVI Alliance (2013), “Pneumococcal disease”, GAVI Factsheet, Geneva [19] Guidelines for Independent Lot Release of Vaccines by Regulatory Authorities, World Health Organization, 2010 [20] ICH Q2A (1995),“Guidline for validation of analytical methods: definitions and terminology”,CPMP/ICH/381/95, The International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, London, UK ICH Q2B,(1995), “Guidline for validation of analytical procedures: [21] methodology”, CPMP/ICH/381/95, The International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use , London, UK [22] Kim SH, Song JH, Chung DR, Thamlikikul V, Yang Y, Wang H, Lu M, So TM, Hsueh PR, Yasin RM, Carlos CC, Pham HV, Lalitha MK, Shimono N, Perera J, Shibl AM, Baek JY, Kang CI, Ko KS, Peck KR (2012), “Changing trend of antimicrobial resistance and serotypes in Streptococcus pneumoniae in Asian countries: an ANSORP study”, Antimicrob Agents Chemother, 56:1418-1425 [23] Lin T Z Summary of invasive pneumococcal disease burden among children in the Asia-Pacic region Vaccine 28 (2010), pp7589–7605 [24] Lonneke Levels (2010), "Method validation, part one" Nederlands Vaccin Institute (NVI) [25] Teeranart Jivapaisarnpong (2006), "Validation of bioassay" Training course on quality control of vaccines used in EPI, Ha Noi [26] Summary Protocol for Synflorix™ vaccine (2010), GSK [27] USP (2013), “Validation and Verification of Analytical procedures” Training course, Hà nội pp 3-7 [28] WHO (1992), "Good manufacturing practices for biological products WHO expert committee on biological standardization" Technical Report Series No.822, forty - second Report [29] WHO (1997),“ Part 2: validation,WHO guide to good manufacturing practice (GMP) requirement”, Geneva [30] WHO-TRS No 927 Annex (2005), “Recommendation for production and control of pneumococcal conjugate vaccines”, pp72-84 [31] Whale walker (2008), “The ELISA guide book”, 2nd edition, Humana Press, New York, USA [32] WHO (1997), “Manual of laboratory methods” For testing of vaccines used in the WHO Expanded programe on Immunization, pp 72-86 [33] WHO (2001), “Part 2: Validation”, A WHO guide to good manufacturing practice (GMP) requirements, pp.63 - 85 [34] WHO (2004), “Part 2: Validation”, A WHO guide to good manufacturing practice (GMP) requirements, pp.63 - 87 [35] WHO (2006), “Validation” Supplementary guidelines on good manufacturing practice (GMP) Technical report series, No 937, annex 4, pp 107-119 [36] WHO (2000), “Supplementary information on vaccine safety”, departmnet of vaccines and biologys, pp75 [37] WHO in- country workshop on analytical method validation, 17 February 2014, Ha Noi –Viet Nam [38] WHO position paper-Wkly Epidemiol Dec 2012, 87 (14): 129-144 [39] Yeowon Sohn (2011), “Analytical method validation of bioassay” Training course on quanlity control of vaccines used in EPI, Ha Noi Các trang Web [40] Http://niheold.nihe.org.vn/new-vn/thuong-quy-va-huong-danky-thuat/954/Qui-trinh-nuoi-cay-phan-lap-vi-khuanStreptococcus-pneumoniae.vhtm [41] Http://www.historyofvaccines.org/content/timelines/Pneumococcal [42] Http://www.phoiviet.com/benh-tiem-ngua-phe-cau [43] Http://www.nihe.org.vn/new-vn/thuong-quy-va-huong-danky-thuat/147/phe-cau-khuan-spneumoniae.vhtm PHỤ LỤC PHỤ LỤC CÁCH PHA LOÃNG KHÁNG THỂ Kháng thể kháng týp 7F 14 19F 9V 18C 6B 23F PHỤ LỤC CÔNG THỨC PHA DUNG DỊCH RỬA VÀ HẬU PHỦ PHIẾN Pha dung dịch rửa: Tên hóa chất NaCl KH2PO4 Na2HPO4 KCl Tween 20 Nước cất lần Pha dung dịch hậu phủ phiến PBS Tween 20 – BSA 1%: Tên hóa chất BSA Dung dịch rửa Chú ý: Sử dụng không tháng kể từ ngày pha chế PHỤ LỤC CÔNG THỨC PHA DUNG DỊCH DỪNG PHẢN ỨNG Chú ý: Sử dụng không tháng kể từ ngày pha chế PHỤ LỤC CÔNG THỨC PHA DUNG DỊCH ĐỆM CARBONATE 0,05M a Pha dung dịch đệm carbonate 0,2M: Tên hóa chất Natri bicarbonate Natri carbonate Nước cất lần b Pha dung dịch đệm carbonate 0,05M: Tên hóa chất Dung dịch đệm carbonate 0,2M Nước cất lần Chú ý: Sử dụng không tháng kể từ ngày pha chế PHỤ LỤC CÔNG THỨC PHA DUNG DỊCH CỘNG HỢP - Dung dịch 1: Tên hóa chất Dung dịch hậu phủ phiến (post-coatin Dung dịch Protein A – peroxidase - Dung dịch 2: Tên hóa chất Dung dịch hậu phủ phiến (post-coatin Dung dịch Chú ý: Dung dịch dùng sau pha ... mạnh quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu vắc xin Synflorix™ Đánh giá ̣đ ặc hiệu quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu vắc xin Synflorix™ Giới hạn phát quy trình nhận dạng 10. .. dụng quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên chứa vắc xin Synflorix™ áp dụng phòng kiểm định NICVB Chúng tơi tiến hành đề tài ? ?Thẩm định quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu vắc xin. .. Định nghĩa thẩm định quy trình 18 1.4.2 Phân loại thẩm định quy trình 19 1.4.3 Các thơng số thẩm định quy trình 23 1.5 Thẩm định quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế