Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học loài mít lá đen artocarpus nigrifolius c y wu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ N ỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Lê ThịTú Anh NGHIÊN C ỨU THÀNH PH ẦN HÓA H ỌC VÀ HO ẠT TÍNH SINH HỌC LỒI MÍT LÁ ĐEN ARTOCARPUS NIGRIFOLIUS C.Y.WU LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà N ội - 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ N ỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Lê ThịTú Anh NGHIÊN C ỨU THÀNH PH ẦN HÓA H ỌC VÀ HO ẠT TÍNH SINH HỌC LỒI MÍT LÁ ĐEN ARTOCARPUS NIGRIFOLIUS C.Y.WU Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã s ố: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Nguyễn Văn Tuyến Hà N ội - 2012 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm thực vật loài Artocapus n 1.2 Ứng dụng y học cổ truyền chi 1.3 Hoạt tính sinh học thành ph ần hóa h 1.3.1Hoạt t 1.3.2Hoạt tí 1.3.3Hoạt tí 1.3.4 Một số hoạt tính sinh học khác 1.4 Các phương pháp nghiênứcu hoạt tính sinh học in vitro 1.4.1Phươn 1.4.2Phươn 1.4.3Phươn Chương 2: THỰC NGHIỆM 2.1 Mẫu thực vật thi ết bị, hóa ch ất 2.1.1 Mẫu thực vật 2.1.3 Thiết bị hóa ch ất thử hoạt tính sinh học 2.2 Phương pháp nghiênứcu 2.2.1 Phương pháp tách chiết 2.2.2 Phương pháp xácđịnh cấu trúc 2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 2.2.4 Phương pháp ửs lý s ố liệu 2.3 Thực nghiệm 2.3.1 Chiết mẫu thực vật 2.3.2 Sàng l ọc sơ hoạt tính dịch chiết phận 2.3.3 Phân l ập chất 2.3.4 Thử hoạt tính chất `Chương 3: KẾT QUẢ VÀ TH ẢO LUẬN 3.1 Sàng l ọc sơ hoạt tính dịch chiết phận 35 3.2 Thành ph ần hóa h ọc Mít đen (Artocapus nigrifolius C Y Wu) .39 3.3 Hoạt tính sinh học chất 45 KẾT LUẬN VÀ KI ẾN NGHỊ 52 PHỤ LỤC DAN 1H-NMR 13 C-NMR HMBC HMQC s d t q J (Hz) δ(ppm) KB HepG2 MCF7 LU IC 50 ED50 SKC DMSO DANH Hình 1.1 Đặc điểm thực vật lồi Mít đen Artocapus nigrifolius C.Y.Wu Hình 1.2 Các phương pháp nghiênứcu Hình 1.3 Phương pháp nghiênứcu tác Hình 2.1 Quy trình chiết mẫu vỏ th Hình 2.2: Phân l ập chất từ cao chiết diclometan Hình 3.1 Sắc ký c ột cao chiết DCM SKBM m ột số phân đoạn cao chiết mẫu vỏ thân Hình 3.2 Sắc ký b ản mỏng so sánh caủ ADF2 β-sitosterol Hình 3.3: Tỉ lệ phần trăm ức chế vi sinh vật theo nồng độ AFD6 Hình 3.4 Minh họa ảnh hưởng AFD6 dòng tế bào ung th biểu mơ KB Hình 3.5 Minh họa ảnh hưởng AFD6 dịng tế bào ung th gan Hep-G2 Hình 3.6 Minh họa ảnh hưởng AF Hình 3.7 Minh họa ảnh hưởng AF Hình 3.8 Minh họa thử nghiệm chống AFD6 DANH Bảng 3.1 Hiệu suất ngâm chi ết cá Bảng 3.2 Kết thử hoạt tính kh C Y Wu Bảng 3.3 Hoạt tính chống ơxy hoá mẫu lá, vỏ thân, r ễ cành Artocarpus nigrifolius C Y Wu Bảng 3.4 Hoạt tính gây độc tế bào c cao dịch chiết phận loài Artocarpus nigrifolius C Y Wu 13 Bảng 3.5: C – NMR c chất AFL2 AFD3 (CDCl 3) (CDCl3 + CD 3OD) Bảng 3.6 Hoạt tính kháng sinh chất chiết tách ừt lồi Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu Bảng 3.7 Hoạt tính gây độc d Bảng 3.8 Hoạt tính gây độc d Bảng 3.9 Hoạt tính chống oxy hóa MỞ ĐẦU Việt Nam n ước có h ệ thực vật phong phú đa dạng Tổng số loài th ực vật ghi nh ận Việt Nam khoảng 10.500 loài t số 12.000 loài theo ước tính Trong số đó, ngu ồn tài ngun làm thu ốc chiếm khoảng 30% Kết điều tra nguồn tài nguyên thuốc Viện Dược liệu (2006) cho biết Việt Nam có 3.948 lồi th ực vật bậc cao, bậc thấp n ấm lớn dùng làm thu ốc Trong thời gian qua, nước ta có h ơn 3.000 loại thuốc có ngu ồn gốc từ thảo dược cấp số đăng ký, chi ếm gần 1/3 tổng số thuốc cấp số đăng ký l ưu hành hàng năm Như nhu cầu sử dụng d ược liệu chế xuất thuốc nước r ất lớn Không nh ững vậy, việc sử dụng dược phẩm có ngu ồn gốc thiên nhiênũcng nước giới quan tâm Chi Artocarpus (họ Dâu t ằm, Moraceae) m ột chi thực vật phổ biến Việt Nam với 15 lồi Trong đó, ngồi giá trị làm th ực phẩm nhiều lồi cịn sử dụng y học dân gian để chữa bệnh thấp khớp, hạ huyết áp, tiểu đường mít (Artocarpus heterophyllus), xa kê Artocarpus( altilis)…Thành ph ần hóa học hoạt tính sinh học lồi thuộc chi Artocarpus nhà khoa học giới quan tâm nghiên cứu từ lâu, nhi ều hợp chất với hoạt tính tốt cơng b ố [31] Tuy nhiên,ở Việt Nam có m ột số loài nghiên ứcu như: Chay Bắc (Artocarpus tonkinensis), Chay to (Artocarpus lakoocha Roxb.) Mít dai ( Artocarpus heterophyllus Lamk.) Các nghiên ứcu c ũng tìm số chất thuộc nhóm auronol glucosid có hoạt tính sinh học tốt có th ể ứng dụng vào cu ộc sống ti ền đề cho nghiên cứu [6] Ở Việt Nam lồi mít đen Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu tìm thấy b ổ sung vào danh m ục lồi c chi mít (Artocarpus) năm 2011 nhóm tác giả PGS.TS Trần Minh Hợi, viện Sinh thái Tài nguyên sinh ậvt Nhóm tác giả cơng b ố hoạt tính sinh học cho kết đáng quan tâm Do v ậy, chúng tơi l ựa chọn lồi làm đối tượng nghiên ứcu th ực đề tài “ Nghiên cứu thành ph ần hóa h ọc ho ạt chất sinh học lồi mít đen Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu” Mục tiêu ủca luận văn nghiên cứu thành ph ần hóa h ọc phát hợp chất hóa h ọc có ho ạt tính sinh học lồi Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu Để đạt mục tiêu ựthc nội dung sau: - Thu hái vàđịnh tên - Xử lý m ẫu - Tách chiết, phân l ập, xácđịnh cấu trúc thành phần hóa h ọc - Thử hoạt tính sinh học mẫu cao chiết hợp chất tinh Chương - TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm thực vật loài Artocarpus nigrifolius C Y Wu Chi Artocarpus thuộc họ dâu t ằm (Moraceae), m ột họ thực vật lớn gồm khoảng 60 chi h ơn 1400 loài, phân b ố chủ yếu vùng nhiệt đới c ận nhiệt đới châu Á Trên th ế giới chi g ồm khoảng 60 loài, ph ần lớn thân g ỗ, có nhựa mủ màu tr ắng Hoa đơn tính gốc Hoa đực gồm hai hay bốn phiến, nhị với nhị với bao phấn hai bên, mở hai kẽ nứt Hoa có màu xanh, nhỏ phát triển thành gié nạc, ngắn Sau thụ phấn chúng phát triển thành qu ả tụ, có th ể phát triển to Lá kèm ừt nhỏ Artocarpus integer (Thunb.) Merr (mít tố nữ) nguyên lớn x ẻ thùy Artocarpus communis Forst & Forst.f ( Xa kê) Một số lồi chi có qu ả ăn nênđược trồng nhiều nước giới Artocarpus heterophyllus, Artocarpus integer, Artocarpus rigidus, Artocarpus tokinensis Theo Phạm Hoàng H ộ, chi Artocarpus Việt Nam có 15 lồi d ưới lồi [4] Lồi Artocarpus nigrifolius C Y Wu Cây thân g ỗ cao 15m, mọc thẳng, cành nâu s ậm, vỏ sần sùi có n ếp nhăn dày 1- 2,5 mm Chồi non ngắn có lơng màu nâu đen rỉ sắt Cuống láđen, mỏng, dài 1,8 -2,8 cm có lơng màu nâu đen cịn non, phi ến hình elip elip hẹp, kích thước 5-11 x 2-4 cm, mỏng giấy, phía xa gân gi ữa có màu xanh nâu lơng nhỏ màu tr ắng, phía gần gân gi ữa có màu gần đen khơng lơng, g ần cuống có hình nêm ộrng, gân khơng đối xứng; phần có chóp nh ọn dài 0,5-1,5cm Phần gân gân lo ại rõ hai mặt lá, gân loại khơng lộ Cụm hoa đơn tính mọc nách ụCm hoa đực có kích th ước 4-7mm hoa đơi, cụm hoa có màu trắng cịn non, màu xanh s ậm khơ, hình nón ng ược, 5-9mm, có n ốt sần, chỏm cánh hoa có dạng tù, cuống dài 1-1,5 cm, m ỏng Tiến hành thu m ẫu ỉtnh: Sơn La, Phú Thọ thu tiêu v ật mẫu cành, lá, Hình 3.8 Minh họa thử nghiệm chống oxy hóa theo phương pháp ửs dụng DPPH AFD6 Từ kết tr ên, n ận thấy, artochamin B l ch ất có kh ả chống oxy hóa t ốt Gi trị ức chế có hi ệu gốc tự DP PH chất đạt EC 50 = 20,51 µg/ml; điều nà y b ởi artochamin B h ợp chất thuộc nhóm flavonoid, m ột nhóm ch ất chứng minh có kh ả chống oxy hóa r ất hiệu Như vậy, qua k ết thử nghiệm hoạt tính sinh học hợp chất phân l ập từ lồi Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu có th ể thấy: a rtochamin B có ho ạt tính tốt tất thử nghiệm Trong đó, artochamin B có tác động đặc biệt tốt với dịng u ng th thử nghiệm, có kh ả ức chế dòng t ế bào đạt IC50 tốt trê n dịng KB 1,18 µg/ml KẾT LUẬN VÀ KI ẾN NGHỊ Về hoạt tính dịch chiết phận cây: Bốn dịch chiết phận mít đen gồm: vỏ thân, lá, cành, rễ thể hoạt tính thử nghiệm Trong đó: - Hoạt tính kháng sinh: cácịchd chiết lá, vỏ thân, cành, r ễ có ho ạt tính kháng chủng vi sinh vật gram (+) với IC50 khoảng 3,65- 95,09 µg/ml - Hoạt tính chống xy hố DPPH: ngồi mẫu cành, mẫu có ho ạt tính, đặc biệt mẫu vỏ thân có ho ạt tính mạnh với giá trị EC50 42,08 µg/ml - Hoạt tính gây độc tế bào: b ốn cặn chiết thể hoạt tính gây độc tế bào dòng ung th thực nghiệm KB, HepG2, Lu MCF7 v ới giá ịtr IC50 khoảng 10µg/ml – 86µg/ml Về thành ph ần hóa h ọc cây: Từ vỏ thân lồi mít đen (Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu) thu hái ạti Sơn La phân l ập chất: - Hai hợp chất triterpenoid: axit bentulinic, friedelin - Một hợp chất steroid β-sitosterol - Một hợp chất flavon artochamin B Về hoạt tính sinh học chất phân l ập được: Các chất phân l ập thể hoạt tính khác thử nghiệm, đó, artochamin B h ợp chất có ho ạt tính tốt nhất; với khả ức chế Bacillus subtilis (IC50 21,79 µg/ml), Staphylococcus aureus (IC50 25,14 µg/ml), gây độc bốn dịng t ế bào ung th KB, HepG2, Lu MCF7 v ới giá trị IC50 1,18; 3,6; 20,0; 4,59 µg/ml, ho ạt tính chống oxy hóa m ạnh với giá trị EC50 20,51 µg/ml KIẾN NGHỊ: Tiếp tục nghiên ứcu sâu h ơn hoạt tính chất, đặc biệt artochamin B để có th ể áp dụng vào th ực tiễn Những dịch chiết phận khác ủca c ũng có nhi ều hoạt tính tốt c ần tiếp tục nghiên ứcu TÀI LI ỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đỗ Huy Bích c ộng (2004), Cây thu ốc động vật làm thu ốc Việt Nam, Đỗ Tất Lợi (2001), Những thu ốc v ị thuốc Việt Nam, Nhà xu ất Y học Võ V ăn Chi (1997), Từ điển thu ốc Việt Nam, Nhà xu ất Y học- Hà N ội Phạm Hoàng H ộ (1999), Cây c ỏ Việt Nam, Nhà xu ất trẻ - TP Hồ Chí Minh Viện Dược liệu- Bộ Y tế (2006), Phương pháp nghiênứcu tác dụng dược lý c thuốc từ dược thảo, Nhà xu ất Khoa học k ỹ thuật- Hà N ội Nguyễn Chí Bảo (2012), Nghiên ứcu thành ph ần hóa h ọc ho ạt tính gây độc tế bào c Chay to (Artocarpus lakoocha Roxb.) Mít dai (Artocarpus heterophyllus LamK.) Việt Nam, Luận văn Tiến sĩ Hóa h ọc , Viện Hóa h ọc Tiếng Anh Anima Pandey and S.P.Bhatnagar (2009), “Preliminary photochemical screening and antimicrobial studies on Artocarpus lakoocha Roxb”, Ancient science of life, Vol 28, No 4, pp 21-24 Charoenlarp, P.Radomyos, P.Harinasuta (1981), “Trea tment of taeniasis with Puag-Haad: a crude extract of Artocarpus lakoocha wood”, The Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health 12, 568–570 Euis Holisotan Hakima, Asnizara, Yurnawilisa, Norio Aimib, Mariko Kitajimab, Hiromitsu Takayamab (2002), “Artoindonesianin P, a new prenylated flavones with cytotoxic activity from Artocarpus lanceifolius”, Fitoterapia, vol.73, pp 668–673 10 R.I John Fresney (1993): “Culture of animal Cells: A manual of basis rd techniques, Edition” , Wiley & Sons Inc., New York 11 Hadacek, F., Greger, H (2000), “Test of antifungal natural products methodolagies, comparability of result and assay choise”, Phytochem Anal., 90, 137-147 12 Iqbal Musthapa, Lia D Juliawaty, Yana M Syah, Euis H Hakim, Jalifah Latip, and Emilio L Ghisalberti (2009), “An Oxepinoflavon e from Artocarpus elasticus with Cytotoxic Activity Against P-388 Cells”, Arch Pharm Res, Vol 32, No 2, pp 191-194 13 Junichi Kitajima, Toru Ishikawa, Eiko Fujimatu, Kyoko Kondho, Tomomi Takayanagi (2003), “Glycoside of 2-C-methyl-D-erthr itol from the fruits of anise, coriander and cumin”, Phytochemistry, Vol.62, pp.115-120 14 L.J Shai, L.J.McGaw, M.A.Aderogha, L.K.Mdee, J.N.Eloff (2008), “Four pentacyclic triterpenoids with antifungal and antibacterial activity from Curtisia dentate (Burm.f) C.A.Sm.leaves”, Journal of Ethnopharmacology, vol.119, pp.238-244 15 Lin, K.W., Liu, C.H., Tu, H.Y., Ko, H.H., Wei, B.L., 2009, “Antioxidant prenylflavonoids from Artocarpus communis and Artocarpus elasticus”, Food Chemistry 115, 558–562 16 M.R Khan, A.D Omoloso, M Kihara (2003), “Antibac terial activity of Artocarpus heterophyllus”, Fitoterapia , Vol.74, pp 501–505 17 Manjeshwar Shrinath Baliga, Arnadi Ramachandrayya Shivashankara, Raghavendra Haniadka, Jerome Dsouza, Harshith P Bhat (2011), “Phytochemistry, nutritional and pharmacological pr operties of Artocarpus heterophyllus Lam (jackfruit): A review”, Food Research International, vol 44, pp.1800–1811 18 Mossmann, T., (1983) “Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays”, J Immunol Meth.65, 55-63 19 NajihahMohd Hashim, M Rahmani, G.Cheng Lian Ee, Mohd A Sukari, M Yahayu, W.Oktima, A Ali and Rusea Go (2012), “Anti proliferative Activity of Xanthones Isolated from Artocarpus obtusus”, Journal of Biomedicine and Biotechnology, Volume 2012, Article ID 130627 20 Namdaung, U., Aroonrerk, N., Suksamrarn, S., Danwisetkanjana, K., Saenboonrueng, J., Arjchomphu, W., Suksamrarn, A., (2006), “ Bioactive constituents of the root bark of Artocarpus rigidus subsp rigidus”, Chemical & Pharmaceutical Bulletin, vol.54, pp.1433–1436 21 Pual Cos, Louis Maes, Jean-Bosco Sindambiwe, Arnold J Vlietinck, Dirk Vanden Berghe; “ Bioassay for antibacterial and antifungal activit ies”; Laboratory for Microbiology, Parasitology and Hygien, Faculty of Pharmaceutical, Biomedical and Veterinary Sciences, University of Antwerp, Belgium,1-13 (2005) 22 Ratna Asmah Susidarti, M.Rahmani, A.Manaf Ali, M.Aspollah Sukari, Hazar B.M.Ismail, “ Friedelin from Kelat merah” , Eugenia chlorantha Duthie 23 Scudiero D A., Shoemaker R H., Kenneth D P., Monks A., et al, (1988), “Evaluation of a soluable tetrazolium/ formazan ass ay for cell growth and drug sensibility in culture using human and other tumor cell lines.”, Cancer Reaseach 48: 4827-4833 24 Shashi B Mahato and Asish P Kundu (1994), “13C-NM R spectra of pentacyclic triterpenoids, a compilation and some salient features”, Phytochemistry, Vol 37, No 6, pp 1517-1575 25 Sisay Feleke and Abeba Brehane (2005), “ Triterpene compounds from latex of Ficus sur I”, Chemical Society of Ethiopia, Vol.19(2), pp 307-310 26 Stefan Berger, Dieter Sicker (2009), “Classic in sp ectroscopy – Isolation and structure elucidation of natural products”, Wiley – VCH , pp 481-499 27 Suhartati, T., Achmad, S.A., Aimi, N., Hakim, E.H., Kitajima, M., Takayama, H., Takeya, K., (2001), “Artoindonesianin L, a new prenylated flavone with cytotoxicity activity from Artocarpus rotunda”, Fitoterapia, vol 72, pp.912–918 28 Suhartati, T., Yandri, Hadi, S (2008), “ The bioac tivity test of artonin E from the bark of Artocarpus rigida Blume”, European Journal of Scientific Research, vol.23, pp.330–337 29 Supawatchara Singhatong, Donrawee Leelarungrayub and Chaiyavat Chaiyasut (2010), “Antioxidant and toxicity activities of Artocarpus lakoocha Roxb heartwood extract”, Journal of Medicinal Plants Research, Vol 4(10), pp 947-953 30 Syah, Y.M., Achmad, S.A., Ghisalberti, E.L., Hakim, E.H., Mujahidin, D (2004), “ Two new cytotoxic isoprenylated flavones, artoindonesianin U and V from heartwood of A chempeden”, Fitoterapia , vol.75, pp 134–140 31 U.B Jagtap, V.A Bapat (2010), “ Artocarpus: A review of its traditional uses, phytochemistry and pharmacology”, Journal of Ethnopharmacology 129 (2010) 142–166 32 Victor Kuete, Patrick Y Ango, Ghislain W Fotso, Gilbert DWF Kapche, Jean P Dzoyem, Arlette G Wouking, Bonaventure T Ngadjui and Berhanu M Abegaz (2011), “Antimicrobial activities of the met hanol extract and compounds from Artocarpus communis (Moraceae)”, BMC Complementary and Alternative Medicine 33 Wang, Y., Deng, T., Lin, L., Pan, Y., Zheng, X., (2006), “Bioassay guided isolation of antiatherosclerotic phytochemicals from Artocarpus altilis”, Phytotherapy Research 20, 1052–1055 34 Yong-Hong Wang, Ai-Jun Hou, Lei Chen, Dao-Feng Chen, Han-Dong Sun, Qin- Shi Zhao, Kenneth F Bastow, Yuka Nakanish, Xi-Hong Wangn, Kuo-Hsiung Lee (2004), “New Isoprenylated Flavones, Art ochamins A-E, and Cytotoxic Principles from Artocarpus chama”, J Nat Prod 67, 757-761 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phổ H-NMR chất AFD2 Phụ lục 2: Các phổ chất AFL2 Phụ lục 3: Các phổ hợp chất AFD3 Phụ lục 4: Phổ 1H-NMR chất AFD6 Phụ lục 5: Phổ 13 Phụ lục 7: Phổ 13 C-NMR chất AFD6 C CPD & DEPT chất AFD6 Phụ lục 8: Phổ HSQC HMBC c chất AFD6 Phổ HMBC chất AFD6 ... chất sinh h? ?c lồi mít đen Artocarpus nigrifolius C. Y. Wu? ?? M? ?c tiêu ủca luận văn nghiên c? ??u thành ph ần hóa h ? ?c phát hợp chất hóa h ? ?c có ho ạt tính sinh h? ?c loài Artocarpus nigrifolius C. Y. Wu Để... mẫu c? ?nh, lá, Hình 1.1: Đ? ?c điểm th? ?c vật lồi Mít đen Artocarpus nigrifolius C. Y. Wu C? ?nh Mít lá? ?en Chồi Mít lá? ?en Artocarpus nigrifolius C. Y. Wu m ột loài m ới ng hiên ứcu b ổ sung vào h ệ sinh. ..ĐẠI H? ?C QU? ?C GIA HÀ N ỘI TRƯỜNG ĐẠI H? ?C KHOA H? ?C TỰ NHIÊN - Lê ThịTú Anh NGHIÊN C ỨU THÀNH PH ẦN HÓA H ? ?C VÀ HO ẠT TÍNH SINH H? ?C LỒI MÍT LÁ ĐEN ARTOCARPUS NIGRIFOLIUS C. Y. WU Chuyên