Xác định tỉ lệ nhiễm và một số đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng clostridium difficile mang gen độc tố phân lập được từ bệnh nhân tiêu chảy

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐẶNG THỊ THÙY DƢƠNG XÁC ĐỊNH TỈ LỆ NHIỄM VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA CÁC CHỦNG Clostridium difficile MANG GEN ĐỘC TỐ PHÂN LẬP ĐƢỢC TỪ BỆNH NHÂN TIÊU CHẢY SAU DÙNG KHÁNG SINH TẠI BỐN BỆNH VIỆN Ở HÀ NỘI (2013 - 2015) LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐẶNG THỊ THÙY DƢƠNG XÁC ĐỊNH TỈ LỆ NHIỄM VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA CÁC CHỦNG Clostridium difficile MANG GEN ĐỘC TỐ PHÂN LẬP ĐƢỢC TỪ BỆNH NHÂN TIÊU CHẢY SAU DÙNG KHÁNG SINH TẠI BỐN BỆNH VIỆN Ở HÀ NỘI (2013 – 2015) CHUYÊN NGÀNH : VI SINH VẬT HỌC MÃ SỐ : 62420107 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS TS BÙI THỊ VIỆT HÀ TS VŨ THỊ THU HƢỜNG HÀ NỘI - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi đƣợc thực dƣới hƣớng dẫn tập thể cán hƣớng dẫn Các số liệu luận án phần kết đề tài: “Nghiên cứu vai trò gây bệnh đặc điểm dịch tễ học phân tử vi khuẩn kỵ khí hiếu khí gây hội chứng tiêu chảy liên quan đến kháng sinh số bệnh viện Hà Nội” Quỹ Phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia – NAFOSTED tài trợ, mã số đề tài 106.03-2012.65, TS Vũ Thị Thu Hƣờng chủ nhiệm đề tài mà thành viên Các kết luận án trung thực chƣa đƣợc khác công bố Nghiên cứu sinh Đặng Thị Thùy Dƣơng LỜI CẢM ƠN Luận án khơng thể hồn thành thiếu hƣớng dẫn, hỗ trợ, động viên nhiều cá nhân quan: Lời tơi xin bày tỏ kính trọng lịng biết ơn sâu sắc tới tập thể Cán hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Bùi Thị Việt Hà, Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học khoa học Tự nhiên, truyền thụ cho kiến thức chuyên ngành Vi sinh vật học, tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập, tận tình sửa chữa luận án, đặc biệt động viên cho học quý giá giải khó khăn trở ngại học tập nhƣ sống; TS Vũ Thị Thu Hường, Trƣởng phịng Vi khuẩn Kỵ khí, Khoa Vi khuẩn, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng, chủ nhiệm đề tài “Nghiên cứu vai trò gây bệnh đặc điểm dịch tễ học phân tử vi khuẩn kỵ khí hiếu khí gây hội chứng tiêu chảy sau dùng kháng sinh số bệnh viện Hà Nội” với mã số đề tài 106.03-2012.65 Quỹ Phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia tài trợ, cho phép tham gia đề tài, đƣợc sử dụng phần số liệu đề tài vào luận án, tận tình hƣớng dẫn bảo để nắm vững thao tác kỹ thuật nhƣ kiến thức chuyên sâu đối tƣợng nghiên cứu, tận tình giúp tơi sửa chữa hồn thiện luận án, cô dẫn dắt bảo trở thành nhà nghiên cứu khoa học Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại học Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình học tập Tơi xin trân trọng cảm ơn Đảng ủy, Hội đồng Trường, Ban Giám hiệu, Labo XNATVSTP, đặc biệt TTND PGS TS Vũ Đình Chính, TS Đinh Thị Diệu Hằng Trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương tạo điều kiện tốt cho tơi học hồn thành luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương tạo điều kiện cho tơi q trình tơi làm nghiên cứu đề tài Viện Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Tăng Thị Nga, CN Lê Thị Trang, CN Phạm Thị Hồng Thủy, BS Phùng Thu Hằng giúp đỡ việc thu thập mẫu, thực kỹ thuật thời gian làm việc phịng Vi khuẩn Kỵ khí Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Bộ môn Vi sinh vật học, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội bạn đồng nghiệp trường ĐH Kỹ thuật Y tế Hải Dương nhiệt tình giúp đỡ, ủng hộ, động viên suốt trình học tập Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến Bố, Mẹ, Chồng, con, người thân yêu động viên hỗ trợ nhiều thời gian, vật chất tinh thần để vƣợt qua khó khăn q trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng năm 2018 ĐẶNG THỊ THÙY DƢƠNG MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH .7 DANH MỤC BẢNG ……………………………………………………………… MỞ ĐẦU 10 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 10 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 11 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 11 3.1 Ý nghĩa khoa học 11 3.2 Ý nghĩa thực tiễn 12 PHẠM VI NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN 12 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 13 CHƢƠNG TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 14 1.1 TIÊU CHẢY SAU DÙNG KHÁNG SINH 14 1.1.1 Định nghĩa 14 1.1.2 Các tác nhân gây tiêu chảy sau dùng kháng sinh .14 1.2 VI KHUẨN Clostridium difficile 16 1.2.1 Đặc điểm sinh học 16 1.2.1.1 Lịch sử 16 1.2.1.2 Hình thể 16 1.2.1.3 Nuôi cấy 16 1.2.1.4 Tính chất sinh hóa 18 1.2.1.5 Sức đề kháng 18 1.2.2 Độc tố C difficile 18 1.2.2.1 Độc tố TcdA TcdB 18 1.2.2.2 Độc tố kép CDT 23 1.2.3 Cơ chế gây bệnh 23 1.2.4 Các bệnh C difficile gây 24 1.2.5 Các yếu tố nguy nhiễm trùng C difficile 26 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƢỚC 27 1.3.1 Trên giới 27 1.3.1.1 Tình hình nhiễm trùng C difficile 27 1.3.1.2 Dịch tễ học phân tử chủng C difficile gây bệnh 29 1.3.2 Trong nƣớc 31 1.4 CÁC PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN NHIỄM TRÙNG DO Clostridium difficile 34 1.4.1 Phƣơng pháp nuôi cấy phân lập C difficile sinh độc tố 35 1.4.1.1 Nuôi cấy phân lập C difficile từ bệnh phẩm 35 1.4.1.2 Xác định chủng vi khuẩn C difficile sinh độc tố 37 1.4.1.3 Ƣu, nhƣợc điểm 37 1.4.2 Phƣơng pháp khuếch đại gen phát gen độc tố trực tiếp từ mẫu phân 38 1.4.2.1 Các gen đích 38 1.4.2.2 Các phƣơng pháp khuếch đại gen 38 1.4.2.3 Ƣu nhƣợc điểm phƣơng pháp khuếch đại gen 40 1.4.3 Các phƣơng pháp khác 40 1.4.3.1 Trung hòa độc tố tế bào (CCCNA – cell culture cytotoxicity neutralization assay) 40 1.4.3.2 Phƣơng pháp miễn dịch hấp phụ enzym (EIAs ELISA) 41 1.5 CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI PHÂN TỬ CÁC CHỦNG Clostridium difficile MANG GEN ĐỘC TỐ 42 1.5.1 Phƣơng pháp PCR ribotyping 42 1.5.2 Phƣơng pháp giải trình tự gen slpA 43 1.5.3 Các phƣơng pháp khác 44 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 47 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 47 2.2 CỠ MẪU, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 47 2.3 THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU 48 2.4 CÁC BIẾN SỐ NGHIÊN CỨU 48 2.4.1 Mẫu bệnh phẩm 48 2.4.2 Thông tin bệnh nhân 49 2.5 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 50 2.5.1 Chủng vi khuẩn 50 2.5.2 Sinh phẩm 51 2.5.3 Môi trƣờng nuôi cấy 52 2.5.4 Thiết bị, dụng cụ 53 2.6 NỘI DUNG VÀ CÁC KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU .54 2.6.1 Đánh giá hiệu xác định giới hạn phát môi trƣờng CCMA 54 2.6.2 Nuôi cấy phân lập C difficile mang gen độc tố 56 2.6.2.1 Nuôi cấy phân lập C difficile từ mẫu phân 56 2.6.2 Xác định chủng vi khuẩn C difficile phân loại độc tố 57 2.6.3 Phƣơng pháp nested PCR 59 2.6.4 Phƣơng pháp PCR ribotyping 60 2.6.5 Phƣơng pháp giải trình tự gen slpA 62 2.7 ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 64 2.8 PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ VÀ PHÂN TÍCH SỐ LIỆU 65 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 66 3.1 TỈ LỆ NHIỄM C difficile MANG GEN ĐỘC TỐ Ở BỆNH NHÂN TIÊU CHẢY SAU DÙNG KHÁNG SINH 66 3.1.1 Kết đánh giá hiệu xác định giới hạn phát môi trƣờng CCMA 66 3.1.1.1 Tính suất 66 3.1.1.2 Tính chọn lọc 66 3.1.1.3 Giới hạn phát môi trƣờng CCMA 67 3.1.2 So sánh phƣơng pháp nested PCR với phƣơng pháp nuôi cấy C difficile mang gen độc tố 70 3.1.3 Tỉ lệ nhiễm C difficile mang gen độc tố bệnh nhân tiêu chảy sau dùng kháng sinh 75 3.1.3.1 Tỉ lệ nhiễm C difficile mang gen độc tố (C difficile MGĐT) 75 3.1.3.2 Tỉ lệ nhiễm C difficile MGĐT theo kiểu độc tố 79 3.1.3.3 Tỉ lệ nhiễm C difficile MGĐT theo đặc điểm nhân học 83 3.1.3.4 Tỉ lệ nhiễm C difficile MGĐT theo tiền sử sử dụng kháng sinh .89 3.1.3.5 Tỉ lệ nhiễm C difficile MGĐT theo tiền sử bệnh lý kèm theo 95 3.1.3.6 Tỉ lệ nhiễm C difficile MGĐT theo khoa bệnh viện 97 3.2 ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA CÁC CHỦNG Clostridium difficile MANG GEN ĐỘC TỐ 99 3.2.1 Đặc điểm dịch tễ học phân tử C difficile MGĐT theo phƣơng pháp phân loại PCR ribotyping 99 3.2.1.1 Kết phân loại 99 3.2.1.2 Sự phân bố ribotype 102 3.2.1.3 Sự phân bố ribotype C difficile lƣu hành bệnh viện Hà Nội so với số nƣớc giới 107 3.2.2 Đặc điểm dịch tễ học phân tử chủng C difficile MGĐT theo phƣơng pháp giải trình tự gen slpA 109 3.2.2.1 Kết phân loại 109 3.2.2.2 Mối quan hệ di truyền gen slpA chủng nghiên cứu chủng giới .113 KẾT LUẬN 119 KIẾN NGHỊ .120 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 121 TÀI LIỆU THAM KHẢO 122 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Axit DeoxyRibonucleic ARN Axit Ribonucleic bp Base pair BHI Brain heart Infusion (Canh thang não tim) CCMA Cyclocerine – Cefoxitin – Manitol – Agar CCFA Cyclocerine – Cefoxitin – Fructose – Agar CCMB Cyclocerine – Cefoxitin – Manitol – Broth CDC Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm phịng ngừa kiểm sốt bệnh, Mỹ) CFU Colony form unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc) CI Confidence Interval (khoảng tin cậy) C difficile MGĐT C difficile mang gen độc tố Elisa Enzym linked – immusorbent assay (Thử nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn enzym) GAM-HT GAM – Horse Taurocholate kb Kilobase kDa Kilodalton MIC Minimal Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu) MLVA Multilocus Variable-number tandem-repeat Analysis (Phân tích trình tự lặp lại ngẫu nhiên) MLST Multilocus sequence typing (Phân tích trình tự đa locus) MRSA Methicillin Resistant Staphylococcus aureus OR Odd Ratio (tỉ suất chênh) PCR Polymerase Chain Reaction PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis (Điện di xung trƣờng) pg Picrogam REA Endonuclease Restriction Analysis (Phân tích đoạn nhờ enzym giới hạn) SHEA/IDSA Society for Healthcare Epidemiology of America and the Infectious Diseases Society of America (Hiệp hội nghiên cứu dịch tễ học Mỹ/ bệnh truyền nhiễm Mỹ) slpAST slpA Sequence Typing (Phƣơng pháp phân loại giải trình tự gen slpA) UK United Kingdom (Vƣơng quốc liên hợp Anh Bắc Ireland) US United States (Hợp chủng quốc Hoa Kỳ) 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 Tổng 3.2 Kết giải trình tự gen từ sản phẩm nested PCR Mẫu 1415 Mẫu 1483 3.3 Kết phân loại phân tử 65 chủng C difficile sinh độc tố Mã số 312 322 446 1056 1152 1184 1198 1296 1314 1351 1361 1385 1386 1476 1484 1523 21056 21476 90 308 311 329 409 443 460 1011 1137 1147 1150 1393 1515 1547 1311 1550 319 421 440 1005 1010 1020 1098 1102 1233 1592 17 340 370 375 504 1144 1149 1202 1214 1278 1431 1536 1555 1579 1235 1091 1095 1432 1269 Xác nhận chủ nhiệm đề tài TS Vũ Thị Thu Hƣờng PHỤ LỤC Danh sách kết phân tích Ribotype chủng gửi sang Nhật Bản TT Mã số chủng 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Xác nhận chủ nhiệm đề tài TS Vũ Thị Thu Hƣờng PHỤ LỤC Kết hàng trình tự nucleotit gen slpA 10 chủng đại diện cho 10 phân nhóm slpAST Mã chủng 312 1361 1550 1536 421 1235 17 1432 1269 1592 312 1361 1550 1536 421 1235 17 1432 1269 1592 312 1361 1550 1536 421 1235 17 1432 1269 1592 Phân nhóm 312 1361 1550 1536 421 1235 17 1432 1269 1592 312 1361 1550 1536 421 1235 17 1432 1269 1592 312 1361 1550 1536 421 1235 17 1432 1269 1592 312 1361 1550 1536 421 1235 17 1432 1269 1592 312 1361 1550 1536 421 1235 17 1432 1269 1592 312 1361 1550 1536 421 1235 17 1432 1269 1592 312 1361 1550 1536 421 1235 17 1432 1269 1592 312 1361 1550 1536 421 1235 17 1432 1269 1592 312 1361 1550 1536 421 1235 17 1432 1269 1592 312 1361 1550 1536 421 1235 17 1432 1269 1592 312 1361 1550 1536 421 1235 17 1432 1269 1592 312 1361 1550 1536 421 1235 17 1432 1269 1592 312 1361 1550 1536 421 1235 17 1432 1269 1592 312 1361 1550 1536 421 1235 17 1432 1269 1592 312 1361 1550 1536 421 1235 17 1432 1269 1592 312 1361 1550 1536 421 1235 17 1432 1269 1592 312 1361 1550 1536 421 1235 17 1432 1269 1592 312 1361 1550 1536 421 1235 17 1432 1269 1592 312 1361 1550 1536 421 1235 17 1432 1269 1592 312 1361 1550 1536 421 1235 17 1432 1269 1592 312 1361 1550 1536 421 1235 17 1432 1269 1592 Chú thích: Nucleotit đƣợc khoanh trịn nucleotit khác so với phân nhóm cịn lại nhóm ... HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐẶNG THỊ THÙY DƢƠNG XÁC ĐỊNH TỈ LỆ NHIỄM VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA CÁC CHỦNG Clostridium difficile MANG GEN ĐỘC TỐ PHÂN LẬP... nƣớc ta 2) Phân tích đƣợc số đặc điểm dịch tễ học phân tử chủng C difficile mang gen độc tố Để thực mục tiêu này, chủng C difficile mang gen độc tố phân lập từ phân đƣợc phân loại phân tử hai phƣơng... TÀI 1) Xác định đƣợc tỉ lệ nhiễm Clostridium difficile mang gen độc tố bệnh nhân tiêu chảy sau dùng kháng sinh bốn bệnh viện Hà Nội 2) Phân tích đƣợc số đặc điểm dịch tễ học phân tử chủng Clostridium