Thu nhận sophorolipids tổng hợp từ chủng candida bombicola với nguồn đường glucose và dầu hạt cải​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THU NHẬN SOPHOROLIPIDS TỔNG HỢP TỪ CHỦNG Candida bombicola VỚI NGUỒN ĐƯỜNG GLUCOSE VÀ DẦU HẠT CẢI Ngành : Công nghệ sinh học Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Hoàng Dũng ThS Lê Quỳnh Loan Sinh viên thực : Nguyễn Thị Yến Nhi MSSV: 1311100539 - Lớp: 13DSH02 TP Hồ Chí Minh, 2017 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Người thực đề tài: Nguyễn Thị Yến Nhi Sinh viên trường: Đại học Cơng Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh Khoa: Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường Ngành: Công nghệ sinh học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Lớp: 13DSH02 MSSV: 1311100539 Đồ án tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu thân tơi hướng dẫn TS Nguyễn Hoàng Dũng ThS Lê Quỳnh Loan, thực Viện Sinh học Nhiệt đới Những số liệu kết phân tính đề tài hồn tồn trung thực, khơng chép từ nguồn tài liệu tham khảo khác hình thức Một số nội dung đồ án tốt nghiệp có tham khảo sử dụng liệu trích dẫn cơng bố cơng khai website, tác phẩm theo danh mục tài liệu tham khảo đồ án Nếu có chép không trung thực báo này, người thực đề tài xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường trươc ban giám hiệu trường Đại học Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh Ngày … tháng … năm 2017 Sinh viên thực Nguyễn Thị Yến Nhi i Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Trong thời gian vừa qua, giới thiệu trường Đại Học Cơng Nghệ TP HCM, em có dịp thực tập tìm hiểu Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tại trung tâm, em ôn lại, kiểm chứng kiến thức tích lũy ghế nhà trường vào thực tiễn học nhiều học kinh nghiệm thực tế hơn, tiếp xúc, tìm hiểu lồi vi sinh vật trang thiết bị phịng vi sinh Để hồn thành đợt thực tập này, em nhận nhiều quan tâm giúp đỡ nhiệt tình thầy cô, anh chị bạn Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Tiến sĩ Nguyễn Hoàng Dũng Thạc sĩ Lê Quỳnh Loan mở lòng nhận em vào thực tập trung tâm Trong suốt thời gian thực tập, thầy chị hết lịng hướng dẫn em, để em đạt kết nghiên cứu tốt nhất, am hiểu toàn phương pháp nghiên cứu Bên cạnh em xin cám ơn Tiến sĩ Hồng Quốc Khánh thầy Ngô Đức Duy Dù không trực tiếp hướng dẫn nghiên cứu, cho em lời khuyên vô quý báu, sâu sắc nụ cười rạng rỡ ngày Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến đến quý Thầy/Cô Khoa Công nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, trường Đại học Cơng Nghệ TP Hồ Chí Minh đẫ tận tình truyền đạt kiến thức bổ ích cho em cịn ngồi giảng đường trường đại học Lời cuối cùng, em xin gửi lời chúc tới tồn thể q thầy q giảng dạy, nghiên cứu Viện Sinh học Nhiệt Đới Đại học thành phố Hồ Chí Minh, thật dồi sức khỏe, để tiếp tục thực sứ mệnh cao đẹp truyền đạt kiến thức cho hệ mai sau Sinh viên thực Nguyễn Thị Yến Nhi ii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CÁM ƠN DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1:TỔNG QUAN 1.1.CHẤT HOẠT ĐỘNG BỀ MẶT (Surfacta 1.1.1.Định nghĩa 1.1.2 Cấu trúc phân tử 1.1.3.Đặc điểm 1.1.4.Phân loại 1.1.5.Ứng dụng 1.2.SOPHOROLIPIDS 1.2.1 Định nghĩa chât hoạt động bề mặt sinh học (Biosurfactants) 1.2.2.Sophorolipid 1.2.3.Cấu trúc 1.2.4.Đặc tính 1.2.5.Hạn chế 1.3 Candida bombicola ATCC 22214 1.4.TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 1.4.1.Ngồi nước 1.4.2.Trong nước CHƯƠNG 2:PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.Thời gian địa điểm nghiên cứu 2.2.Vật liệu nghiên cứu 2.2.1.Chủng vi sinh 2.2.2 Dụng cụ thiết bị 2.2.3.Hóa chất 2.3.Phương pháp nghiên cứu iii Đồ án tốt nghiệp 2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu 2.3.2 Tăng sinh bảo quản chủng Can 2.3.3 22214 Xây dựng đường cong tăng trưởn 23 2.3.4 Lên men 2.3.5 Thu nhận sophorolipids thô 2.3.6 Chạy sắc ký bảng mỏng (TLC) 2.3.7 thạch Xác định hoạt tính kháng khuẩn 26 2.3.8 Xác định nồng độ ức chế tối thiể 27 2.3.9 Xác định hoạt tính bắt gốc tự b CHƯƠNG 3:KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1.Đường cong tăng trưởng nấm men C 3.2.Lên men sophorolipids từ C bombicola 3.3.Thu nhận sophorolipids từ C bombicola 3.4.Sắc ký bảng mỏng (TLC) 3.5.Xác định hoạt tính kháng khuẩn phư 3.6.Xác định nồng độ ức chế tối thiểu p 3.7.Xác định hoạt tính bắt gốc tự phư CHƯƠNG 4:KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1.Kết luận 4.2.Kiến nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC A: SỐ LIỆU KHẢO SÁT CÁC HOẠT TÍNH CỦA SOPHOROLIPID Số liệu khảo sát đường cong tăng trưởng nấm men C bombicola ATCC 22214 1 Kết khảo sát khả kháng khuẩn SLs phương pháp khuếch tán giếng thạch (mm) 2 Kết khảo sát khả kháng oxy hóa SLs (OD517) Kết khảo sát khả kháng khuẩn SLs phương pháp MIC (OD600) iv Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B: HÌNH ẢNH KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CHDBM Chất hoạt động bề mặt CHDBMSH Chất hoạt động bề mặt sinh học DMSO Dimethyl sulfoxide DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl IC50 Inhibitory concentration 50% LB Luria Bertani LM Mơi trường lên men MIC Minimum inhibitory concentration OD Optical density SLs Sophorolipids TLC Thin-layer chromatography YM Môi trường tăng sinh/giữ giống v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số vi khuẩn tổng hợp nên loại CHDBMSH quan trọng (Desai vs cs, 1997) Bảng 1.2 Hoạt tính nhũ hóa SLs số loại dầu (Daverey Pakshirajan, 2009) 14 Bảng 1.3 Phân loài nấm Candida bombicola (Kurtzman Fell, 2001) 15 Bảng 1.4 Khả sinh hóa nguồn carbon C.bombicola (Spencer vs cs, 1970) 17 Bảng 3.1 Đường kính vịng kháng khuẩn hợp chất SLs 36 Bảng 3.2 Nồng độ ức chế tối thiểu SLs lên số chủng vi khuẩn 38 vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Natri stearate (C17H35COONa) – thành phần xà phịng Hình 1.2 Màng liên pha giữ dầu nước Hình 1.3 Các dạng phân bố phân tử hoạt động bề mặt Hình 1.4 Sự khác hoạt độ nước cấu trúc phân tử Hình 1.5 Sophorolipids tổng hợp Starmerella bombicola (Parekh cộng sự, 2012) Hình 1.6 Hai dạng SLs: lactonic (trái) – acidic (phải) Hình 1.7 Quy trình sinh tổng hợp nên SLs tế bào (Van Bogaert cộng sự, 2007) Hình 1.8 Tế bào C.bombicola Hình 1.9 Khuẩn lạc nấm C.bombicola ngày tuổi mơi trường YM Hình 2.1 Quy trình thu nhận SLs thơ từ q trình lên men chủng C bombicola Hình 2.2 Bố trí thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu SLs đĩa 96 giếng Hình 2.3 Cơ chế chuyển màu DPPH nhận phân tử hydro từ chất chống oxy hóa Hình 2.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả kháng oxy hóa SLs đĩa 96 giếng Hình 3.1 Biểu đồ đường cong tăng trưởng nấm men C bombicola ATCC 22214 Hình 3.2 Mơi trường lên men trước (trái) sau (phải) sau ngày Hình 3.3 Dịch lên men sau ngày lượng dầu Hình 3.4 Màng liên pha Hexane dịch lên men xuất bọt Hình 3.5 Sophorolipids thô thu nhận Hình 3.6 Kết chạy sắc ký TLC Hình 3.7 Kết khảo sát khả kháng khuẩn SLs thu phương pháp khuếch tán giếng thạch Hình 3.8 Biểu đồ thể khả kháng oxy hóa hỗn hợp SLs thơ vii Đồ án tốt nghiệp Hình Dịch lên men trước (trái) sau (phải) chiết với hexane .4 Hình Quá trình chiết dịch lên men với ethyl acetate Hình Kết khảo sát khả đối kháng Bacillus subtilis SLs Hình Kết khảo sát khả đối kháng Escherichia coli SLs Hình Kết khảo sát khả đối kháng Pseudonomas aeruginosa SLs Hình Kết khảo sát khả đối kháng Salmonella typhimurium SLs Hình Kết khảo sát khả đối kháng Staphylococus aureus SLs Hình Thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu Hình Thí nghiệm khảo sát khả chống oxy hóa viii Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Mỗi năm toàn giới người ta sản xuất khoảng 10 triệu chất hoạt động bề mặt (CHDBM), mức tiêu thụ chia cho ứng dụng hợp chất tẩy rửa ứng dụng công nghiệp (Van Bogaert cộng sự, 2007) CHDBM biết đến phạm trù ứng dụng rộng rãi như: chất tẩy rửa, thực/dược/mỹ phẩm, chế phẩm nông nghiệp Nhưng chủ yếu CHDBM tổng hợp theo đường hóa học nguồn gốc từ dầu mỏ, khó phân hủy có khả gây độc cho mơi trường Vì trọng tâm nghiên cứu CHDBM thời gian gần tìm CHDBM có nguồn gốc từ sinh học, chủ yếu vi sinh vật tổng hợp Ưu điểm chất hoạt động bề mặt sinh học (CHDBMSH) độc tính thấp, khả phân hủy sinh học cao khả ứng dụng rộng CHDBMSH chủ yếu glycolipid, phospholipids, hợp chất polyme lipopeptides Sophorolipid (SLs) CHDBMSH, cấu thành từ đường sophorose liên kết với chuỗi acid béo, chiều dài chuỗi phụ thuộc vào nguồn carbon sử dụng SLs CHDBMSH tổng hợp từ nguồn nguyên liệu tái sử dụng Khơng dừng lại đó, SLs cịn có khả ức chế số loại nấm men (Van Bogaert cộng sự, 2007), nấm bệnh thực vật (Yoo cộng sự, 2005) vi khuẩn (Mager cộng sự, 1987; Lang cộng sự, 1989) Ngoài SLs cịn có khả chống bám, ức chế hình thành màng sinh học (Zezzi cộng sự, 2012) Năm 2016, Việt Nam cơng trình nghiên cứu SLs hoàn thành - Thu nhận khảo sát số hoạt tính SLs từ trình lên men chủng Candida bombicola từ dầu dừa (L.Q Loan cộng sự, 2016) Tuy vậy, kết khảo sát hoạt tính SLs nghiên cứu thu từ nguồn dầu dừa Do nghiên cứu tiếp tục mở rộng sang nguồn nguyên liệu lên men khác, sử dụng nguồn dầu hạt cải – chứa 61% acid oleic đường glucose – đơn tử cấu thành sophorose, kế khảo sát số hoạt tính sinh học sophorolipid thu Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt L.Q Loan; N.Đ Duy; H.Q Khánh; N.H Dũng; N L H Hòa; N T B Huệ: Nghiên cứu thu nhận khảo sát số hoạt tính sophorolipid từ trình lên men chủng Candida bombicola từ dầu dừa; Tạp chí phát triển KH&CN, tập 19, số T5-2016, 15 – 25 N.Q Việt, N.B Hữu, Đ.T.C Hà, Khả tạo chất hoạt động bề mặt chủng vi khuẩn KC31, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 2, 501–510 (2004) Tài liệu nước A Daverey, K Pakshirajan, Production, characterization, and properties of sophorolipids from the yeast Candida bombicola using a low-cost fermentative medium, Appl Biochem Biotechnol, 158, 663–674 (2009) A.C Jose, G.O Felix, Sophorolipid production by Candida bombicola: Medium composition and culture method, J Biosci Bioeng., 88, 4888–494 (1999) Ashby, R.; Nuñez, A.; Solaiman, D Y.; Foglia, T., Sophorolipid biosynthesis from a biodiesel co-product stream Journal of the American Oil Chemists' Society 2005, 82 (9), 625-630 Chen, J.; Song, X.; Zhang, H.; Qu, Y B.; Miao, J Y., Sophorolipid produced from the new yeast strain Wickerhamiella domercqiae induces apoptosis in H7402 human liver cancer cells Applied Microbiology and Biotechnology 2006, 72 (1), 52-59 D Develter, S Fleurackers, I.V Bogaert, Method for the production of mediumchain sophorolipids, US 8530206 B2 (2013) D.A Cavalero, D.G Cooper, The effect of medium composition on the structure and physical state of sophorolipids produced by Candida bombicola ATCC 22214, Journal of Biotechnology, 103, 31–41 (2003) D.W.G Develter, L.M.L Lauryssen, Properties and industrial applications of sophorolipids, Eur J Lipid Sci Technol., 112, 628–638 (2010) 42 Đồ án tốt nghiệp Desai, J D.; Banat, I M Microbial production of surfactants and their commercial potential Microbiology and Molecular biology reviews 1997, 61, 47- 64 Fleurackers, S J J., On the use of waste frying oil in the synthesis of sophorolipids European Journal of Lipid Science and Technology 2006, 108 (1), 5-12 Gorin, P A J.; Spencer, J F T.; Tulloch, A P., hydroxyfatty acid glycosides of sophorose from torulopsis magnoliae Canadian Journal of Chemistry 1961, 39 (4), 846-855 H Marius, M.M Markus, H.K Johannes, B.L Roberta, C Jonas, S Christoph, H Rudolf, Rhamnolipids as biosurfactants from renewable resources: Concepts for next-generation rhamnolipid production, Process Biochemistry, 47, 1207–1219 (2012) Hirata, Y.; Ryu, M.; Oda, Y.; Igarashi, K.; Nagatsuka, A.; Furuta, T.; Sugiura, M., Novel characteristics of sophorolipids, yeast glycolipid biosurfactants, as biodegradable low-foaming surfactants J Biosci Bioeng 2009, 108 (2), 142-146 H.S Kim, Y.B Kim, B.S Lee, E.K Kim, Sophorolipid production by Candida bombicola ATCC 22214 from a corn-oil processing byproduct, J Microbiol Biotechnol., 15, 55–58 (2005) I.M Banat, R.S Makkar, S.S Cameotra, Potential commercial applications of microbial surfactants, Appl Microbiol Biotechnol, 53, 495–508 (2000) I.N Van Bogaert, K Saerens, C DeMuynck, D Develter, W Soetaert, E.J Vandamme, Microbial production and application of sophorolipids, Appl Microbiol Biotechnol., 76, 23–34 (2007) [21] S Vishal, B Daniel, R Peter, Sophorolipids Having Enhanced antibacterial activity, antimicrob, Agents Chemother., 51, 397–400 (2007) J F T SPENCER; P A J GORIN and A P TULLOCH Torulopsis bombicola sp n National Research Council of Canada Antonie van Leeuwenhoek 36 (1970) 129-133 J.D Desai, I.M Banat, Microbial production of surfactants and their commercial potential, Microbiol Mol Biol Rev, 61, 47–64 (1997) 43 Đồ án tốt nghiệp J.F.T Spencer, P.A.J Gorin, A.P Tulloch, Torulopsis bombicola sp n Antonie Van Leeuwenhoek, 36, 129–133 (1970) Kurtzman, Cletus Kurtzman, J.W Fell, Teun Boekhout The Yeasts: A th Taxonomic Study (4 edition), 2011 Lang S, Katsiwela E & Wagner F (1989) Antimicrobial effects of biosurfactants Fat Sci Technol 91: 363–366 M.H Gordon, I.A Rahman, Effect of processing on the composition and oxidative stability of coconut oil, JAOCS 68, 574–576 (1991) P.A.J Gorin, J.F.T Spencer, A.P Tulloch, Hydroxy fatty acid glycosides of sophorose from Torulopsis magnolia, Can J Chem., 39, 846–855 (1961) Parekh, V J.; Pandit, A B., Solid State Fermentation (SSF) for the Production of Sophorolipids from Starmerella bombicola NRRL Y-17069 using glucose, wheat bran and oleic acid Current Trends in Biotechnology and Pharmacy 2012, (4), 418-424 R.K Hommel, L Weber, A Weiss, U Himmelreich, O Rilke, H.P Kleber, Production of sophorose lipid by Candida (Torulopsis) apicola grown on glucose, J Biotechnol., 33, 147–155 (1994) R.M Maier, G Soberón-Chávez, Pseudomonas aeruginosa rhamnolipids: biosynthesis and potential applications, Appl Microbiol Biotechnol, 54, 625–633 (2000) R.M Mann, J.R Bidwell, The acute toxicity of agricultural surfactants to the tadpoles of four Australian and, two exotic frogs, Environ Pollut., 114, 195–205 (2001) Shah, V.; Jurjevic, M.; Badia, D., Utilization of restaurant waste oil as a precursor for sophorolipid production Biotechnol Prog 2007, 23 (2), 512-515 Shao L, Song X, Ma X, Li H, Qu Y Bioactivities of sophorolipid with different structures against human esophageal cancer cells J Surg Res 2012 Apr;173(2):286-91 44 Đồ án tốt nghiệp U Gobbert, S Lang, F Wagner, Sophorose lipid formation by resting cells of Torulopsis bombicola, Biotechnol Lett, 6, 225–230 (1984) V.K Morya, J.H Park, T.J Kim, S Jeon, E.K Kim, Production and characterization of low molecular weight sophorolipid under fed-batch culture, Bioresource Technology, 143, 282–288 (2013) Van Bogaert IN, Saerens K, De Muynck C, Develter D, Soetaert W & Vandamme EJ (2007) Microbial production and application of sophorolipids Appl Microbiol Biot 76: 23–34 Vishal Shah, Gustavo F Doncel, Theodoros Seyoum, Kristin M Eaton, Irina Zalenskaya, Rena Hagver, Abul Azim, and Richard Gross Sophorolipids, Microbial Glycolipids with Anti-Human Immunodeficiency Virus and Sperm-Immobilizing Activities Antimicrob Agents Chemother 2005 Oct; 49(10): 4093–4100 Wadekar, S.; Kale, S.; Lali, A.; Bhowmick, D.; Pratap, A., Sophorolipid production by starmerella bombicola (ATCC 22214) from virgin and waste frying oils, and the effects of activated earth treatment of the waste oils JAOCS, Journal of the American Oil Chemists' Society 2012, 89 (6), 1029-1039 Yoo DS, Lee BS & Kim EK (2005) Characteristics of microbial biosurfactant as an antifungal agent against plant pathogenic fungus J Microbiol Biot 15: 1164– 1169 Zezzi Valle Gomes M, Nitschke M Evaluation of rhamnolipid and surfactin to reduce the adhesion and remove biofilms of individual and mixed cultures of food pathogenic bacteria Food Control 2012;25:441–7 45 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC A: SỐ LIỆU KHẢO SÁT CÁC HOẠT TÍNH CỦA SOPHOROLIPID Số liệu khảo sát đường cong tăng trưởng nấm men C bombicola ATCC 22214 Thời gian (giờ) 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168 180 192 204 236 248 Đồ án tốt nghiệp Kết khảo sát khả kháng khuẩn SLs phương pháp khuếch tán giếng thạch (mm) Vi khuẩn khảo sát Bacillus subtilis Escherichia coli Pseudonomas aeruginosa Salmonella typhimurium Staphylococus aureus Kết khảo sát khả kháng oxy hóa SLs (OD517) Nồng độ SLs (mg/ml) 20 10 2.5 1.25 0.625 0.3125 0.156 0.078 Vit 10X Vit 1X Đồ án tốt nghiệp Control Kết khảo sát khả kháng khuẩn SLs phương pháp MIC (OD600) Vi khuẩn khảo sát Bacillus subtilis Escherichia TRƯỚ C coli Pseudonomas aeruginosa Salmonella typhimurium Staphylococus aureus Bacillus subtilis Escherichia coli SAU Pseudonomas aeruginosa Salmonella typhimurium Staphylococus aureus Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B: HÌNH ẢNH KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Hình Dịch lên men trước (trái) sau (phải) chiết với hexane Hình Quá trình chiết dịch lên men với ethyl acetate Đồ án tốt nghiệp Hình Kết khảo sát khả đối kháng Bacillus subtilis SLs Hình Kết khảo sát khả đối kháng Escherichia coli SLs Đồ án tốt nghiệp Hình Kết khảo sát khả đối kháng Pseudonomas aeruginosa SLs Hình Kết khảo sát khả đối kháng Salmonella typhimurium SLs Đồ án tốt nghiệp Hình Kết khảo sát khả đối kháng Staphylococus aureus SLs Hình Thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu Đồ án tốt nghiệp Hình Thí nghiệm khảo sát khả chống oxy hóa ... tính Sophorolipids thu nhận qua q trình lên men chủng Candida bombicola ATCC 22214 từ nguồn dầu hạt cải đường glucose Nhiệm vụ nghiên cứu - Lên men chủng nấm Candida bombicola ATCC 22214 - Thu nhận. .. SLs thô thu từ dịch nuôi cấy nấm C bombicola ATCC 22214 từ nguồn dầu hạt cải đường glucose 20.76 g/l Trong hỗn hợp SLs thơ thu có diện 1,4” – Sophorolactone 6’,6” – diacetate Ngoài hỗn hợp thu cịn... hoàn thành - Thu nhận khảo sát số hoạt tính SLs từ trình lên men chủng Candida bombicola từ dầu dừa (L.Q Loan cộng sự, 2016) Tuy vậy, kết khảo sát hoạt tính SLs nghiên cứu thu từ nguồn dầu dừa Do