Nghiên cứu hoạt tính sinh học từ dịch chiết của cây râu hùm hoa tía tacca chantrieri

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Vũ Thị Diệp NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ DỊCH CHIẾTCỦA CÂY RÂU HÙM HOA TÍA -Tacca chantrieri LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Vũ Thị Diệp NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ DỊCH CHIẾTCỦA CÂY RÂU HÙM HOA TÍA -Tacca chantrieri Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN QUANG HUY Hà Nội – 2018 Lời cảm ơn Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Quang Huy, ngƣời Thầy tận tình hƣớng dẫn, dành nhiều thời gian trao đổi, định hƣớng nghiên cứu tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu khoa học thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn đến tồn thể q thầy, Bộ mơn Hóa sinh Sinh học phân tử nhƣ thầy cô khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên truyền đạt cho kiến thức quý báu suốt thời gian học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban Lãnh đạo Khoa Sinh, Ph ng Sau Đại học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên gi p đ tạo điều kiện cho tơi hồn thành chƣơng trình học tập thực luận văn Cuối cùng, tơi xin chân thành bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình, ngƣời thân ạn , ngƣời động viên tạo điều kiện thuận l i cho c thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày tháng 11 năm 2018 Học viên cao học MỤC LỤC Lời cảm ơn MỤC LỤC Danh mục hình Danh mục bảng BẢNG KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT Mở đầu Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung thuốc 1.2 Các h p chất thứ cấp có thực vật 1.2.1 Alkaloids 1.2.2 Flavonoids 1.2.3 Tannins 1.2.4 Glycoside 1.2.5 Saponins 1.3 Giới thiệu chi Râu hùm 1.3.1 Thành phần loài thuộc 1.3.2 Các nghiên cứu thành ph 1.3.3 Hoạt tính sinh học chi Tacca 1.4 Giới thiệu loài Râu hùm hoa tía-Tacca chantrieriở Việt Nam 1.5.Tình hình sử dụng Râu hùm y học cổ truyền Việt Nam Chƣơng NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu 2.1 Hóa chất 2.2 Thiết bị thí nghiệm 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1 Định tính nhóm chất củ 2.4.2 Phương pháp thử hoạt tính DPPH 22 2.4.3 Phƣơng pháp xử lý mẫu 23 2.4.4 Phƣơng pháp chiết xuất 23 2.4.5 Các phƣơng pháp phân lập chất 23 2.4.6 Các phƣơng pháp xác định cấu tr c hoá học 24 2.4 Phƣơng pháp thống kê 25 Chƣơng 26 Kết nghiên cứu Thảo luận 26 3.1 Kết định tính nhóm chất Râu hùm 26 3.2.Điều chế cặn chiết từ Râu hùm hoa tíaTacca chantrieri 27 3.2.1 Phân lập chất từ cặn chiết 28 3.2.3.Xác định cấu trúc chất 31 3.3 Đánh giá hoạt tính sinh học RHH2 phân lập từ dịch chiết Râu hùm 43 KẾT LUẬN 44 KIẾN NGHỊ 44 Tài liệu tham khảo 45 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo nicotine Hình 1.2 Công thức cấu tạo flavonoid [16] Hình 1.3.Cơng thức cấu tạo tannin Hình 1.4 Cơng thức cấu tạo glycoside Hình 1.5 Một số h p chất từ lồi chi Râu hùm .9 Hình 1.6 Ảnh Râu hùm hoa tíaTacca chantrieri Việt Nam 14 Hình 2.1 Đƣờng chuẩn biểu thị mối tƣơng quan nồng độ DPPH mật độ quang học 23 Hình 3.1 Sơ đồ điều chế cặn chiết từ mẫu T chantrieri 27 Hình 3.2 Sơ đồ phân lập chất từ cặn chiết hexane lồi T chantrieri 28 Hình 3.3 Sơ đồ phân lập chất từ cặn chiết EtOAc lồi T chantrieri 29 Hình 3.4 Sơ đồ phân lập chất từ cặn nƣớc loài T chantrieri .30 Hình 3.5 Cơng thức hố học chất RHW1 31 Hình 3.5a Phổ H-NMR h p chất RHW1 32 Hình 3.5b Phổ 13 C-NMR h p chất RHW1 33 Hình 3.5c Phổ DEPT h p chất RHW1 33 Hình 3.5d Phổ CD h p chất RHW1 35 Hình 3.6 Cơng thức cấu tạo chất RHH1 35 Hình 3.6a Phổ H NMR RHH1 36 Hình 3.6b Phổ H NMR giãn rộng RHH1 36 Hình 3.6c Phổ 13 C NMR RHH1 37 Hình 3.6d Phổ DEPT RHH1 37 Hình 3.7 Cơng thức cấu tạo chất RHH2 38 Hình 3.7a Phổ H NMR RHH2 39 Hình 3.7b Phổ H NMR giãn rộng RHH2 39 Hình 3.7c Phổ H NMR giãn rộng RHH2 40 Hình 3.7d.Phổ 13 C NMR RHH2 40 Hình 3.7e Phổ DEPT RHH2 41 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Danh sách cá loài thuộc chi Tacca phân bố Việt Nam Bảng 3.1.Kết định tính nhóm chất Râu hùm 26 Bảng 3.2 Dữ liệu phổ NMR RHW1 h p chất tham khảo 34 Bảng 3.3 Số liệu phổ NMR RHH2 42 Bảng 3.4.Khả kháng vi sinh vật kiểm định chất β-sitosterol (RHH2) 43 Chữ viết tắt ASE ATCC DCM DEPT DMEM DMSO DPPH EA EtOH FT-IR Hep - G2 MetOH NCI NMR SFE UAE v/v Mở đầu Thế giới thực vật nguồn tài nguyên phong phú vô quý giá h p chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học Khơng nƣớc phƣơng Đơng mà nƣớc phƣơng Tây tiêu thụ lƣ ng lớn dƣ c liệu Xu hƣớng sâu nghiên cứu tìm kiếm h p chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao từ lồi thực vật làm dƣ c phẩm chữa bệnh ngày thu h t đƣ c quan tâm nhà khoa học ƣu điểm ch ng độc tính thấp, dễ hấp thu chuyển h a thể so với dƣ c phẩm tổng h p Mặc dù công nghệ tổng h p h a dƣ c ngày phát triển mạnh mẽ, tạo biệt đƣ c khác sử dụng cơng tác phịng, chữa bệnh, nhờ đ giảm tỉ lệ tử vong nhiều, song đ ng g p thuốc khơng mà chỗ đứng Y học mà tiếp tục đƣ c dùng nhƣ nguồn nguyên liệu trực tiếp, gián tiếp cung cấp chất đầu cho công nghệ bán tổng h p, nhằm tìm kiếm dƣ c phẩm cho việc điều trị chứng bệnh thông thƣờng, nhƣ bệnh nan y Các nghiên cứu gần cho thấy, có khoảng 60% dƣ c phẩm đƣ c dùng chữa bệnh nay, thử cận lâm sàng có nguồn gốc từ tự nhiên Cho đến nay, giới phát khai thác nhiều h p chất có hoạt tính sinh học từ thuốc truyền thống chữa bệnh nâng cao sức khoẻ ngƣời Việt Nam nƣớc nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có hệ thực vật đa dạng phong ph Theo ƣớc tính, nƣớc ta có khoảng gần 13000 loài thực vật bậc cao đ c khoảng 4000 loài đƣ c sử dụng làm thuốc Ngoài đa dạng thành phần chủng loại, nguồn dƣ c liệu Việt Nam cịn có giá trị to lớn chỗ chúng đƣ c sử dụng rộng rãi cộng đồng để chữa nhiều loại bệnh khác Các thuốc đƣ c sử dụng dƣới hình thức độc vị hay phối h p với tạo nên thuốc quý giá Ngoài ra, hàng trăm thuốc đƣ c khoa học y - dƣ c đại chứng minh giá trị chữa bệnh chúng [5] Chi Tacca Việt Nam c loài đƣ c sử dụng làm thuốc chữa thấp khớp, viêm loét dày, viêm gan làm thực phẩm nhƣ rau ăn Trong chi Tacca, loài Râu hùm hoa tía (Tacca chantrieri) đƣ c nghiên cứu kĩ Tuy nhiên số lƣ ng nghiên cứu loài Râu hùm cịn ít, nghiên cứu tập trung thành phần hoá học hầu hết nghiên cứu tập trung phần thân rễ mà chƣa đề cập đến phần Chính chúng tơi tiến hành đề tài nghiên cứu hoạt tính sinh học lồi Râu hùm hoa tía - Tacca chantrieri Việt Nam với mục tiêu nghiên cứu số thành phần hoá học có dịch chiết Râu hùm nhằm tìm kiếm h p chất có hoạt tính sinh học, làm sở khoa học cho nghiên cứu để tạo sản phẩm chăm s c sức khỏe cộng đồng góp phần giải thích đƣ c tác dụng chữa bệnh thuốc Bảng 3.2 Dữ liệu phổ NMR RHW1 hợp chất tham khảo δ C #,a, b C 42.5 50.7 201.2 127.2 167.3 80.0 131.6 135.3 77.3 10 21.2 11 24.7 12 23.5 13 19.6 1′ 102.8 2′ 75.3 3′ 78.2 4′ 71.7 5′ 78.1 6′ 62.9 a b c # Đo CD3OD, 125MHz, 500MHz, δC chất (6S, 9R)-roseoside [1] Phổ 13 C-NMR DEPT củah p chất RHW1 xuất tín hiệu 19 cacbon bao gồm cacbonyl δC 201.2, nhóm methyl δC21.2, 24.7, 23.4 19.6, nhóm methin sp δC 127.2, 131.6 135.3, nhóm methin sp δC77.3, nhóm methylen δC50.7, cacbon bậc cacbon thuộc phân tử đƣờng (5 nhóm oxymethin nhóm oxymethylen) Cấu hình β phần đƣờng đƣ c xác định từ số tƣơng tác lớn (J = 8,0 Hz) proton anomeric H-1’ δH4,35 34 Hình 3.5d Phổ CD hợp chất RHW1 Cấu hình tuyệt đối h p chất đƣ c xác định phân tích phổ CD so sánh độ chuyển dịch hóa học với đồng phân lập thể iết Hiệu ứng Cotton 240 nm có giá trị dƣơng cho phép xác định cấu hình S cho cacbon C-6 [1] Từ liệu phổ NMR, ESI-MS, CD, so sánh độ quy cực với tài liệu tham khảo, h RHW1 đƣ c xác định (6S, 9R)-roseoside[1] H p chất đƣ c đánh giá c tính chống ung thƣ d ng tế ung thƣ da chuột thực nghiệm [2] 3.2.3.2 Hợp chất Triolein (RHH1) Hình 3.6 Cơng thức cấu tạo chất RHH1 H p chất RHH1 đƣ c phân lập dƣới dạng chất dầu màu trẳng ngà Phổ H- NMR RHH1 có tín hiệu cộng hƣởng nhóm oxymethylen δH 4.13 (2H, dd,J = 6.0, 11.5 Hz, H-1a H-3a) 4.28 (2H, dd,J = 4.0, 7.0 Hz, H-1b H-3b), nhóm oxymethine δH 5.24 (1H, m, H-2) Các tín hiệu cộng hƣởng cho biết cấu trúc RHH1 có chứa phân tử glycerol ị este hóa nhóm hydroxy 35 Ngồi tín hiệu ra, phổ H NMR cịn có tín hiệu cộng hƣởng ba nhóm methyl δH 0.87 (9H, t, J = 7.0 Hz, H-18′, H-18″ H-18′″), nhóm methine dạng olefin cộng hƣởng vùng δH 5.26-5.39 (6H, m), tín hiệu cộng hƣởng nh m methylene vùng trƣờng cao δH 1.20-2.83 Hình 3.6a Phổ H NMR RHH1 Hình 3.6b Phổ H NMR giãn rộng RHH1 36 Phổ 13 C NMR DEPT RHH1 cho tín hiệu nh m car onyl (δ C 173.17 172.80), nhóm methin dạng olefin (δ C 129.95 129.66), nhóm oxymethin (δC 68.85), hai nh m oxymethylen (δ C 62.06), nh m methyl (δC 14.03) số nhóm methylen tập trung vùng trƣờng cao (δC 22.63-34.16) Hình 3.6c Phổ 13 C NMR RHH1 Hình 3.6d Phổ DEPT RHH1 37 Kết h p liệu phổ H NMR 13 C NMR cho phép dự kiến h p chất RHH1 trieste glycerol với axit So sánh số liệu phổ 13 C NMR phần axit RHH1 với axit oleic [3] Sự tƣơng đồng số liệu cho phép xác định RHH1 trieste axit oleic glycerol có tên gọi triolein Cấu trúc RHH1 triolein đƣ c khẳng định lại qua việc tham khảo tài liệu công ố trƣớc triolein so sánh mỏng TLC với chất triolein có phịng thí nghiệm (Rf = 1,6) [4,5] 3.2.3.3 Hợp chất β-sitosterol (RHH2) Hình 3.7 Công thức cấu tạo chất RHH2 Hợp chấtRHH2 thu đƣ c dƣới dạng tinh thể dạng phiến, màu trắng, nóng chảy o 135-136 C Phổ H NMR xuất tín hiệu cộng hƣởng proton dạng olephin [δH 5,34 (1H, brd, J= 5,0 Hz, H-6) nh m methyl đ c nh m cộng hƣởng dƣới dạng singlet [δH 0,68 (3H, s, H-18) 1,00 (3H, s, H-19)] nhóm cộng hƣởng dạng doublet [δH 0,81 (3H, d, J= 7,0 Hz, H-27); 0,83 (3H, d, J= 7,0 Hz, H-26); 0,85 (3H, d, J= 7,5 Hz, H-29); 0,92 (3H, d, J= 6,5 Hz, H-21)] Tín hiệu cộng hƣởng nhóm hydroxymethin xuất dƣới dạng multiplet [δH 3,52 (1H, m, H-3)] Ngoài cịn có tín hiệu cộng hƣởng proton nhóm methin methylen khác vùng trƣờng cao [δH 1,04-2,31] 38 Hình 3.7a Phổ H NMR RHH2 Hình 3.7b Phổ H NMR giãn rộng RHH2 39 Hình 3.7c Phổ H NMR giãn rộng RHH2 Phổ 13 C NMR RHH2 có tín hiệu cộng hƣởng 29 nguyên tử cacbon bao gồm liên kết đôi [δC 121,73 (C-6); 140,77 (C-5)], nhóm methyl [δC 11,87 (C18); 11,99 (C-29), 18,79 (C-21); 19,05 (C-26); 19,40 (C-19); 19,82 (C-27)], nhóm methin, 11 nhóm methylen cacbon bậc bốn Sự có mặt liên kết đơi, nhóm methyl bậc cacbon bậc bốn phân tử RHH2 cho biết chất có chứa khung steroit đƣ c nhận định β-sitosterol Hình 3.7d.Phổ 13 C NMR RHH2 40 Hình 3.7e Phổ DEPT RHH2 Số liệu phổ 13 C NMR RHH2 đƣ c so sánh với giá trị tƣơng ứng đƣ c công bố h p chất β-sitosterol [6].Sự phù h p số liệu phổ NMR hai h p chất (bảng 2) cho phép khẳng định cấu trúc RHH2 β-sitosterol H p chất β- sitosterol sterol phổ biến loài thực vật bậc cao Chất khơng có mặt nhiều lồi thực vật mà c n đƣ c tìm thấy loài sinh vật biển 41 Bảng 3.3 Số liệu phổ NMR RHH2 δ 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 a b c Đo CDCl3, 125MHz, 500MHz, # δC 42 β-sitosterol [6] 3.3 Đánh giá hoạt tính sinh học RHH2 phân lập từ dịch chiết Râu hùm Do hàm lƣ ng thu đƣ c từ chất phân lập không nhiều nên tập trung nghiên cứu chất RHH2 (tách từ phân đoạn n hecxan) có cơng thức chất β-sitosterol (RHH2)là chất thu đƣ c với khối lƣ ng H p chất c số nghiên cứu cho thấy chúng có hoạt tính kháng tế ung thƣ nhƣng khơng mạnh [] Kết nghiên cứu chất β-sitosterol (RHH2)đƣ c thể qua khả kháng vi sinh vật kiểm định (bảng 3.4) hoạt tính chống oxi hố (bảng 3.5) Bảng 3.4.Khả háng vi sinh vật kiểm định chất β-sitosterol (RHH2) Mẫu RHH2 Kết bảng 3.4 xác định với khả kháng khuẩn kết cho thấy chất RHH2 có hoạt tính mạnh với chủng vi khuẩn Gram +, nhƣng yếu với chủng Gram - khơng có hoạt tính với nấm Kết so với nghiên cứu trƣớc thấp Điều chứng tỏ với Râu hùm chất có hoạt tính tập trung phần thân, rễ ảng ết thử hoạt tính chống oxy hố chấtβ-sitosterol (RHH2) Kết bảng 3.5 cho thấy chất β-sitosterol (RHH2) phân lập đƣ c từ Râu hùm khơng có hoạt tính oxi hóa hệ thử nồng độ