Nghiên cứu hoạt tính sinh học từ dịch chiết của cây bán hạ roi – typhonium flagelliforme ( lodd) blume ( araceae)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Bạch Tuyết Mai NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ DỊCH CHIẾT CỦA CÂY BÁN HẠ ROI - Typhonium flagelliforme (LODD) BLUME (ARACEAE) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Bạch Tuyết Mai NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ DỊCH CHIẾT CỦA CÂY BÁN HẠ ROI - Typhonium flagelliforme (LODD) BLUME (ARACEAE) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN QUANG HUY Hà Nội – 2018 Lời cảm ơn Lời đầu tiên, xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Quang Huy, ngƣời thầy tận tình hƣớng dẫn, dành nhiều thời gian trao đổi, định hƣớng nghiên cứu tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu khoa học thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn đến ThS Lê Quý Thƣởng toàn thể quý thầy, cô Bộ môn Sinh lý thực vật Hóa sinh nhƣ q thầy khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên truyền đạt cho kiến thức quý báu suốt thời gian học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban Lãnh đạo Khoa Sinh học, Phòng đào tạo Sau đại học, Trƣờng Đaịhocc̣ Khoa hocc̣ Tƣ c̣nhiên đa g ̃ iúp đỡ taọ điều kiêṇ cho tơi hồn thành chƣơng trình học tập thực luận văn Cuối cùng, xin chân thành bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình, ngƣời thân bạn bè, ngƣời đôngc̣ viên vàtạo điều kiêṇ thṇ lơị cho tơi có thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luâṇ văn Hà Nội, ngày 18 tháng năm 2018 Học viên cao học MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung thuốc 1.2 Các hợp chất thứ cấp có thực vật 1.2.1Alkaloids 1.2.2Flavonoids 1.2.3Tannins 1.2.4 Glycoside 1.2.5Saponins 1.3 Khái quát họ Ráy ( Araceae ) 1.4 Giới thiệu chung Bán hạ roi (Typhonium flagelliforme) .7 1.4.1Đặc điểm hình thái 1.4.2 Các hợp chất 1.4.3Phân loại Phân bố 1.4.4Hoạt tính sinh học Bán hạ roi 1.5 Khái quát phƣơng pháp tách chiết 12 1.5.1 Chu trình tiền tách chiết mẫu thực vật 12 1.5.2Phƣơng pháp tách chiết 13 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Nguyên liệu 16 2.2 Hóa chất 16 2.3 Thiết bị thí nghiệm 16 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 17 2.4.1 Định tính nhóm chất loài Bán hạ roi 17 2.4.2 Phƣơng pháp chiết mẫu 21 2.4.3 Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học 23 2.4.4 Phân lập chất từ dịch chiết Bán hạ roi 25 2.5 Phƣơng pháp thống kê CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết định tính nhóm chất Bán hạ roi 3.2 So sánh dịch chiết Bán hạ roi 3.2.1 Dịch chiết Bán hạ roi với EtOH 3.2.2 Dịch chiết Bán hạ roi với MetOH 3.3 Kết thử hoạt tính sinh học Bán hạ roi 3.3.1 Kết thử hoạt tính DPPH 3.3.2 Kết thử độ độc tế bào 3.3.3 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định p hân đoaṇ dicḥ chiết từ bán hạ roi 3.4 Phân lập xác định cấu trúc hợp chất từ Bán hạ roi 3.4.1 Chất TF1 3.4.2 Chất TF2 3.5 Đánh giá hoạt tính sinh học chất phân lập đƣợc từ Bán hạ roi 3.5.1 Hoạt tính chống oxy hố chất phân lập đƣợc 3.5.2 Hoạt tính gây độc tế bào phân đoạn dịch chiết 3.5.3 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định cua cac phân đo roi KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO ̉̉ DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 So sánh phƣơng pháp tiền tách chiết 13 Bảng 1.2 So sánh phƣơng pháp tách chiết truyền thống 14 Bảng 1.3 So sánh phƣơng pháp tách chiết đại 15 Bảng 3.1 Kết định tính nhóm chất lồi Bán hạ roi 27 Bảng 3.2 Khối lƣợng cặn chiết phân đoạn Bán hạ roi với EtOH .29 Bảng 3.3 Khối lƣợng cặn chiết phân đoạn Bán hạ roi với MetOH 29 Bảng 3.4 Giá trị EC50 phép phân tích DPPH với dịch chiết Bán hạ roi 30 Bảng 3.5 Giá trị of IC50 với dịch chiết Bán hạ roi với dịng tế bào ung thƣ 30 Bảng 3.6 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định phân đoaṇ dicḥ chiết 32 13 Bảng 3.7 Số liệu phổ H- C-NMR (CDCl3) hợp chất TF1 Stigmast-4-en3-one 36 Bảng 3.8 Số liệu phổ NMR TF2 hợp chất tham khảo 39 Bảng 3.9 Kết quảthƣ̉ hoaṭtinh́ chống oxy hoácủa ch ất phân lập 42 Bảng 3.10 Hoạt tính ức chế phát triển tế bào chất phân lập từ Bán hạ roi 42 Bảng 3.11 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định chất phân lập Bán hạ roi 43 DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo nicotine Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo flavonoid Hình 1.3 Công thức cấu tạo tannin Hình 1.4 Cơng thức cấu tạo glycoside Hình 1.5 Cơng thức cấu tạo cortisol Hình 1.6 Bán hạ roi (T flagelliforme) Hình 2.1 Mẫu bột Bán hạ roi 22 Hình 2.2 Quy trình ngâm chiết Bán hạ roi 23 Hình 2.3 Đƣờng chuẩn biểu thị mối tƣơng quan nồng độ DPPH mật độ quang học 24 Hình 3.1 Dịch chiết Bán hạ roi với EtOH dung môi n-hexane (1), EA (2) MetOH (3) 28 Hình 3.2 So sánh giá trị IC50 dịch chiết: n-hexane DCM với dòng tế bào ung thƣ 31 Hình 3.3 Sơ đồ phân lập hợp chất từ dịch chiết Bán hạ roi 33 Hình 3.4 Phổ H-NMR chất TF1 (Stigmast-4-en-3-one) 34 Hình 3.5 Phổ H-NMR dãn rộng chất TF1 (Stigmast-4-en-3-one) 35 Hình 3.6 Phổ H-NMR dãn rộng chất TF1 (Stigmast-4-en-3-one) 35 Hình 3.7 Phổ 13 C-NMR phổ DEPT chất TF1 35 Hình 3.8 Công thức cấu tạo TF1 37 Hình 3.9 Phổ H-NMR chất TF2 40 Hình 3.10 Phổ 13 C-NMR chất TF2 40 Hình 3.11 Phổ DEPT chất TF2 41 Hình 3.12 Cấu trúc hóa học hợp chất TF2 stigmasterol 41 Chữ viết tắt ASE ATCC DCM DEPT DMEM DMSO DPPH EA EtOH FBS FT-IR Hep - G2 IUCN KB Lu MAE MetOH MTT NCI NCI-H23 NMR SFE UAE v/v w/v MỞ ĐẦU Cây trồng đóng vai trò quan trọng sống đặc biệt nghành Y, Dƣợc chúng khơng làm giảm nhiễm mà phƣơng thuốc để điều trị nhiều chứng bệnh khác nhằm nâng cao sức khỏe cho ngƣời dân phòng chống số bệnh hiểm nghèo Có khoảng 4.700 lồi đƣợc sử dụng làm thuốc Trong dân gian có nhiều thảo dƣợc nhƣ sản phẩm thiên nhiên đƣợc sử dụng trực tiếp để làm thuốc chữa bệnh làm tiền chất cho tổng hợp hóa dƣợc.Mỗi lồi trị nhiều loại bệnh khác dựa hợp chất hoạt tính sinh học lồi Ví dụ: Diếp cá dùng để trị ho, lơ hội dùng để trị mụn, trinh nữ hoàng cung dùng để giảm thiểu ung thƣ buồng trứng ung thƣ cổ tử cung, bán hạ roi đƣợc dùng để trị ho suyễn, khí nghịch đàm thấp thủy ẩm, thấp trệ trung tiêu, nôn mửa bụng đầy, đinh nhọt, sƣng tấy Ngồi ra, bán hạ cịn có nhiều công dụng khác nhau.Do vậy, việc nghiên cứu tách chiết xác định thành phần hoạt chất sinh học có bán hạ roi nói chung chi Typhoniumnói riêng nhằm sử dụng điều trị bệnh quan trọng góp phần cung cấp thêm sản phẩm thuốc có lợi cho sức khỏe ngƣời dân Bán hạ roi thảo dƣợc thuộc họ Ráy đƣợc trồng rộng rãi Ấn Độ, Úc, Sri Lanka, Indonesia nƣớc châu Á khác có nhiệt độ trung bình [26] Gần đây, cho thấycác nhóm hợp chất thứ sinh nhƣ flavonoid, saponin, alkaloid terpenoid loài đƣợc nghiên cứu, tìm hiểu [9] Một số hợp chất hóa học bán hạ roi đƣợc tinh xác định cấu trúc [9] Các dịch chiết từ bán hạ roi đƣợc xác định có chứa hợp chất có hoạt tính chống lại phát triển nhiều dòng tế bào ung thƣ [20] Một số nghiên cứu khác cho thấy dịch chiết bán hạ roi cịn có hoạt tính chống oxi hóa [10,16] Tại Việt Nam, nhiều thuốc dân gian lƣu truyền bán hạ roi dùng để trị ho, long đờm Tuy nhiên đến nay, nghiên cứu chuyên sâu Bán hạ roi chƣa nhiều, đặc biệt nghiên cứu hoạttính sinh học từ hợp chất đƣợc tinh Do đó, nghiên cứu tập trung vào phân lập hợp chất từ bán hạ roi, xác định nhóm chất nhƣ tinh hợp chất vàđánh giá hoạt tính sinh học dịch chiết từ bán hạ roi từ hợp chất đƣợc tách Hình 3.8Cơng thức cấu tạo chất TF1 Stigmast-4-en-3-one làm hạ đƣờng huyết để điều trị tiểu đƣờng type II Trong nghiên cứu Abildgaard cộng (2003) [5], stigmast-4-en-3-one nguyên liệu quan trọng sản xuất hc mơn tổng hợp đƣợc sử dụng nhƣ chất làm mềm sản phẩm giấy 3.4.2 Chất TF2 Chất TF2 thu đƣợc dƣới dạng tinh thể hình kim màu trắng, nhiệt độ nóng o chảy 155-157 C + Trên phổ ESI-MS chất TF2 xuất pic ion 395,3 [M -H 2O+H] phù hợp với công thức phân tử C29H48O Phổ H-NMR (hình 3.9) thấy xuất tín hiệu nhóm methyl bậc ba δ H 0,84 (s), 1,03 (s); nhóm methyl bậc hai δH 0,91 (d, J = 6,5 Hz), 0,81 (d, J = 6,8 Hz), δ H 0,86 (3H, d, J = 9,5 Hz) nhóm methyl bậc δH 0,84 (t, J = 8,5 Hz) Trên phổ xác nhận có mặt nhóm β-OH (δH 3,53, m, H-3) C-3 Trên phổ xác nhận có mặt liên đơi δH 5,32 (br s) liên kết đôi trans khác δ H 5,15 (dd, 8,5, 15,0)/ 5,02 (dd, 8,5, 15,0) Phổ 13 C-NMR phổ DEPT (hình 3.10 hình 3.11) TF2 xuất 29 tín hiệu cacbon, gồm có cacbon bậc bốn, 11 nhóm methine, nhóm methylen nhóm methyl đặc trƣng khung sterol Đặc biệt, tín hiệu hai cặp olefin 37 đƣợc xác nhận C-5 (δC 140,75)/C-6 (δC 121,73) C-22 (δC 138,33)/C-23(δC 129,27) Dựa vào phân tích (bảng 3.8 hình từ 3.9 đến hình 3.11) kết hợp so sánh số liệu phổ 13 C-NMR TF2 với số liệu đƣợc cơng bố stigmasterol thấy hồn tồn phù hợp Nhƣ vậy, chất TF2 đƣợc khẳng định stigmasterol (hình 3.12) 38 Bảng 3.8 Số liệu phổ NMR TF2 hợp chất tham khảo C #δ 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 39 C Hình 3.9 Phổ H-NMR chất TF2 Hình 3.10 Phổ 13 C-NMR chất TF2 40 Hình 3.11 Phổ DEPT chất TF2 Hình 3.12 Cấu trúc hóa học hợp chất TF2 stigmasterol 3.5 Đánh giá hoạt tính sinh học chất phân lập đƣợc từ bán hạ roi 3.5.1 Hoạt tính chống oxy hố chất phân lập đƣợc Kết thử nghiệm hoạt tính tới gốc tự DPPH chất phân lập từ bán hạ roi đƣợc trình bày Bảng 3.9 41 Bảng 3.9 Kết quảthƣ̉ hoaṭtinh́ chống oxy hoácủa chất phân lập Kết bảng 3.9 cho thấy hai chất TF1 TF2 phân lập đƣợc từ Bán hạ roi khơng có hoạt tính oxy hóa hệ thử giá trị EC 50tƣơng ứng hệ DPPH >128µg/ml 3.5.2 Hoạt tính gây độc tế bào phân đoạn dịch chiết Bảng 3.10 Hoạt tính ức chế phát triển tế bào chất phân lập từ Bán hạ roi STT Tê Ell Kết bảng 3.10 cho thấy chất phân lập đƣợc từ bán hạ roi khơng thể hoạt tính kháng dịng tế bào ung thƣ KB, Hep - G2, Lu, MCF7 hệ thử nồng độ