Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại của nấm men sinh bào tử bắn phân lập từ lá cây ở vườn quốc gia cúc phương

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN …………………… Đào Thị Lương NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ PHÂN LOẠI CỦA NẤM MEN SINH BÀO TỬ BẮN PHÂN LẬP TỪ LÁ CÂY Ở VƯỜN QUỐC GIA CÚC PHƯƠNG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 62.42.40.01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC C ơng trình hồn thành tại: - Bảo tàng giống Vi sinh vật HNhàNậtộBi-ả2008n–JCM, RIKEN, Nhật Bản - Bộ môn Vi sinh vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội - Viện Vi sinh vật & Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Phạm Văn Ty GS.TS Nguyễn Lân Dũng Phản biện 1: GS TS Nguyễn Đình Quyến Phản biện 2: PGS TS Lê Gia Hy Phản biện 3: PGS TS Nguyễn Xuân Thành Luận án bảo vệ trước Hội đồng cấp Nhà nước chấm luận án tiến sĩ họp Phòng 418, nhà T1, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Vào hồi 00 ngày 24 tháng năm 2008 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin- Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội MỤC LỤC Lời cam đoan Lời cảm ơn Danh mục ký hiệu chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình vẽ, đồ thị Mục lục MỞ ĐẦU Chương Tổng quan tài liệu 1.1 Đa dạng sinh học đa dạng vi sinh vật 1.1.1 Đa dạng sinh học 1.1.2 Đa dạng vi sinh vật 1.1.3 Nghiên cứu đa dạng nấm men nấm men sinh bào tử bắn 1.1.3 Nghiên cứu nấm men Thái Lan 1.1.3.2 Nghiên cứu nấm men Indonesia 1.1.3.3 Nấm men rừng Đài Loan 1.1.3.4 Nghiên cứu nấm men sinh bào tử bắn Trung Quốc 1.1.3.5 Nghiên cứu nấm men sinh bào tử bắn Nhật Bản 1.1.3.6 Nghiên cứu nấm men sinh bào tử bắn số nước khác 1.1.3.7 Nghiên cứu nấm men Việt Nam 1.2 Đại cương nấm men 1.2.1 Định nghĩa nấm men 1.2.2 Hình thái cấu trúc nấm men 1.2.2.1 Hình thái tế bào nấm men 1.2.2.2 Cấu trúc tế bào 1.2.3 Phương thức sinh sản nấm men 1.2.3.1 Sinh sản vơ tính 1.2.3.2 Sinh sản hữu tính 1.2.4 Phân loại nấm men 1.2.4.1 Các nấm men túi 1.2.4.2 Các nấm men đảm ix 1.3 ứng dụng nấm men đời sống 1.3.1 Nấm men lên men etylic 1.3.2 Các nấm men nhà sản xuất protein đơn bào 1.3.3 Các nấm men nguồn sản xuất sản phẩm công nghiệp khác 1.3.4 Nấm men dùng làm tác nhân probiotic liệu pháp sinh học trị liệu 1.3.5 Sử dụng nấm men để hạn chế bệnh sau thu hoạch trái ngũ 1.3.6 Nấm men tác nhân phục hồi sinh học 1.3.7 Cải biến nấm men đột biến, lai thể nguyên sinh kĩ thuật ADN tái tổ hợp 1.3.8 Dùng nấm men làm sinh vật biểu ADN tái tổ hợp 1.4 Các tiêu sử dụng phân loại nấm men 1.4.1 Các nghiên cứu dùng phân loại nấm men 1.4.1.1 Các đặc điểm hình thái ni cấy 1.4.1.2 Các đặc điểm sinh lý sinh hoá 1.4.1.3 Các đặc điểm hoá phân loại sinh học phân tử 1.4.2 Các bước định danh 1.4.2.1 Phương pháp phân loại thông thường 1.4.2.2 Phương pháp sử dụng số liệu trình tự ADNr 1.4.3 Các tiêu dùng phân loại đại 1.4.3.1 Hoá phân loại 1.4.3.2 Sinh học phân tử 1.5 Nấm men sinh bào tử bắn 1.5.1 Đặc điểm nấm men sinh bào tử bắn 1.5.2 Lịch sử nghiên cứu nấm men sinh bào tử bắn 1.5.3 Vị trí nấm men sinh bào tử bắn phả hệ Chương Đối tượng phương pháp nghiên cứu 2.1 Nguyên liệu 2.1.1 Mẫu thu thập 2.1.2 Vi sinh vật x 2.1.2.1 Các vi sinh vật kiểm định 2.1.2.2 Các chủng nấm men chuẩn dùng lai ADN genom 2.1.3 Thiết bị máy móc 2.1.4 Các loại mơi trường 2.1.4.1 Mơi trường phân lập nuôi nấm men sinh bào tử bắn 2.1.4.2 Môi trường phân loại 2.1.4.3 Môi trường nuôi vi sinh vật kiểm định 2.1.4.4 Môi trường xác định hoạt tính enzym 2.1.4.5 Mơi trường cho sinh tổng hợp enzym 2.2 Phương pháp 2.2.1 Phương pháp phân lập 2.2.2 Phương pháp phân loại nấm men 2.2.2.1 Phân loại dựa vào đặc điểm hình thái 2.2.2.2 Phân loại dựa vào đặc điểm sinh lý, sinh hoá 2.2.2.3 Hoá phân loại 2.2.2.4 Phân loại dựa vào sinh học phân tử 2.2.3 Xác định hoạt tính enzym 2.2.4 Xác định hoạt tính kháng sinh 2.2.5 Xác định sinh khối 2.2.6 Xác định pH 2.2.7 Nghiên cứu điều kiện ni cấy thích hợp cho q trình sinh tổng hợp enzym dịch ni nấm men 2.2.7.1 Lựa chọn mơi trường thích hợp 2.2.7.2 Lựa chọn pH ni cấy thích hợp 2.2.7.3 Lựa chọn nhiệt độ thích hợp 2.2.7.4 Lựa chọn thời gian ni cấy thích hợp Chương Kết thảo luận 3.1 Phân lập nấm men 3.1.1 Địa điểm thu thập mẫu 3.1.2 Phân lập 3.2 Phân loại nấm men sinh bào tử bắn 3.2.1 Phân loại đến chi 3.2.1.1 Hệ thống ubiquinon chủ yếu xi 3.2.1.2 Xác định xyloza tế bào 3.2.1.3 Phân loại đến cấp độ chi 3.2.2 Vị trí phân loại chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc chi Bullera 3.2.2.1 Xác định phân tích trình tự ADNr 18S 3.2.2.2 Xác định phân tích trình tự ADNr ITS 3.2.2.3 Xác định phân tích trình tự ADNr 26S đoạn D1/D2 3.2.2.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc chi Bullera 3.2.2.5 Phân loại chủng nấm men thuộc chi Bullera đến loài 3.2.2.6 Mơ tả lồi 3.2.3 Vị trí phân loại chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc chi Kockovaella 3.2.3.1 Xác định phân tích trình tự ADNr 18S 3.2.3.2 Xác định phân tích trình tự ADNr vùng ITS 3.2.3.3 Xác định phân tích trình tự ADNr 26S đoạn D1/D2 3.2.3.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc chi Kockovaella 3.2.3.5 Phân loại chủng nấm men thuộc chi Kockovaella đến lồi 3.2.3.6 Mơ tả lồi 3.3 Sự đa dạng nấm men sinh bào tử bắn Vườn quốc gia Cúc Phương 3.4 Hoạt tính sinh học chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc chi Bullera 3.4.1 Khả sinh enzym ngoại bào 3.4.2 Khả đối kháng với vi sinh vật khiểm định chủng nấm men 3.4.3 Các điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sinh tổng hợp enzym ngoại bào 3.4.3.1 Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp 3.4.3.2 Lựa chọn pH ni cấy thích hợp 3.4.3.3 Lựa chọn nhiệt độ thích hợp xii 3.4.3.4 Lựa chọn thời gian ni cấy thích hợp KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHẦN PHỤ LỤC Phụ lục Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, bào tử chủng nấm men phân lập Phơ lơc HƯ thèng ubiquinon cđa c¸c chđng nÊm men nghiªn cøu Phụ lục Mơ tả lồi chi Bullera Phơ lơc M« tả loài chi Kockovaella Ph lc Một số hình ảnh minh họa xiii MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Nấm men sinh bào tử bắn nhóm nấm men lớn, tồn tự nhiên, chiếm 14/90 chi nấm men với số lượng loài chiếm 1/10 tổng số loài nấm men biết (khoảng 80 lồi) Đây nhóm vi sinh vật phong phú, hữu thiên nhiên từ trước đến biết đến Là nhóm nấm men có tiềm sinh hàng loạt enzym nên cần phải nghiên cứu để phát enzym có tính Đây miền đất trống, nghiên cứu có khả phát nhiều lồi cho khoa học, góp phần bổ sung vào danh mục loài giới Việt Nam nằm khu vực có khí hậu nóng, ẩm, tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật phát triển Việt Nam đánh giá quốc gia có đa dạng sinh học phong phú Ở Việt Nam, nghiên cứu đa dạng vi sinh vật thực bắt đầu, để góp phần vào cơng tìm kiếm nguồn gen mới, tiến hành thẩm định, tìm cách ứng dụng lưu giữ chúng cho hệ sau, thực đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân loại nấm men sinh bào tử bắn phân lập từ Vườn Quốc gia Cúc Phương” Mục đích đề tài - Tìm hiểu nấm men sinh bào tử bắn- nhóm vi sinh vật phong phú cư trú nhiều loại mà từ trước đến chưa biết đến Việt Nam- khởi nguồn cho nhánh nghiên cứu đa dạng sinh học - Tìm kiếm phát loài cho khoa học, bổ sung vào danh mục loài giới - Bước đầu tìm hiểu khả sinh chất hoạt động sinh học (các loại enzym ngoại bào) nhóm nấm men Những đóng góp luận án: - Là cơng trình nghiên cứu đa dạng sinh học nấm men sinh bào tử bắn Việt Nam - Đã phát 16 loài quốc tế cơng nhận: 12 lồi thuộc chi Bullera loài thuộc chi Kockovaella Đưa địa danh Việt Nam vào danh mục lồi giới - Cơng trình tìm hiểu khả sinh chất hoạt động sinh học nhóm nấm men Bố cục luận án: Luận án bao gồm phần mở đầu, tổng quan, đối tượng phương pháp nghiên cứu, kết thảo luận, kết luận kiến nghị, danh mục cơng trình, tài liệu tham khảo, phụ lục Luận án có 25 bảng, 46 hình, 108 tài liệu tham khảo NỘI DUNG LUẬN ÁN Chương TỔNG QUAN 1.1 Đa dạng sinh học đa dạng vi sinh vật 1.2 Đại cương nấm men 1.3 Ứng dụng nấm men đời sống 1.4 Các tiêu sử dụng phân loại nấm men 1.5 Nấm men sinh bào tử bắn Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chủng nấm men: Các chủng nấm men sinh bào tử bắn phân lập theo phương pháp Nakase Takashima (1993) Các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hố: Chủ yếu theo mơ tả Yarrow (1998) Khả đồng hoá nitơ xác định theo phương pháp Nakase Suzuki(1986) Vitamin đòi hỏi bắt buộc xác định theo Komagata Nakase (1967) Các đặc điểm hoá phân loại (chemotaxonomy): Tách chiết, tinh xác định ubiquinon theo phương pháp Nakase Suzuki (1986) Xyloza tế bào phân tích sắc ký lớp mỏng sắc ký lỏng cao áp theo Nakase cộng (1976) Phân tích trật tự xây dựng phát sinh: Trình tự ADNr 18S, ITS bao gồm 5,8S D1/D2 26S xác định theo Takashima Nakase (1999), Kurtzman Robnnet (1997) Sử dụng chương trình computer CLUSTAL X ver 1.83 Thompson cộng (1994) Các trình tự tham khảo dùng nghiên cứu phát sinh chủng loại lấy từ liệu DDBJ, EMBL Gen Bank Cây phát sinh xây dựng theo Kimura (1980) sử dụng phương pháp Saitou Nei (1987) Thí nghiệm lai ADN-ADN: Phân lập tinh ADN thực theo phương pháp Takashima Nakase (2000) Các thí nghiệm lai ADN-ADN genom thực theo phương pháp huỳnh quang Ezaki cộng (1989) Năm chủng nghiên cứu tạo thành nhánh khác biệt với loài biết So sánh trình tự ADNr vùng ITS thể rõ: chủng nghiên cứu sai khác 5-12/571 bp (0,9-2,1 %) sai khác với loài gần 35-54/571 bp (6,1-9,5 %) VY-61 sai khác với VY-67 VY- 125 bp (0,9 %), khác với VY-127 bp (1,4 %) khác với VY-137 10 bp (1,8 %) Hai chủng VY-67 VY-125 có trình tự ITS tương đồng, sai khác với VY-127 VY-137 bp (1,6 %) Chủng VY-127 sai khác với VY-137 12 bp (2,1 %) Từ kết xếp chủng nghiên cứu thuộc loài khác khác với lồi biết Trình tự ADNr 26S đoạn D1/D2 (600 bp) xác định Cây phả hệ xây dựng chủng nghiên cứu với 27 loài thuộc chi Auriculibuller, Bullera, Cryptococcus, Fellomyces, Kockovaella Sterigmatosporidium Quan sát phát sinh chủng loại cho thấy chủng nghiên cứu nằm gần tách hẳn nhánh Kockovaella schimae So sánh trình tự ADNr đoạn D1/D2 khẳng định điều này: chủng nghiên cứu sai khác 2-5/591 bp (0,3-0,8 %), sai khác với Kockovaella schimae 3-5/591 bp (0,5-0,8 %) sai khác với lồi có quan hệ gần khác 6-12/591 bp (1,0-2,0 %) Từ kết phân tích trình tự ADNr 18S, vùng ITS D1/D2 26S chủng nấm men thuộc chi Kockovaella chưa thể khẳng định vị trí phân loại chúng Muốn biết chắn chúng có phải lồi khơng cần phải thực lai ADN genom Kết ghi bảng 3.14 cho thấy chủng VY-61 có tỷ lệ bắt cặp ADN thấp với chủng nghiên cứu khác (15-35 %) thấp với lồi có quan hệ gần (2-22 %) Hai chủng VY-67 VY-125 có tỷ lệ bắt cặp với cao (84-93 %), thấp với loài nghiên cứu khác 28-47 %, thấp với lồi có quan hệ gần (3-30 %) Chủng VY-127 có tỷ lệ bắt cặp ADN thấp với chủng nghiên cứu khác (15-47 %) thấp với loài có quan hệ gần (2-39 %) Chủng VY-137 có tỷ lệ bắt cặp ADN thấp với chủng nghiên cứu khác (25-47 %) thấp với lồi có quan hệ gần (21-26 %) Từ kết nghiên cứu khẳng định VY-67 VY-125 thuộc loài mới, VY-61, VY-127 VY-137 thuộc loài khác Bảng 3.14 Kết lai ADN genom chủng nghiên cứu thuộc chi Kockovaella với lồi có quan hệ họ hàng gần Loài VY-61 Tỷ lệ ADN bắt cặp (%) Kockovaella sp 100 ND 35 33 31 16 K schimae F distylii F chinensis F lichenicola F sichuanensis ND, kh«ng cã sè liƯu Mơ tả lồi thuộc chi Kockovaella Có 5/5 chủng nấm men sinh bào thử bắn thuộc chi Kockovaella xếp vào loài Bốn chủng chuẩn đại diện cho loài là: VY-61, VY-125, VY-127 VY-137 Các chủng chuẩn mô tả tiếng La tinh tiếng Việt gồm đặc điểm hình thái, ni cấy; đặc điểm sinh lý sinh hoá; đặc điểm hoá phân loại; tên chủng chuẩn, nguồn gốc mã số nơi lưu giữ Việt Nam Nhật Bản 3.3 SỰ ĐA DẠNG CỦA NẤM MEN SINH BÀO TỬ BẮN Ở VƯỜN QUỐC GIA CÚC PHƯƠNG Từ 20 mẫu thu thập Vườn Quốc gia Cúc Phương, phân lập 151 chủng nấm men, có 121 chủng sinh bào tử bắn Các chủng nấm men sinh bào tử bắn phân lập 100% số mẫu thu thập chiếm 80,13 % số chủng phân lập Trong số 85 chủng lựa chọn để nghiên cứu, 44 chủng thuộc lớp Hymenomycetes gồm chi Bullera (39 chủng) Kockovaella (5 chủng) Có 39 chủng thuộc lớp Urediniomyces gồm chi Bannoa (5 chủng), Sporobolomyces (34 chủng) Hai chủng lại chi Tilletiopsis thuộc lớp Ustilaginomyces Trong luận án này, thực nghiên cứu sâu 44 chủng thuộc lớp Hymenomycetes cho thấy đa dạng loài phong phú Vườn Quốc gia Cúc Phương Số lượng chủng nấm men loài thuộc lớp Hymenomycetes mẫu thu thập Vườn Quốc gia Cúc Phương phong phú, chiếm 70,4 % số lượng chủng nghiên cứu Điển hình Mù u, (Calophyllum membranaceum) 4/6 chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc loài mới, Bời lời (Litsea euosma) Thăng mộc núi (Anadendrum montanum) 3/4 chủng thuộc loài Lá Tình hoa đẹp (Eranthemum pulchellum) Shimastoglottis calyptrata chứa 3/3 chủng thuộc lồi Chỉ có mẫu (15%) khơng tìm thấy nấm men thuộc lớp Hymenomycetes mẫu (15%) khơng tìm thấy lồi Kết bảng 3.16 cho thấy số lượng loài phát phong phú Trong số 44 chủng thuộc lớp Hymenomycetes nghiên cứu, phân loại 21 loài, loài thuộc loài biết (23,8 %), cịn 16 lồi thuộc lồi (76,4%) Riêng chi Kockovaella có lồi số chủng nghiên cứu Có lồi đặt tên Bullera cuulongensis, B nhoquanica, B haininhensis, B ninhbinhensis, B hoabinhensis, Kockovaella litseae, K cucphuongensis, K vietnamensis, K calophilli cơng bố, số cịn lại công bố thời gian tới Bảng 3.16 Số lượng loài nấm men sinh bào tử bắn thuộc lớp Hymenomycetes phân lập Vườn Quốc gia Cúc Phương TT 10 11 Loài Bullera mrakii Bullera sp 1* Bullera sp 2* Bullera sp 3* B cuulongensis** B.pseudoschimicola B nhoquanica** B haininhensis** B ninhbinhensis** B oryzae B sinensis *Loài cơng bố thời gian tới **Lồi công bố luận án 3.4 HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG NẤM MEN SINH BÀO TỬ BẮN THUỘC CHI BULLERA 3.4.1 Khả sinh enzym ngoại bào Ba mươi chín chủng nấm men sinh bào tử bắn nuôi môi trường YM dịch thể, pH 6, máy lắc 220 vòng/phút, 20 C ngày Ly tâm thu dịch trong, nhỏ vào lỗ khoan môi trường chứa chất (Tinh bột, CMC, cazein, kitin, Tween 80), đặt tủ ấm 30 C Sau 24 giờ, xác định vịng phân giải chất Kết ghi hình 3.9 cho thấy khả phân giải chất 39 chủng nấm men khác Trên chất tinh bột kitin, số chủng có hoạt tính enzym mạnh chiếm 15%, tỷ lệ lớn nấm men chủ yếu sử dụng đường cho sinh trưởng, khả sinh enzym ngoại bào Với chất CMC, số chủng có hoạt tính enzym mạnh chiếm 8% Trong Tween 80 cazein, số lượng chủng không sinh enzym phân giải chất chiếm 13 33 %, khơng có chủng có hoạt tính enzym mạnh Đa số chủng có hoạt tính enzym trung bình, đường kính vòng phân giải chất 10 Amylaza