Xây Dựng Phương Pháp Định Lượng Sarsasapogenin Trong Chiết Xuất Yucca Bằng Phương Pháp Quang Phổ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA CÔNG NGHỆ  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG SARSASAPOGENIN TRONG CHIẾT XUẤT YUCCA BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN ThS Nguyễn Thị Diệp Chi Nguyễn Trịnh Trúc Linh MSSV: 2063974 Ngành: Cơng Nghệ Hóa Học-Khóa 32 Tháng 11/2010 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ Độc lập – Tự – Hạnh phúc BỘ MƠN CƠNG NGHỆ HĨA HỌC NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Cán hướng dẫn: Ths Nguyễn Thị Diệp Chi Đề tài: Sinh viên thực hiện: Nguyễn Trịnh Trúc Linh MSSV: 2063974 Lớp: Cơng Nghệ Hóa Học Khóa 32 Nội dung nhận xét: a Nhận xét hình thức LVTN b Nhận xét nội dung LVTN (Đề nghị gghi chi tiết đầy đủ):  Đánh giá nội dung thực đề tài:  Những vấn đề hạn chế: c Nhận xét sinh viên tham gia thực đề tài (Ghi rõ nội dung sinh viên chịu trách nhiệm thực có): d Kết luận, kiến nghị điểm: Cần Thơ, ngày tháng năm 2010 Cán chấm hướng dẫn TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ Độc lập – Tự – Hạnh phúc BỘ MƠN CƠNG NGHỆ HĨA HỌC NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN Cán phản biện: Đề tài: Sinh viên thực hiện: Nguyễn Trịnh Trúc Linh MSSV: 2063974 Lớp: Công Nghệ Hóa Học Khóa 32 Nội dung nhận xét: a Nhận xét hình thức LVTN b Nhận xét nội dung LVTN (Đề nghị gghi chi tiết đầy đủ):  Đánh giá nội dung thực đề tài:  Những vấn đề hạn chế: c Nhận xét sinh viên tham gia thực đề tài (Ghi rõ nội dung sinh viên chịu trách nhiệm thực có): d Kết luận, kiến nghị điểm: Cần Thơ, ngày tháng năm 2010 Cán chấm hướng dẫn NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Cần Thơ, ngày tháng 11 năm 2010 Cán hướng dẫn Nguyễn Thị Diệp Chi NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN Cần Thơ, ngày tháng 11 năm 2008 Cán phản biện Lời cảm ơn LỜI CẢM ƠN  Trong suốt quãng thời gian học tập rèn luyện giảng đường đại học Cần Thơ, em học hỏi nhiều kiến thức rèn giũa kinh nghiệm, kỹ vô q báu Đó nhờ cơng lao q thầy tận tình dạy dỗ truyền đạt kiến thức cho em, giúp em có hành trang để vững tin đường vào đời Em xin chân thành gởi lời tri ân chân thành đến tất quý thầy cô trường đại học Cần Thơ, đặc biệt mơn Cơng Nghệ Hóa Học, khoa Công Nghệ, trường Đại Học Cần Thơ Con xin gởi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến cô Nguyễn Thị Diệp Chi, người tận tâm giúp đỡ hoàn thành tốt đề tài luận văn tốt nghiệp Xin chân thành gởi lời cảm ơn ban giám đốc công ty Vemedim VN tạo điều kiện cho em thực đề tài Con xin chân thành cảm ơn Nguyễn Phương Hải anh chị phịng thí nghiệm Hóa lý Vemedim tạo điều kiện tốt nhất, giúp đỡ hoàn thành đề tài Con xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình – người ln bên con, động viên giúp đỡ suốt thời gian học tập Cuối cùng, xin cảm ơn người bạn tơi, động viên, khích lệ giúp đỡ nhiều suốt thời gian qua Xin chân thành cảm ơn! Cần Thơ, tháng 11 năm 2010 Nguyễn Trịnh Trúc Linh SVTH Nguyễn Trịnh Trúc Linh ii Tóm tắt TĨM TẮT Saponin nhóm glycoside tự nhiên tìm thấy nhiều lồi thực vật, với nhiều tính chất ứng dụng nhiều lĩnh vực từ dược phẩm, mỹ phẩm đến thực phẩm, đồ uống… đặc biệt lĩnh vực vật nuôi, thủy sản Saponin trích từ Yucca Schidigera, lồi sinh sống phát triển nơi khô cằn vùng Tây Bắc Trung châu Mỹ, có thành phần Sarsasapogenin Yucca Extract chế phẩm thường dùng chăn nuôi để giảm mùi hôi chất thải khí NH3 sinh Có nhiều phương pháp định lượng Sarsasapogenin như: phương pháp quang phổ, phương pháp HPLC, phương pháp tìm số phá huyết, số tạo bọt, số cá, phương pháp cân, phương pháp hóa học dựa vào khả tạo phức với cholesterol,… Phương pháp HPLC xác đắt tiền, phương pháp khác thường có sai số lớn Phương pháp quang phổ với ưu điểm đơn giản, chi phí thấp phù hợp với nhiều phịng thí nghiệm vừa nhỏ Saponin Yucca Extract thủy phân hỗn hợp ethanol acid HCl để tách sarsasapogenin Định lượng Sarsasapogenin dựa phản ứng tạo màu với p-Annisaldehyde, acid sulfuric ethylacetate tạo phức màu vàng bền Phương pháp áp dụng thành phẩm Yucca Extract Kiểm tra lại phương pháp hệ số hồi phục so sánh với kết định lượng HPLC Phương pháp có độ lệch chuẩn tương đối (RSD) ≤ 3%, độ hồi phục (RC) ≥ 97,0% đáp ứng yêu cầu kiểm nghiệm nguyên liệu thành phẩm Yucca Extract SVTH Nguyễn Trịnh Trúc Linh iii Mục lục MỤC LỤC  LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT ĐỀ TÀI iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH HÌNH ix DANH SÁCH BẢNG x DANH SÁCH PHỤ LỤC xi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xii DANH MỤC PHỤ LỤC xiii PHẦN MỞ ĐẦU Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu PHẦN TỔNG QUAN Chương KHÁI QUÁT VỀ CÂY YUCCA SCHIDIGERA 2.1 Đặc điểm 2.1.1 Phân loại khoa học 2.1.2 Đặc điểm hình thái 2.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh thái 2.2 Ứng dụng 2.2.1 Trong dược phẩm 2.2.2 Trong công nghiệp đồ uống 2.2.3 Trong công nghiệp thực phẩm 2.2.4 Trong công nghiệp mỹ phẩm 2.2.5 Trong thuốc thú y, vật nuôi, thủy sản SVTH Nguyễn Trịnh Trúc Linh iv Mục lục 2.2.6 Trong lĩnh vực khác 2.3 Hạn chế Chương KHÁI QUÁT VỀ SAPONIN 3.1 Định nghĩa 3.2 Tính chất 3.3 Phân loại 10 3.3.1 Saponin Triterpenoid 30 C 12 3.3.1.1 Saponin triterpenoid pentacyclic 12 3.3.1.2 Tetracyclic 14 3.3.2 Saponin Steroid 16 3.3.2.1 Nhóm Spirostan 16 3.3.2.2 Nhóm Furostan 17 3.3.2.3 Nhóm Aminofurostan 17 3.3.2.4 Nhóm Spirosolan 17 3.3.2.5 Nhóm Solanidan 18 3.4 Chiết xuất tinh chế Saponin 18 3.4.1 Chiết xuất 18 3.4.1.1 Đối với Saponin trung tính acid 18 3.4.1.2 Đối với Saponin kiềm 19 3.4.2 Tinh chế 19 3.5 Tác dụng công dụng 21 3.6 Các dược liệu chứa saponin 21 3.7 Saponin Yucca Schidigera 21 Chương CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SAPOGENIN 22 4.1 Phân tích định tính 22 4.1.1 Phương pháp hóa học 22 4.1.1.1 Phản ứng Salkowski để phát steroid 22 SVTH Nguyễn Trịnh Trúc Linh v Mục lục 4.1.1.2 Phản ứng Rosenthaler để phát steroid – triterpenoid 22 4.1.1.3 Phản ứng Liebermann-Burchard để phát steroid – triterpenoid 22 4.1.1.4 Phản ứng Carr-Price để phát steroid – triterpenoid 22 4.1.1.5 Phản ứng Rosenheim để phát steroid – triterpenoid 22 4.1.1.6 Phản ứng Noller để phát steroid – triterpenoid 22 4.1.1.7 Phản ứng Molish 22 4.1.1.8 Phản ứng Tortelli-Jafe (phát dây nối đôi steroit) 23 4.1.2 Phương pháp sắc ký mỏng .23 4.1.2.1 Dung môi khai triển 23 4.1.2.2 Thuốc thử phát 23 4.1.3 Dựa vào tính chất tạo bọt Saponin 25 4.2 Phân tích định lượng 25 4.2.1 Phương pháp quang phổ 25 4.2.1.1 Thuốc thử p-anisaldehyde 26 4.2.1.2 Thuốc thử Antimoy pentachloride 26 4.2.1.3 Thuốc thử Vanillin-Acid sulfuric 27 4.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 27 4.2.1.1 Cột ZirChrom-Wax 28 4.2.1.2 Cột BDS Hypersil C18 28 4.2.3 Phương pháp tìm số tạo bọt 29 4.2.4 Phương pháp tìm số phá huyết 30 4.2.5 Phương pháp tìm số cá 31 4.2.6 Phương pháp tìm khả tạo phức với cholesterol 31 4.2.7 Phương pháp cân 31 PHẦN THỰC NGHIỆM Chương THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ 32 5.1 Phương pháp tiến hành 32 SVTH Nguyễn Trịnh Trúc Linh vi Phần kết luận – Kiến nghị Kết luận Trong phạm vi nghiên cứu này, đề tài đạt kết sau: - Xây dựng phương pháp định lượng Sarsasapogenin Sarsasapogenin nguyên liệu Yucca Extract dạng lỏng (Nồng độ Sarsasapogenin nguyên liệu  18,0%) - Phương pháp có RSD = 0,615 %; hệ số hồi phục RC = 99,89% Giới hạn phát (LOD) = 3,1414mg/l Sarsasapogenin mẫu thử Giới hạn định lượng (LOQ) = 10,4712mg/l Sarsasapogenin mẫu thử - Phương pháp áp dụng cho phịng thí nghiệm với thiết bị đơn giản (máy quang phổ UV – vis) mà kết thu lại xác - Thẩm định phương pháp cho thấy dùng để định lượng Sarsasapogenin loại nguyên liệu, chất chiết xuất khác Yucca Kiến nghị Do thời gian thực có hạn nên đề tài xây dựng phương pháp định lượng mẫu Yucca Extract dạng lỏng Đối với chế phẩm Yucca Extract dạng bột thô, muốn định lượng phải thủy phân để chuyển hoạt chất dạng sapogenin Việc khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân chưa khảo sát kỹ SVTH Nguyễn Trịnh Trúc Linh 50 Tài liệu tham khảo TÀI LIỆU THAM KHẢO  [1] Ngơ Văn Thu Hóa học Saponin khoa Dược, trường Đại học y dược thành phố Hồ Chí Minh, 1990 [2] Nhiều tác giả Bài giảng dược liệu khoa Dược, trường Đại học y dược thành phố Hồ Chí Minh 1999 [3] Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu Phương pháp nghiên cứu hóa học thuốc, 1985, NXB Y học [4] Võ Thị Lan Xây dựng phương pháp xác định Streptomicin sulfate nguyên liệu dược phẩm theo phương pháp quang phổ UV-vis khoa Công nghệ, đại học Cần Thơ, 2006 [5] A.E Ceyhun Sezgin, N.Artik Determination of Saponin Content in Turkish Tahini Halvah by Using HPLC Adavance Journal of Food Science and Technology, 2010, 2, 109-115 [6] Yoko Uematsu, Keiko Hirata, Kumi Suzuki, Kenji Iida, Kunihiro Kamata, Investigation of Spectrophotometrically Determined Substances in Yucca Extract by GC/MS, TLC and On-column Injection GC, J Food Hyg Soc Japan, 2003, 45, 141-145 [7] Yoko Uematsu, Keiko Hirata, Kazuo Saito Spectrophotometric Determination of Saponin in Yucca Extract Used as Food Additive Journal Of Aoac International, 2000, 83, 1451-1454 [8] Harinder P.S Makkar Chemical and biological assays for quantification of major plant secondary metabolit, International Atomic Energy Agency Vienna, Austria [9] Ultra Bio-Logics Inc Yucca Extracts For Beverage Cosmetics Food and Animal Feed Applications International Export Division: 24 Sequin Rigaud QC, Canada (www.ublcorp.com) [10] Peter R Cheeke, Giáo sư Tiến sĩ dinh dưỡng OSU / LPI Affiliate Investigator, http://lpi.oregonstate.edu/sp-su98/saponins.html SVTH Nguyễn Trịnh Trúc Linh 51 Tài liệu tham khảo [11] Ing–Luen Shiau, Tzenge–Lien Shih, Ya–Nang Wang, Hsin–Tai Chen, Haw– Farn Lan, Han Chien Lin, Bing–Yuan Yang, Chun–Han Ko, Yasuhide Murase Quantification for Saponin from a Soapberry (Sapindus mukorossi Gaertn) in Cleaning Products by a Chromatographic and two Colorimetric Assays J Fac Agr., Kyushu Univ., 2009, 54, 215–221 [12] http://my.opera.com/vuonhoa/blog/show.dml/4081843, 9h30 ngày 23/07/10 [13] http://www.tytyga.com/category/Yucca+Plant+Nursery, 9h30 ngày 23/07/10 [14] http://en.wikipedia.org/wiki/Yucca, 9h30 ngày 23/07/10 [15] http://www.answers.com/topic/yucca, 9h30 ngày 23/07/10 [16] TS Nguyễn Phú Hòa, Khoa Thủy Sản, Đại Học Nông Lâm TP.HCM Sử dụng chất chiết từ Yucca nuôi trồng thủy sản http://uvvietnam.com.vn/NewsDetail.aspx?newsId=70, 9h30 ngày 23/07/10 [17] http://en.wikipedia.org/wiki/Yucca_schidigera, 9h30 ngày 23/07/10 [18] http://www.thongnhat.com/products.php?p_id=9, 9h30 ngày 23/07/10 [19] http://www.thuysanvietnam.com.vn/index.php?act=news&idroot=23&idcat =25&id=3350&stt=7, 9h30 ngày 23/07/10 [20] http://hoacaycanh.com.vn/index.php?vnTRUST=mod:product%7Cact:detail% 7CpID:587, 9h30 ngày 23/07/10 SVTH Nguyễn Trịnh Trúc Linh 52 Phụ lục Phụ lục HÓA CHẤT VÀ THUỐC THỬ A – HÓA CHẤT STT Tên – Cas No Sulfuric Acid 98% H2SO4 Cas-No: 7664-93-9 M = 98 Ethanol C2H5OH Cas-No: 64-17-5 M = 46 p-Anisaldehyde Code-No: 822314 Cas-No:123-11-5 Công thức Dietylether C8 H O M = 136 C2H5OC2H5 Cas-No: 60-29-7 M = 74 Sodiumsulfate khan Na2SO4 Cas-No: 7757-82-6 M = 142 Ethylacetate Cas-No: 141-78-6 Chất chuẩn Sarsasapogenin Cas-No: 126-19-2 SVTH Nguyễn Trịnh Trúc Linh CH3COOC2H5 M = 88 C27H44O3 M = 416 Cấu tạo Nguồn gốc Merck Công ty cổ phần hóa chất đầu tư khoa học kỹ thuật Merck Merck Merck Merck Sigma Aldrich 53 Phụ lục 10 Acetonitril C2 H N Cas-No: 75-05-8 M = 41 Chlohydric acid 37% Cas no: 7647-01-0 Nước RO HCl M = 36,5 Merck H – Cl H2 O Merck Công ty Vemedim M = 18 B – THUỐC THỬ Tên dung dịch Cách pha Chlohidric Acid 2M Hút 17 ml Chlohidric Acid + H2O v/đ 100 ml DD tạo màu 0,5 ml dd p-Anisaldehyde + 99,5 ml dd Ethylacetate DD acid 50 ml dd acid Sulfuric + 50 ml dd Ethylacetate DD pha động 40 ml dd acetonitrile + H2O v/đ 100 ml DD chuẩn Sarsasapogenin 49,8 mg Sarsasapogenin chuẩn + Methanol v/đ 50 ml SVTH Nguyễn Trịnh Trúc Linh 54 Phụ lục Phụ lục THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ A – THIẾT BỊ TT Tên – Model – Hãng sản xuất Cân phân tích –  Mức cân tối đa: 320g CP 224S Sartorius –  Độ phân giải: 0,1 mg  Calib nội Đức Quang phổ kế UV-Vis Đặc điểm Ultrospec 2000 Pharmacia – Anh Hình ảnh • Khoảng quét: 190 – 1100nm • Độ phân giải: 1nm • Thang đo: – • Độ phân giải: 0,001 • Kích thước chung: 10"x12"x11.5" Bể siêu âm – 1510 • Kích thước chậu: 6"x5.5"x4" Branson • Trọng lượng: 4,5kg • Tần số: 40 kHz Hệ thống máy HPLC D – 700 Hitachi- Japan Detector: - UV-Vis diode model SPD-20AV  - Huỳnh quang RF-10AXL Bếp đun CERAMAG Midi IKA WORKS SVTH Nguyễn Trịnh Trúc Linh 55 Phụ lục Bể ổn nhiệt nước WNE 14 - Đức Máy đo pH METTELER TOLEDO Bếp đun cách thủy Memmert - Thể tích 14 lít; chỗ,  87 mm - Nhiệt độ 5oC nhiệt độ môi trường đến + 95oC - Độ lệch nhiệt độ : ± 0.1 oC (độ biến đổi) / ± 0.25 oC (độ phân phối) - Chương trình thời gian: tùy chọn - Kích thước trong: 350 x 290 x 140mm - Kích thước ngồi : Với nắp bằng: 578 x 436 x 238 mm Với nắp tháp: 578 x 436 x 347 mm - Trọng lượng : 15 kg - Nguồn: 230V, 50/60 Hz, 1.8KW Nhiệt độ 50C nhiệt độ môi trường đến 900C  B – DỤNG CỤ TT Tên dụng cụ Hãng sản xuất Đặc điểm Cốc loại Schott – Đức Bình tam giác Schott – Đức Bình định mức loại Duran – Đức Loại A Pipet loại Isolab – Đức Loại A Phễu chiết 100 ml LMS – Đức Phân vạch ml SVTH Nguyễn Trịnh Trúc Linh 56 Phụ lục Thẩm định phương pháp phân tích Phụ lục THẨM ĐỊNH CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 4.1 Tầm quan trọng việc thẩm định Thẩm định phương pháp phân tích q trình tiến hành thực nghiệm thông số đặc trưng phương pháp để chứng minh phương pháp đáp ứng u cầu phân tích dự kiến Nói cách khác, việc thẩm định phương pháp phân tích yêu cầu phải chứng minh cách khoa học tiến hành thử nghiệm sai số mắc phải nhỏ chấp nhận Trong tiêu chuẩn phải xây dựng phương pháp phân tích hay gọi quy trình thử nghiệm để giúp cho việc thực kiểm tra chất lượng tiêu chí đề cho tiêu chuẩn Mục tiêu việc thẩm định phương pháp phân tích để chứng tỏ quy trình đáp ứng với yêu cầu dự kiến Phương pháp phân tích sau thẩm định đưa vào dược điển đưa vào tiêu chuẩn sở để xin đăng kí lưu hành 4.2 Nội dung thẩm định Cơ sở để thẩm định quy trình phân tích dựa vào sở sau: Độ chọn lọc (specificity) Độ lặp lại (repeatibility) Độ (accuracy) Giới hạn phát (limit of detection) Giới hạn định lượng (limit of quantition) Tính tuyến tính (linearity) Miền giá trị (range) 4.2.1 Độ chọn lọc (specificity) Độ chọn lọc hay gọi tính đặc hiệu quy trình phân tích khả quy trình cho phép xác định xác đặc hiệu chất cần phân tích khơng ảnh hưởng có mặt chất khác có mẫu thử Cụ thể: SVTH Nguyễn Trịnh Trúc Linh 57 Phụ lục Thẩm định phương pháp phân tích Với thử định tính: đảm bảo xác chất cần thử Với thử tinh khiết: đảm bảo xác định xác hàm lượng giới hạn tạp chất có mẫu thử chất liên quan, kim loại nặng chất phân hủy,… Với thử định lượng: đảm bảo kết thu hàm lượng chất cần phân tích mẫu xác Trong định lượng tính đăc hiệu biểu thị độ chênh lệch hiệu kết thu từ mẫu giả định với kết thu từ mẫu thử Tính đặc hiệu độ nhiễu phương pháp Độ nhiễu thấp, tính đặc hiệu cao Cách tiến hành Chuẩn bị mẫu: xác định theo phương pháp đề xuất với mẫu thử, ta tiên hành mẫu giả định có cơng thức thành phần hoạt chất hoàn toàn giống mẫu thử mẫu trắng tức mẫu bao gồm thành phần giống hệt mẫu đem thử không chứa hoạt chất cần thử Xác định mẫu phương pháp đề xuất Kết thu so với mẫu trắng Xác định hiệu hay độ sai lệch kết thu khác biệt  R kết nhỏ tính đặc hiệu phương pháp phân tích cao Tính chọn lọc dùng để làm sáng tỏa trường hợp chế phẩm bắt đầu có sản phẩm phân hủy Trong trường hợp phải nghiên cứu độ bền vững thuốc để tính tuổi thọ, ta thường phải xây dựng phương pháp định lượng hoạt chất điều kiện có sản phẩm phân hủy Khi chưa xác định có hay khơng sản phẩm phân hủy điều tốt ta nên tự tạo mẫu biết chắn có sản phẩm phân hủy đem so sánh với mẫu hoàn toàn biết chắn khơng có sản phẩm phân hủy Kết thu cho phép thẩm định tính chọn lọc phương pháp Còn trường hợp chế phẩm có nhiều thành phần việc xác định tính chọn lọc lại cần thiết Yêu cầu: Sự khác biệt giá trị tìm lại mẫu đơn mẫu đa phải nhỏ 0,5 % Rdon  Rda R  Rdon Rdon SVTH Nguyễn Trịnh Trúc Linh  100%  5% (1.1) 58 Phụ lục Thẩm định phương pháp phân tích 4.2.2 Độ (repeatibility) Độ quy trình phân tích mức độ sát gần (closeness) giá trị tìm thấy với giá trị thực áp dụng quy trình đề xuất mẫu thử làm đồng điều kiện xác định Rc (%)  X Re cov ery X Theory  100 (1.2) Độ bị ảnh hưởng sai số hệ thống (stematic errors) Đại lượng đặc trưng cho độ đúng: Cách xác định: xác định Rc cách sau: a Đo dung dịch chuẩn có nồng đọ dã biết xác Tỷ số kết đo trị số biết thể độ phương pháp b So sánh kết phương pháp với phương pháp cũ biết độ c Phương pháp thêm chuẩn: thêm lượng biết chất chuẩn thêm vào mẫu thử biết nồng độ Dùng phương pháphân tíchhử tìm lại giá trị sau thêm vào d Phương pháp mẫu trắng: thêm lượng biết (  nồng độ dự kiến) chất chuẩn vào mẫu trắng Dùng phương pháp phân tích để tìm lại giá trị sau thêm vào Yêu cầu Rc phải nằm khoảng 98%-102% (theo nông dược thuộc thú y Australia) 4.2.3 Độ lặp lại (accuracy) Độ xác mức độ sát gần ( ) kết thử riêng rẽ x1 với giá trị trung bình x thu áp dụng phương pháp đề xuất cho mẫu thử đồng điều kiện xác định Độ xác bị ảnh hưởng sai số ngẫu nhiên (random errors) Độ xác cho biết mức độ phân tán phép thử song song đánh giá qua đại lượng độ lệch chuẩn S (hoặc phương sai S2) SD   n i 1 ( xi   xn )2 n 1 SVTH Nguyễn Trịnh Trúc Linh (1.3) 59 Phụ lục Thẩm định phương pháp phân tích Trong đó: xi: giá trị đo thứ i x : giá trị trung bình n: số lần đo độ lệch chuẩn tương đối RSD%: RSD(%)  Sn 100  xn (1.4) RSD nhỏ phương phápcàng xác Cách thực hiện: Với mẫu làm đồng nhất, tiến hành xác định phương pháp đề xuất n lần (n=6-10 hay nhiều hơn), sau áp dụng cơng thức tính SD RSD phương pháp Yêu cầu RSD nhỏ, phương pháp phân tích xác, RSD phịng thí nghiệm đưa Theo nơng cục y dược thuốc thú y Australia RSD  2% 4.2.4 Độ tuyến tính (linearity) Độ tuyến tính phương pháp phân tích khả luận kết thử phương pháphoặc phép biến đổi toán học hay trực tiếp dực vào tươgn quan tỉ lệ đại lượng đo nồng độ Độ tuyến tính miền giá trị xác định hệ số tương quan Cách xác định: Tiến hành thực nghiệm để xác định ứng với nồng độ x biết trước giá trị đo y ta biết y phụ thuộc tuyến tính vào x có nghĩa khoảng nồng độ cần khảo sát đường biểu diễn y theo x đường thẳng (đoạn thẳng) theo phương trình sau: y = ax+b (1.5) Dựa vào kết hu từ thực nghiệm x y tương ứng ta tính hệ số tương quan: SVTH Nguyễn Trịnh Trúc Linh 60 Phụ lục Thẩm định phương pháp phân tích r x1 y1  nXY ( X  nX )  ( yi2  nY ) i (1.6) X, Y giá trị trung bình R phải nằm giá trị -1, +1 Nếu r = 1: có tương quan tuyến tính rõ rệt r > 0: có tương quan đồng biến r < 0: có tương quan nghịch biến r < 0,5: coi khơng có tương quan tuyến tính r > 0,5: có phụ thuộc tuyến tính Sau xác định khoảng tuyến tính phương pháp, ta xây dựng phương trình hồi quy khoảng tức tìm hệ số a b phương trình trên: X Y  ( X  Y )   n a  X  ( X ) i i i i i (1.7) j n b = y – ax (1.8) Là giá trị trung bình xi yi Như sau xây dựng phương trình rồi, biết suy y Yêu cầu Tùy theo giá trị hoạch định mà chọn giá trị R Nói chung R  0,999 4.2.5 Giới hạn phát (LOD) (limit of detection) Giới hạn phát nồng độ thấp chất thử mẫu thử cịn phát phương phápđề xuất, thơng số phương pháp thử giới hạn Giới hạn phát thường biểu thị nồng độ phần trăm, phần ngàn, phần tỷ chất cần thử mẫu Việc xác định giới hạn phát không cần thiết phải SVTH Nguyễn Trịnh Trúc Linh 61 Phụ lục Thẩm định phương pháp phân tích định lượng xác mà cần xác định chất thử có nồng độ thấp hay cao giới hạn Cách xác định: Việc xác định tùy thuộc vào phương pháp phân tích dụng cụ hay không dụng cụ Với phương pháp dụng cụ: Theo mẫu trắng: đo mẫu trắng lần,, có kết đo X1-6 Tính giá trị trung bình X đọ chuẩn SD kết Tìm đường thẳng y = aC + b, nồng độ C tương ứng với giá trị y = X + (  SD) Nồng độ C LOD Với phương pháp không dụng cụ: Tiến hành xác định giới hạn phát cách phân tích mẫu có nồng độ biết sau giảm dần nồng độ phương pháphương phápha lỗng ½ chẳng hạn đạt đến mức nồng độ tối thiểu mà cịn phát nồng độ cách chắn 4.2.6 Giới hạn định lượng (LOQ) (limit of quantition) Giới hạn định lượng thông số phương pháp phân tích định lượng hợp chất có khung mẫu với lượng thấp tạp chất nguyên liệu làm thuốc sản phẩm phân hủy có chế phẩm Giới hạn định lượng nồng độ thấp chất cần phân tích có mẫu thí nghiệm cịn xác định với độ độ xác chấp nhận Giới hạn định lượng biểu thị nồng độ phần trăm, phần ngàn, phần tỷ có chất cần phân tích có mẫu Cách xác định: Bằng phương pháp dụng cụ Theo mẫu trắng: đo mẫu trắng lần, có kết đo X1-6 Tính giá trị trung bình X độ lệch chuẩn SD kết Tìm đường thẳng y = aC + b, nồng độ C tương ứng với giá trị y = X + (10  SD) Nồng độ C LOQ Bằng phương pháp không dụng cụ SVTH Nguyễn Trịnh Trúc Linh 62 Phụ lục Thẩm định phương pháp phân tích Tiến hành phân tích mẫu với nồng độ biết Sau giảm dần nồng độ xác lập mức tối thiểu cịn phát chất cần thử với độ xác độ chấp nhận 4.2.7 Miền giá trị (khoảng nồng độ tuyến tính) ( Range) Miền giá trị phương pháp phân tích khoảng thường nồng độ nồng độ cao nồng độ thấp xác định theo phương pháp đề xuất đạt độ xác, độ tính tuyến tính chấp nhận Miền giá trị thường biểu thị khoảng nồng độ mà khoảng nồng độ phụ thuộc đại lượng đo nồng độ tuyến tính Cách xác định Kết hợp với việc xác định tính chất tuyến tính ta xác định miền giá trị Việc xác định nhận biết trực tiếp đồ thị ta vẽ đường chuẩn độ dựa vào kết thu từ thực nghiệm Sau xác định miền giá trị tính tốn hay đồ thị, phải kiểm chứng lại độ độ xác hai giá trị cận cận để kết luận miền giá trị ta dùng phương pháp đề xuất xác định với giá trị nằm miền kết thu đảm bảo độ độ xác Thơng thường phần kết luận phương pháp đo quang ta hay thấy nêu lên sau: khoảng nồng độ tuyến tính, hay khoảng nồng độ tuân theo định luật LambertBeer 4-12 mg/ml SVTH Nguyễn Trịnh Trúc Linh 63 Phụ lục Phụ lục XỬ LÝ KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG Sử dụng phương pháp so sánh với mẫu đối chứng để tính tốn kết thí nghiệm - DD đối chứng có: nồng độ Cđc biết độ hấp thu Absđc - DD mẫu thử có: nồng độ Ct (chưa biết) độ hấp thu Abst Tính nồng độ mẫu thử: C1 = (Cđc x Abst) / Absđc SVTH Nguyễn Trịnh Trúc Linh 64 ... phương pháp định lượng sarsasapogenin chiết xuất Yucca phương pháp quang phổ? ?? thực 1.2 Mục đích yêu cầu Xây dựng phương pháp định lượng Sarsasapogenin Yucca Schidigera phương pháp quang phổ UV-vis... NH3 sinh Có nhiều phương pháp định lượng Sarsasapogenin như: phương pháp quang phổ, phương pháp HPLC, phương pháp tìm số phá huyết, số tạo bọt, số cá, phương pháp cân, phương pháp hóa học dựa... xác định nồng độ Sarsasapogenin máy quang phổ UV-vis  Tiến hành:  Khảo sát thông số, chọn giá trị tối ưu để xây dựng phương pháp phân tích Sarsasapogenin Yucca Extract  Áp dụng phương pháp xây