Nghiên cứu sự biểu hiện của một số gen trong con đường hoạt hóa thụ thể dioxin ở người phơi nhiễm dioxin tại đà nẵng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Đoàn Thị Thu Hương NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN CỦA MỘT SỐ GEN TRONG CON ĐƯỜNG HOẠT HÓA THỤ THỂ DIOXIN Ở NGƯỜI PHƠI NHIỄM DIOXIN TẠI ĐÀ NẴNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Đoàn Thị Thu Hương NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN CỦA MỘT SỐ GEN TRONG CON ĐƯỜNG HOẠT HÓA THỤ THỂ DIOXIN Ở NGƯỜI PHƠI NHIỄM DIOXIN TẠI ĐÀ NẴNG Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Trung Nam PGS.TS Nguyễn Lai Thành Hà Nội - 2019 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành đề tài luận văn cách hoàn chỉnh, bên cạnh nỗ lực cố gắng thân cịn có hướng dẫn nhiệt tình q thầy cơ, giúp đỡ, tạo điều kiện Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp suốt thời gian học tập nghiên cứu thực luận văn thạc sĩ Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến TS Nguyễn Trung Nam, PGS.TS Nguyễn Lai Thành TS Hoàng Thị Thu Hằng hết lòng giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho tơi hồn thành luận văn Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến tồn thể cán phịng Cơng nghệ ADN Ứng dụng - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam tận tình truyền đạt kiến thức quý báu tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập nghiên cứu thực đề tài luận văn Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn đến gia đình, anh chị bạn đồng nghiệp hỗ trợ cho nhiều suốt trình học tập, nghiên cứu thực đề tài luận văn thạc sĩ cách hoàn chỉnh Hà Nội, ngày tháng năm Học viên thực Đồn Thị Thu Hương i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Học viên Đoàn Thị Thu Hương ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vii ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu chung dioxin 1.2 Ảnh hưởng dioxin tới sức khỏe người 1.3 Cơ chế hoạt hóa dioxin tế bào 1.4 Vai trò Cyp1b1 Cyp1a1 đường hoạt hóa dioxin (dioxin – Ahr – Cyp) 1.5 Vai trò AhrR đường truyền tín hiệu dioxin receptor 12 1.6 Nghiên cứu phân tích khắc phục hậu chất dioxin chiến tranh Việt Nam 14 Chương 2: MỤC TIÊU, ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 18 2.2 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu 18 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.2.2 Phạm vi nghiên cứu 19 2.3 Nội dung nghiên cứu 19 2.4 Phương pháp nghiên cứu 19 2.4.1 Phương pháp tách RNA từ máu tổng số 20 2.4.2 Phương pháp tổng hợp cDNA 21 2.4.3 Phương pháp real time PCR 23 2.4.4 Trình tự mồi sử dụng phản ứng Realtime PCR 26 2.4.5 Phương pháp thống kê, phân tích xử lý số liệu 26 iii Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Tách chiết RNA nhóm người phơi nhiễm dioxin nhóm đối chứng khỏe mạnh 27 3.2 Xác định điều kiện tối ưu cho phản ứng real-time PCR với cặp mồi đặc hiệu 29 3.2.1 Xác định điều kiện tối ưu cho phản ứng real-time PCR với cặp mồi Cyp1a1 29 3.2.2 Xác định điều kiện tối ưu cho phản ứng real-time PCR với cặp mồi Cyp1b1 31 3.2.3 Xác định điều kiện tối ưu cho phản ứng real-time PCR với cặp mồi AhrR 34 3.3 Định lượng tương đối gen Cyp1a1 nhóm phơi nhiễm dioxin nhóm đối chứng khỏe mạnh 36 3.4 Định lượng tương đối gen Cyp1b1 nhóm phơi nhiễm dioxin nhóm đối chứng khỏe mạnh 39 3.5 Định lượng tương đối gen AhrR nhóm phơi nhiễm dioxin nhóm đối chứng khỏe mạnh 42 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 4.1 Kết luận 49 4.2 Kiến nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Độ độc đồng phân Dioxin [8,9] Bảng 2.1 Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA (theo ThermoFisher, #K1621) 22 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng thể tích phản ứng tổng hợp cDNA .22 Bảng 2.3 Chu trình nhiệt phản ứng tổng hợp cDNA 22 Bảng 2.4 Trình tự mồi gen AhrR, Cyp1A1, Cyp1B1 β-actin sử dụng phản ứng real time PCR 26 Bảng 3.1 Kiểm tra RNA tổng số tách chiết từ mẫu máu dung dịch Trizol™LS 28 Bảng 3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ gắn mồi đến độ đặc hiệu sản phẩm PCR 29 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nồng độ mồi đến độ đặc hiệu sản phẩm PCR 30 Bảng 3.4 Xác định chu kì ngưỡng phát gen Cyp1a1 với mẫu cDNA .31 độ pha loãng khác 31 Bảng 3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ gắn mồi đến độ đặc hiệu sản phẩm PCR 32 Bảng 3.6 Ảnh hưởng nồng độ mồi đến độ đặc hiệu sản phẩm PCR .32 Bảng 3.7 Xác định chu kì ngưỡng phát gen Cyp1b1 với mẫu cDNA độ pha loãng khác 33 Bảng 3.8 Ảnh hưởng nhiệt độ gắn mồi đến độ đặc hiệu sản phẩm PCR 34 Bảng 3.9 Ảnh hưởng nồng độ mồi đến độ đặc hiệu sản phẩm PCR .35 Bảng 3.10 Xác định chu kì ngưỡng phát gen AhrR với mẫu cDNA 35 Bảng 3.11 Xác định chu kì ngưỡng gen Cyp1a1 β-actin nhóm phơi nhiễm dioxin 37 Bảng 3.12 Xác định chu kì ngưỡng gen Cyp1a1 β-actin nhóm đối chứng khỏe mạnh 37 Bảng 3.13 Số lần tăng gen Cyp1a1 nhóm người phơi nhiễm dioxin nhóm đối chứng khỏe mạnh 38 Bảng 3.14 Xác định chu kì ngưỡng gen Cyp1b1 β-actin nhóm phơi nhiễm dioxin 40 v Bảng 3.15 Xác định giá trị chu kì ngưỡng gen Cyp1b1 β-actin nhóm đối chứng khỏe mạnh 40 Bảng 3.16 So sánh biểu gen Cyp1b1 nhóm người phơi nhiễm dioxin nhóm đối chứng khỏe mạnh 41 Bảng 3.17 Đánh giá chu kì ngưỡng gen AhrR β-actin nhóm phơi nhiễm dioxin 43 Bảng 3.18 Giá trị chu kì ngưỡng gen AhrR β-actin nhóm đối chứng khỏe mạnh 44 Bảng 3.19 So sánh biểu gen AhrR nhóm người phơi nhiễm dioxin người không nhiễm dioxin 44 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học số phối tử điển hình Ahr [15,57] Hình 1.2 Cơ chế hoạt hóa Ahr cảm ứng phối tử [47] Hình 1.3 Kích hoạt chuyển hóa chất gây ung thư dibenzo[a,l]pyrene (DB[a, l]P) (A) 7,12-Dimethyl benzanthracene (7, 12-DMBA) (B) thành vùng epoxides P450 edoxides hydrolase [56] Hình 1.4 Sự tham gia enzyme thuộc họ P450 pha I q trình chuyển hóa thuốc người [18] Hình 1.5 Vị trí cấu trúc gen Cyp1a1 người [65] 10 (Các exon đánh số theo thứ tự từ đến 7) 10 11 Hình 1.6 Vị trí cấu trúc gen Cyp1b1 người [65] 11 (Các exon đánh số theo thứ tự từ đến 3) 11 Hình 1.7 Sự tham gia CYP1A/B trình chuyển hóa hydrocacbon đa vịng thơm [50] 12 Hình 1.8 Vị trí cấu trúc gen AhrR người [62] 13 (Các exon đánh số theo thứ tự từ đến 10) 13 13 Hình 1.9 Các giả định chế hoạt động AhrR [54] 13 Hình 1.10 Bản đồ phân bố chất độc màu da cam miền Nam Việt Nam [58] .16 Hình 2.1 Đường biển diễn chuẩn xác định mối quan hệ chu kỳ ngưỡng (Ct) với số lượng copies DNA đích ban đầu có ống phản ứng 24 Hình 3.1 Xây dựng đường chuẩn xác định hiệu suất phản ứng PCR với cặp mồi Cyp1a1-F/R 31 Hình 3.2 Xây dựng đường chuẩn xác định hiệu suất phản ứng PCR với cặp mồi Cyp1b1-F/R 34 Hình 3.3 Xây dựng đường chuẩn xác định hiệu suất 36 phản ứng PCR với cặp mồi AhrR-F/R 36 vii Hình 3.4 Biểu đồ định lượng tương đối gen Cyp1a1 nhóm người phơi nhiễm dioxin (DN) so với nhóm người không nhiễm dioxin (CT) **, p