chiết xuất dược liệukỹ thuật chiết suấtlọcphương pháp chiếtsắc kýChiết xuất dược liệu là có nguồn gốc nguyên liệu trong tự nhiên chứa các tinh chất quý giá mà còn người không thể tự tổng hợp. Sự kết hợp theo các công thức hóa học nhất định của những thành phần lấy từ các bộ phận trên thảo dược ( hoa, quả, hạt, lá, cành, thân, rễ, củ…) ở dạng tươi hoặc đã qua sơ chế, sây khô.
CHIẾT SUẤT MỘT SỐ HỢP CHẤT KHÁC Tổ – Dược 5BK3 I CHIẾT XUẤT ARTEMISININ TỪ LÁ THANH CAO HOA VÀNG CÂY THANH CAO HOA VÀNG Tên khác: Thanh hao hoa vàng, Ngải đắng, Qinghao TKH: Artemisia annua L Asteraceae Mọc hoang: Trung quốc, Việt Nam, Mỹ, một số nước châu Âu và Đông Nam Á Đến trồng Trung Quốc, Việt Nam và một số nước châu Phi Thân thảo sống hàng năm, cao 1,2 – 1,5 m Cây ưa sáng, chịu hạn và kháng sâu bọ Cây có mùi đặc biệt giúp xua đuổi côn trùng Hạt gieo trồng vào đầu mùa xuân Cây cao 15-25 cm tỉa trồng đại trà Sau 5-6 tháng, bắt đầu nụ thì thu hoạch lá (Chặt cả cây, tuốt lá rồi phơi khô hoặc phơi nắng cả rồi rũ lấy lá khô) Sau này, thu lá theo cách tỉa dần đến lúc có hoa thì chặt cả lấy lá CÂY THANH CAO HOA VÀNG - Artemisinin phân bố nhiều bộ phận của cây: lá, nụ hoa, cành non - Lá chỉ chiếm khối lượng 20% so với toàn cây, chứa 90% lượng Artemisinin - Hàm lượng Artemisinin lá cao nhất lúc bắt đầu nụ, có thể tới 1,6% - Thanh cao sản xuất và dự trữ Artemisinin các cụm lông tiết bề mặt lá và hoa Lá già, tế bào vỡ tiết dẫn đến hàm lượng Artemisinin giảm - Ngoài Artemisinin, 150 hợp chất đã được xác định, đó có nhiều sesquiterpene acid artemisinic (qinghao acid), qinhaosu I (arteannuin A), qinhaosu II (arteannuin B), qinhaosu III (deoxyartemisinin) … Tất cả các sesquiterpene đều có sự liên hệ mật thiết với và đều có cùng một đặc trưng là sự có mặt của bộ khung sis-decalin phân tử CÂY THANH CAO HOA VÀNG - Artemisiten cũng có hoạt chất trống sốt rét thấp artemisinin Hàm lượng artemisiten thường tỉ lệ nghịch với artemisinin (khoảng 0,1%) và dễ kết tinh cùng artemisinin Tạp chất liên quan này khó tách khỏi artemisinin bằng phương pháp kết tinh mà phải dùng sắc ký cột - Hàm lượng Acid artemisinic > artemisinin ~ 10 lần Được cho là tiền chất sinh tổng hợp artemisinin - Ngoài ra, lá chứa 1% tinh dầu, một số flavonoid, coumarin, nhựa và sáp • Sáp là tạp chất chính chiết x́t artemisinin • Sáp khơng tan aceton → dùng aceton để phát hiện artemisinin có lẫn sáp không ARTEMISININ - Artemisinin (C15H22O5), dạng bột kết tinh trắng hoặc tinh thể hình kim không màu Nhiệt độ nóng chảy là 151°C-154°C - Thực tế không tan nước, rất tan: dicloromethan, dễ tan: aceton và ethyl acetat, tan: acetic băng, ethanol và methanol - Artemisinin tinh kiết khá bền vững dưới tác dụng của nhiệt độ, không bị phân huỷ nhiệt độ chảy và cũng không bị biến đổi nhiệt độ cao đợ chảy 50°C vịng phút → có thể tinh chế bằng phương pháp thăng hoa - Artemisinin dễ bị thủy phân môi trường acid và kiềm - Artemisinin và câc dẫn chất (Artesunat, artemether) là nhóm thuốc có hiệu lực cao đối với kí sinh trùng sốt rét, làm giảm số lượng kí sinh trùng với hệ số khoảng 1000 lần chu kì vô tính, nhiều các thuốc sốt rét khác (Với hệ số từ 100 đến 1000 lần) => Do đó thuốc có tác dụng làm sạch ký sinh trùng và cắt sốt nhanh CHIẾT XUẤT ARTEMISININ 3.1 Một số pp sử dụng: •Artemisinin được phân lập đầu tiên tại Trung Quốc công bố đầu tiên về pp chiết phòng thí nghiệm là của Klayman và các cộng sự với dung môi Petrolether (30-60oC) và sắc ký dịch cô đặc cột Silicagel triển khai bằng dm Cloroformethylacetat •El Feraly và cợng sự thực hiện chiết quy mô sản xuất bằng dm n-hexan và pp sắc ký cột silicagel với hệ dm ethylacetat Một số pp sử dụng giới: •Chiết xuất bằng dm n-hexan •Chiết xuất bằng ethanol •Chiết xuất bằng dm CO2 siêu tới hạn •Chiết xuất bằng dd ion lỏng CHIẾT XUẤT ARTEMISININ 3.1 Một số pp sử dụng: Tiêu chí dm n-hexan Ethanol dm CO2 siêu tới hạn dd ion lỏng Đặc điểm phù hợp với tính chất lý hóa Astermisinin - Ít hịa tan, hịa tan tốt + vài % aceton, - Hòa tan tốt cồn cloroform hay ethylic - Độ nhớt thấp, sức căng bề mặt ≈ -> thấm vào nhanh sâu so với dm lỏng - Hòa tan tốt - Là muối dạng lỏng điều kiện thường - Hịa tan tốt Ưu điểm - Khơng độc hại, an tồn -Cách tiến hành - Dm chiết với mơi trường đơn giản độc - Việc loại dm khí đơn -Chi phí thấp giản so với dm lỏng - Bền nhiệt, an tồn với mơi trường - Chi phí thấp hiệu suất chiết - Dễ cháy nổ, thấp dễ cháy chi phí cao Nhược điểm nổ - Artemisinin ổn định - Cần thiết bị chuyên dụng, đắt - Cần cơng nghệ - Khơng thích hợp với kỹ thuật cao mẫu chiết lỏng CHIẾT XUẤT ARTEMISININ 3.2 PP chiết xuất Astemisinin dm n-hexan : Ở Việt Nam, từ năm 1990 đã có nghiên cứu chiết Artemisinin Hiện dùng pp chiết xuất bằng n-hexan hoặc xăng cơng nghệ chủ Vì chủ ́u chọn n-hexan mà ko dùng Xăng công nghệ ? yếu dùng n-hexan • Ưu điểm: dung mơi khá chọn lọc, quy trình đơn giản, chi phí thấp • Nhược điểm: hiệu suất chiết thấp (chỉ 60-70%); dung môi độc, ô nhiễm, dễ cháy nổ Xăng hỗn hợp nhiều loại Hidrocacbon no mạch thẳng (tương tự n-hexan); rẻ, dễ kiếm Tuy nhiên hỗn hợp, nên ko chọn lọc, thành phần khơng ổn định, nên khó kiểm sốt đặc tính độ hịa tan, nhiệt độ, cách thức loại dung môi,… - Chuẩn bị nguyên liệu: Lá phơi khô rồi xay thành bột và nạp vào bình chiết -> giúp tăng tỉ trọng nguyên liệu -> tăng khối lượng mẻ chiết và tiết kiệm dung môi - Quy trình: gồm quá trình chiết xuất (bằng pp ngâm phân đoạn ngược dòng hoặc pp chiết Soxhlet) và quá trình tinh chế CHIẾT XUẤT ARTEMISININ 3.2.1.Quy trình chiết xuất Astemisinin dm n-hexan Bột hao Chiết xuất Dung môi n-Hexan Dịch chiết -Nhiệt độ: 40-50 oC -Chiết lần: dịch chiết lần làm dm chiết lần cho mẻ khác -Thời gian chiết: -Dung môi/Nguyên liệu: 5/1 Bã dược liệu Cất thu hồi n- Hexan Dịch cô đặc 1/10 Để kết tinh, vẩy ly tâm Astemisinin + Sáp Ít 24h Rửa sáp xăng nóng Astemisinin thơ Sáp/ Xăng(bỏ) Acid shikimic 03 ĐẠI HỒI 01 02 Cây Đại Hồi Quy trình chiết suất acid shikimic từ đại hồi 1.CÂY ĐẠI HỒI Đặc điểm thực vật phân bố Cây cao – 10m Cành mọc thẳng tạo cho dạng thon gọn tán hẹp Lá mọc so le thường mọc sít tạo thành vịng giả, từ – Lá thon dài hình bầu dục mép ngun có lượn sóng khơng Lá dễ rụng khỏi cành cắt cành rời khỏi Hoa có nhiều màu: Trắng, trắng hồng, hồng, tím hồng Nỗn đa số có – 10 Quả đại, thường có đại dính vào trục toả trịn thành hình Trong đại có chứa hạt màu nâu bóng Thường có từ – đại bị lép Có cho đến 10 đại, to bị lép Quả tươi có màu xanh, khơ màu nâu thẫm Hồi coi đặc sản tỉnh Lạng Sơn, trồng hầu hết huyện tỉnh, trừ Hữu Lũng Nam Chi Lăng Ngồi cịn trồng Cao Bằng, Quảng Ninh, Bắc Thái (vùng giáp với Lạng Sơn) Năm 1999, toàn Lạng Sơn trồng 17000 hồi, thu hoạch 15000 tươi Hồi trồng Trung Quốc (Quảng Tây, Nam Ninh) Trồng hạt Chọn to cánh từ – 10 cánh (đại) độ tuổi trưởng thành (30 – 40 tuổi), không bị sâu bệnh, thường xuyên sai chăm sóc tốt Phơi nắng nhẹ, nứt, hạt rơi Bảo quản hạt cát tháng hạt nứt nanh – 10% gieo Thường gieo trước tết nguyên đán tuần Khi cấy vào bầu Cây 20 – 25 tháng tuổi đem trồng Trồng trọt thu hái Cây hoa vào lúc tuổi Những năm sản lượng thường thấp Cây trưởng thành, năm cho từ 20 – 40 kg Có thể khai thác đến 100 tuổi Hồi khai thác vào vụ Vụ vào tháng – (hồi mùa), vụ phụ từ tháng 11 – tháng năm sau (vụ chiêm) Thường sai vào vụ mùa vào vụ chiêm ngược lại – Quả – Fructus Anisi stellati – Tinh dầu – Oleum Anisi stellati Đăc điểm vi học: + Quả (bôt): Nhiều tế bào mô cứng hình dạng khác vỏ giữa, vỏ vỏ hạt Thể cứng cuống Nhiều tế bào chứa tinh dầu + Lá (vi phẫu): Có thể cứng hình dáng đăc điểm gân phiến (để phân biêt với hồi núi I griffithii, khơng cứng có đám tế bào mô cứng) Quả phơi khô đến đô ẩm 12 – 13% Tinh dầu cất từ tươi vừa thu hái với hiêu suất 3-3,5% Tinh dầu hồi Lạng Sơn thị trường quốc tế xếp loại I Hàng năm nơi cấp 2/10 sản lượng tồn giới, cịn lại Quảng Tây (3/10) Nam Ninh (5/10) (tinh dầu loại II) Bộ phận dùng Cơng dụng – Quả hồi có tác dụng giúp tiêu hố, lợi sữa, giảm đau, giảm co bóp nhu đông ruôt, dùng để chữa ỉa chảy, nôn mửa, ăn khơng tiêu, bụng đầy Tính vị Đơng y: Vị cay, ôn, tác dụng vào kinh can, thân, tỳ, vị, có tác dụng ơn trung khứ hàn Dạng dùng: bơt, rượu thuốc Dùng ngồi hồi có tác dụng chữa đau nhức, thấp khớp, bong gân – Tinh dầu hồi có tác dụng tương tự dược liêu, thường phối hợp nhiều thuốc khác Ngoài tinh dầu dùng để tổng hợp hormon oestrogen (diethylstilbestrol, diethylstilbestrol propionat) Quả hồi tinh dầu hồi được dùng làm gia vị hương liêu cho nhiều sản phẩm kỹ nghê thực phẩm: rượu mùi, kẹo gum, bánh kẹo, gelatin, puding, thịt sản phẩm thịt Hàm lượng tinh dầu tối đa phép đưa vào thực phẩm 0,07% Ngồi tinh dầu cịn dùng kỹ nghê sản xuất xà phòng, kem đánh răng, thuốc v.v Acid shikimic •Acid shikimic (acid 3,4,5-trihydroxy-1-cyclohexan-1-carboxylic , C7H10O5) chất kết tinh màu trắng tan phần nước , 45 phần ethanol tuyệt đối , tan methanol , không tan ethylacetat, aceton , chloroform , benzen , ether dầu hỏa Acid shikimic (acid 3,4,5-trihydroxy-1-cyclohexan-1-carboxylic , C7H10O5) chất kết tinh màu trắng tan phần nước , 45 phần ethanol tuyệt đối , tan methanol , không tan ethylacetat, aceton , chloroform , benzen , ether dầu hỏa • Nguồn gốc Acid shikimic có nhiều loài thực vật đại hồi , bạch quả , quyển bá trường sinh kha tử , chuối tiêu, hướng dương, tiểu hồi … Nhưng hiện đại hồi vẫn là nguyên liệu quan trọng để chiết xuất, hàm lượng acid shikimic quả hồi tương đối cao (5%-10%) Acid shikimic cịn có ng̀n gớc từ tởng hợp hoặc bán tởng hợp • Vai trị : Trong sinh học nói chung, acid shikimic đóng vai trò quan trọng quá trình sinh tổng hợp các acid amin thơm phenylalanin, tryptophan, tyrosin; các alcaloid, hợp chất phenolic, các phenyl propanoid Nó là chất trung gian hóa học quan trọng của các quá trình chuyển hóa thực vật và vi sinh vật Về tác dụng dược lý : acid shikimic có tác dụng chống viêm, giảm đau, có khả ức chế ngưng tập tiểu cầu và bệnh tắc nghẽn động mạch Trong lĩnh vực tổng hợp hóa dược , acid shikimic là nguyên liệu để bán tổng hợp oseltamivir phosphat – mợt chất có vai trị ức chế neuraminidase,một enzym cần cho quá trình giải phóng và lây lan virus từ các tế bào bị nhiễm Oseltamivir phosphat có tác dụng virus cúm type A và type B, đặc biệt với chủng H5N1 33 KỸ THUẬT CHIẾT XUẤT ACID SHIKIMIC TỪ QUẢ ĐẠI HỒI • Từ Đại hồi, dùng phương pháp cất kéo nước để thu lấy tinh dầu • Phần dịch nước, sau loại bớt tạp chất, dùng phương pháp sắc ký trao đổi ion để rửa tạp chất, rửa giải, thu dịch rửa giải • Dịch rửa giải sau cô thành cao mềm, tinh chế tẩy màu, đem kết tinh lạnh, thu tinh thể, sấy khô thu acid shikimic tinh khiết • Quy trình cụ thể tóm tắt sau: Sơ đồ bước chiết xuất acid shikimic từ Đại hồi QUẢ ĐẠI HỒI Cất kéo nước BẢ ĐẠI HỒI Chiết lần Cô đặc DỊCH NƯỚC TINH DẦU HỒI Cô đặc DỊCH ĐẶC Ethanol 96% Loại bỏ tạp chất DỊCH TINH CHẾ Nạp vào cột nhựa anionit Rửa tạp chất nước Rửa giải NaCl Nước, NaCl DỊCH RỬA GIẢI Ethanol 90% Than hoạt Cô đặc Loại muối Tẩy màu Kết tinh ACID SHIKIMIC Nhận xét đánh giá • Acid shikimic phân lập nhựa trao đổi ion, hoạt chất dễ tan nước, tan EtOH, MeOH khó kết tinh • Quy trình ngồi chiết xuất acid shikimic cịn thu tinh dầu hồi • Khơng sử dụng hóa chất độc hại (MeOH, Formandehyd, ) • Có thể tái sử dụng hạt nhựa nạp cột chứa pha tĩnh • Quy trình thao tác khơng phức tạp Nhận xét đánh giá Nhược điểm •Tính kinh tế khơng cao sử dụng hạt nhựa trao đổi ion =>tốn •Hiệu suất quy trình khơng cao.(10kg hạt nhựa hấp phụ 1kg acid shikimic; acid shikimic tan EtOH ) Tài liệu tham khảo • Bộ mơn Cơng nghiệp Dược_ Trường Đại học Dược HN, Kỹ thuật chiết xuất dược liệu, NXB Y học, 2017 • Bộ Y tế, Hóa phân tích tập 2, NXB Y học, 2012, tr 190- 193 • Phùng Thị Mỹ Hạnh, Lưu Thị Quyên, Nghiên cứu chiết xuất acid shikimic từ Đại hồi, Tạp chí Dược học, số 448, 2013 CÁM ƠN CÔ VÀ CÁC BẠN ĐÃ LẮNG NGHE ... •Hiệu suất quy trình không cao.(10kg hạt nhựa hấp phụ 1kg acid shikimic; acid shikimic tan EtOH ) Tài liệu tham khảo • Bộ mơn Cơng nghiệp Dược_ Trường Đại học Dược HN, Kỹ thuật chiết xuất dược liệu, ... Chiết xuất DỊCH CHIẾT BÃ DƯỢC LIỆU Cất thu hồi aceton CAO NGHỆ n-hexan Loại chất béo CAO ĐÃ LOẠI CHẤT BÉO Thêm đồng lượng ethanol 96% Để kết tinh CURCUMINOID THÔ Ethanol 96% Than hoạt... Cần thiết bị chuyên dụng, đắt - Cần công nghệ - Không thích hợp với kỹ thuật cao mẫu chiết lỏng CHIẾT XUẤT ARTEMISININ 3.2 PP chiết xuất Astemisinin dm n-hexan : Ở Việt Nam, từ năm 1990 đã