Nghiên cứu, thu nhận protein từ sinh khối rong nước lợ (chaetomorpha sp ) để ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm tt

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Bạch Ngọc Minh NGHIÊN CỨU, THU NHẬN PROTEIN TỪ SINH KHỐI RONG NƯỚC LỢ (Chaetomorpha sp.) ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã sỗ: 42 02 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC Tp Hồ Chí Minh – 2020 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS Hoàng Kim Anh Người hướng dẫn khoa học 2: PGS.TSKH Ngô Kế Sương Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: … Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 201… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Hiện số loài rong (như Chaetomorpha sp.,) mọc tự nhiên khắp ao hồ nuôi tôm nước lợ vùng đồng sông Cửu Long Sau thu hoạch tôm, rong bị vớt khỏi ao để thành đống, vừa lãng phí vừa gây nhiễm môi trường Nhiều nghiên cứu cho thấy, thành phần rong có giá trị cao mặt dinh dưỡng Việc nghiên cứu thu nhận sản phẩm có giá trị từ rong tận dụng nguyên liệu sẵn có để tạo giá trị gia tăng đồng thời giải vấn đề ô nhiễm môi trường địa phương Đặc biệt, protein rong có thành phần acid amin cân đối hàm lượng acid amin thiết yếu cao Các loại protein thực vật có nhiều tính chất chức tốt khiến chúng sử dụng rộng rãi sản phẩm thực phẩm chế biến Ngoài ra, số loại protein từ rong thể tính chất sinh học khả kháng khuẩn, kháng oxy hóa Nghiên cứu thu nhận protein từ rong mở hội sử dụng nguồn đạm thực vật để thay nguồn đạm từ động vật thực phẩm Mục tiêu nghiên cứu đề tài Nghiên cứu trình thu nhận protein concentrate từ sinh khối rong Chaetomorpha sp Khảo sát tính chất sinh học, tính chất chức giá trị dinh dưỡng protein concentrate từ rong để ứng dụng vào thực phẩm Tính ý nghĩa đề tài Đề tài tập trung nghiên cứu thu nhận chế phẩm protein concentrate từ rong Chaetomorpha sp., nguồn nguyên liệu chưa khai thác nước giới Trong nghiên cứu sử dụng kỹ thuật siêu âm kết hợp với loại cellulase để thủy phân thành tế bào rong nhằm tăng cường khả trích ly protein Khác với loại cellulase thơng thường (có pH tối ưu vùng acid), enzyme cellulase hoạt động tốt vùng pH từ 6,5-7,5 nên thích hợp sử dụng để hỗ trợ trích ly protein từ sinh khối rong nhóm protein tan tốt mơi trường trung tính kiềm nhẹ Ngồi ra, đề tài có ý nghĩa khoa học cung cấp thơng tin hồn tồn có hệ thống nhóm protein rong Chaetomorpha sp thành phần acid amin, phân đoạn protein kích thước phân tử nhóm protein tan nước tan kiềm; đặc điểm hình thái, khả kháng khuẩn, kháng oxy hóa, tính chất chức năng, khả tiêu hóa điều kiện in vitro in vivo chế chế phẩm protein concentrate từ rong Chaetomorpha sp Các nội dung nghiên cứu luận án - Khảo sát q trình trích ly tinh protein để thu chế phẩm protein tan nước tan kiềm từ rong Chaetomorpha sp - Xác định thành phần acid amin, hình thái cấu trúc, tính chất chức năng, hoạt tính sinh học giá trị dinh dưỡng protein concentrate từ rong CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Rong lục Chaetomorpha sp Rong lục thuộc chi Chaetomorpha thể đa bào tạo thành tế bào hình trụ, đặc trưng sợi không phân nhánh Ngành : Chlorophyta Lớp : Ulvophyceae Bộ : Cladophorales Họ : Cladophoraceae Chi : Chaetomorpha Có khoảng 50 lồi Chaetomorpha cơng nhận dựa số đặc điểm hình thái, chẳng hạn hình thức tăng trưởng, kích thước tế bào hình dạng tế bào đính kèm (Leliaert, Frederik cộng 2011) 1.2 Protein từ rong Hàm lượng protein rong có khác tùy theo lồi Kết khảo sát Kumar (2010) 18 loài rong biển khác thuộc ngành Chlorophyta, Phaeophyta, Rhodophyta Ấn Độ cho thấy hàm lượng protein thay đổi từ 10 – 35% Hàm lượng protein rong bị ảnh hưởng chu kỳ mùa năm Theo Fleurence (1999), hàm lượng protein rong P palmate dao động từ – 25% theo mùa với lượng protein cao thu tháng mùa xuân mùa đông Đối với rong lục Ulva lactuca, tháng thu nhận protein cao tháng tám với 32,7% protein trọng lượng khô (Fattah Sarry,1987) Protein từ rong có đầy đủ thành phần acid amin thiết yếu với tỷ lệ cân đối nhiều so với loại protein từ thực vật cạn Protein từ rong giàu acid aspartic acid glutamic Đáng ý lysine biết đến với nồng độ tương đối thấp nguồn protein thực vật lại dồi trong rong Chính thế, protein từ rong sử dụng nguồn dinh dưỡng có giá trị chế độ ăn uống người Các loại protein có giá trị thu nhận từ rong bao gồm lectin phycobiliprotein Bên cạnh đó, chế phẩm protein concentrate protein isolate từ rong có triển vọng sử dụng thực phẩm để thay cho protein động vật có khả làm giảm nguy bệnh tim mạch (Lammi cộng sự, 2019) 1.3 Thu nhận protein từ rong Tác nhân chủ yếu sử dụng để trích ly protein từ rong dung mơi kiềm Tuy nhiên, việc trích ly protein bị hạn chế polysaccharides thành tế bào Phương án thường lựa chọn sử dụng hệ enzyme thủy phân thành tế bào Fleurence cộng (1995) nghiên cứu sử dụng enzyme khác loài rong đỏ, kết hoạt động carrageenase cellulase giúp hiệu thu nhận protein tăng 10 lần Ngoài sử dụng sóng siêu âm để trích ly thành phần protein, carbohydrate… từ rong nghiên cứu nhiều Trong số phương pháp trích ly nay, kể đến phương pháp SFE sử dụng CO2 siêu tới hạn phương pháp PLE sử dụng dung môi lỏng điều kiện nhiệt độ áp suất cao để tách chất có khả kháng khuẩn, kháng ung thư kháng oxi hóa từ rong S.pallidum H.elongate (Fitzgeral 2011) Sau nhận dịch chiết protein thô, nhiều phương pháp khác sử dụng để tinh protein Trong nhóm phương pháp truyền thống có phương pháp kết tủa tác nhân dung mơi hữu cơ, muối trung tính, kết tủa điểm đẳng điện Protein sau tiếp tục tinh phương pháp đại thẩm tích, lọc màng, sắc kí lọc gel, sắc kí trao đổi ion, sắc kí lực… để thu sản phẩm có độ tinh cao 1.4 Các tính chất chế phẩm protein concentrate Chế phẩm protein concentrate đánh giá thông qua tiêu: thành phần hàm lượng acid amin, hình thái cấu trúc, tính chất chức giá trị dinh dưỡng để sử dụng cơng nghiệp thực phẩm Bên cạnh đó, số tính chất sinh học đặc biệt chế phẩm protein xác định nhằm đánh giá triển vọng ứng dụng nguồn protein lĩnh vực khác CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu nghiên cứu Rong Chaetomorpha sp thu nhận sau 15 – 20 ngày phát triển, thu ao nuôi tôm quảng canh huyện Giá Rai, Bạc Liêu Rong vận chuyển thùng xốp ngày đến phịng thí nghiệm Rong rửa để loại tạp chất, sau phơi khơ, xay nhỏ sấy tới độ ẩm 5%, bảo quản bình hút ẩm nhiệt độ phịng Enzyme Cellulase hãng Genecor (Mỹ), tên thương mại Crestone Conc có khả hoạt động tốt vùng pH trung tính từ 6,0 – 7,5, nhiệt độ từ 450C – 550C; có hoạt tính 1.100 UI/ml 2.2 Sơ đồ nghiên cứu Sơ đồ nghiên cứu thể hình 2.2 2.3 Bố trí thí nghiệm 2.3.1 Xác định nhóm protein rong Phương pháp Hu Esen (1981) sử dụng để xác định nhóm protein rong dựa vào khả hòa tan chúng dung môi khác 2.3.2 Khảo sát ảnh hưởng trình xử lý nguyên liệu đến hiệu suất trích ly protein Các yếu tố nghiên cứu trình xử lý nguyên liệu gồm ảnh hưởng nhiệt độ sấy rong (40-1050C) kích thước xay rong (0,25-1mm) Rong nguyên liệu Khảo sát trình xử lý nguyên liệu Sấy, xay nhỏ Enzyme Trích ly Khảo sát tối ưu hóa q trình trích ly nhóm protein tan nước Dịch trích protein Bã Dung mơi kiềm Trích ly Khảo sát tối ưu hóa q trình trích ly nhóm protein tan kiềm Dịch trích protein Khảo sát điều kiện kết tủa protein Tủa protein Thẩm tích loại muối Sấy đơng khơ PC tan nước tan kiềm Hình thái, cấu trúc Tính chất chức Tính chất sinh học Giá trị dinh dưỡng Hình 2.2 Sơ đồ quy trình thu nhận protein concentrate từ rong Chaetomorpha sp 2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến q trình tríc-h ly nhóm protein tan nước có hỗ trợ enzyme Các yếu tố khảo sát loại dung dịch đệm (sử dụng làm dung môi trích ly), pH (5,0-8,0), tỷ lệ nguyên liệu dung môi (1:5 đến 1:30), nồng độ enzyme (50-150 UI/g), thời gian (1-8 giờ) nhiệt độ trích ly (300C đến 700C) Hàm mục tiêu hiệu suất trích ly protein Phycocyanin Tối ưu hóa q trình trích ly: sử dụng mơ hình quy hoạch thực nghiệm bậc với hỗ trợ phần mềm Modde 5.0 2.3.4 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến trình trích ly nhóm protein tan kiềm Các yếu tố khảo sát gồm tỷ lệ dung môi nguyên liệu (1:10 đến 1:30), nồng độ dung môi (0,5-1,5%), nhiệt độ (300C-700C) thời gian trích ly (30-90 phút) Hàm mục tiêu hiệu suất trích ly nhóm protein tan kiềm Q trình trích ly protein tan kiềm tối ưu hóa sử dụng mơ hình quy hoạch thực nghiệm bậc với hỗ trợ phần mềm Modde 5.0 2.3.5 Nghiên cứu trình tinh protein Khảo sát trình kết tủa protein phương pháp khác nhau: kết tủa đẳng điện HCl, kết tủa dung môi ethanol, kết tủa muối amoni sulphate nâng cao độ tinh phương pháp thẩm tích Hàm mục tiêu hiệu suất thu sản phẩm hàm lượng protein chế phẩm protein 2.3.6 Nghiên cứu đặc điểm hình thái cấu trúc chế phẩm protein từ rong Protein tách phân đoạn sắc ký lọc gel, sử dụng cột 50x1,5 cm hạt Biogel P100 có kích thước 100 – 200 mesh (10 – 40µm) Các phân đoạn protein thu sau trình sắc ký xác định kích thước phân tử Chế phẩm protein concentrate sử dụng để xác định thành phần acid amin quan sát hình thái kính hiển vi điện tử 2.3.7 Xác định tính chất sinh học chế phẩm protein concentrate Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn chủng vi khuẩn gây bệnh cho người là: S aureus, E coli, P aeruginosa Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hoá dựa chế: bắt gốc tự DPPH, bắt gốc tự ABTS•+, tương tác với ion Fe2+ ức chế q trình peroxy hóa lipid màng tế bào 2.3.8 Xác định tính chất chức chế phẩm protein Xác định tính chất chức chế phẩm protein concentrate từ rong bao gồm: khả tạo bọt độ ổn định bọt; khả tạo gel; khả hòa tan; khả hấp thu nước; khả tạo nhũ So sánh với chế phẩm protein concentrate từ đậu nành 2.3.9 Đánh giá giá trị dinh dưỡng điều kiện in vitro Xác định tiêu sau chế phẩm protein concentrate: - Khả tiêu hóa (IVPD) - Chỉ số điểm acid amin (AAS) - Chỉ số tiêu hoá protein dựa theo acid amin (PDCAAS) 2.3.10 Đánh giá giá trị dinh dưỡng điều kiện in vivo Mơ hình in vivo thực đối tượng chuột bạch, với nhóm có chế độ ăn riêng biệt - Nhóm 1: Chế độ ăn khơng chứa protein - Nhóm 2: Chế độ ăn thường (thức ăn Viện Pasteur cung cấp) - Nhóm 3: Chế độ ăn AIN 93 có chứa protein APC - Nhóm 4: Chế độ ăn AIN 93 có chứa protein từ đậu nành Các tiêu đánh giá: Hệ số tăng trọng (PER), Tỷ lệ hấp thu protein tịnh (NPR) giá trị sinh học protein (BV) 2.4 Phương pháp phân tích 12 90 phút Hàm lượng protein hịa tan dự đốn theo phương trình hồi quy thu thực nghiệm 38,921 37,651 mg/g rong khô, khác biệt 3,27% 3.4 Khảo sát q trình trích ly nhóm protein tan kiềm dung môi NaOH Các kết khảo sát đơn yếu tố cho thấy, thông số kỹ thuật phù hợp q trình trích ly nhóm protein tan kiềm bao gồm tỷ lệ chất dung môi (1:20), nồng độ NaOH 1%, thời gian nhiệt độ trích ly tương ứng 60 phút 500C Trên sở kết này, trình tối ưu hóa thực theo mơ hình trực giao cấp có tâm xốy với thí nghiệm tâm Các yếu tố có ảnh hưởng lớn tới q trình trích ly lựa chọn làm thơng số biến đổi thời gian trích ly (X4) nồng độ NaOH (X5) Phương trình hồi quy mơ tả hàm lượng protein hịa tan thu dịch trích sau: Y2 = 65,180 + 6,321 X4 + 10,224 X5 – 5,509 X4 X5 – 8,259 X52 Kết cho thấy nồng độ NaOH thời gian trích ly thể ảnh hưởng tương hỗ đến hàm lượng protein Khi sử dụng nồng độ NaOH thấp cần nhiều thời gian để q trình trích ly đạt hiệu suất tối ưu Ngược lại sử dụng NaOH nồng độ cao, q trình trích ly nhanh chóng đạt tới trạng thái cân việc kéo dài thời gian khơng làm tăng đáng kể hiệu suất trích ly Hàm lượng protein hồ tan dự đốn đạt cao 68,651 mg/g rong khô nồng độ NaOH 1,2% thời gian trích ly 72 phút, khác biệt 0,8% so với kết thực nghiệm Đánh giá hiệu trích ly protein phương pháp 13 Trong thí nghiệm này, bể siêu âm Elma có tần số sóng 35kHz sử dụng kết hợp với cellulase để tăng hiệu thủy phân thành tế bào Cấu trúc tinh thể phức tạp cellulose khiến bền Hình 3.5 Hiệu trích ly nhóm protein tan nước tan kiềm phương với tác động thủy phân pháp khác Khi sử dụng kết hợp với cellulase, sóng siêu âm giúp phá vỡ cấu trúc tinh thể cellulose, tạo điều kiện để enzyme tiếp cận tốt với chất để thủy phân thành tế bào rong cách hiệu Chính vậy, sử dụng kết hợp siêu âm enzyme giúp tăng hiệu suất trích ly protein từ sinh khối rong cách rõ rệt so với đối chứng (67,9 so với 43,34 mg/g rong khơ) Hình thái cấu trúc rong nguyên liệu bã rong sau trích ly nghiên cứu kính hiển vi điện tử quét (SEM) a b Hình 3.7 Hình ảnh kính hiển vi điện tử qt (độ phóng đại 250x, thang đo 50µm) bã rong Chaetomorpha sp sau trích ly protein (a) Khơng sử dụng siêu âm enzyme (b) Có sử dụng siêu âm enzyme Khi khơng có biện pháp hỗ trợ, thành tế bào rong bị phá vỡ không hiệu quả, nên nhiều tế bào nguyên thành phần nội bào chưa trích ly (Hình 3.7a) Ngược lại, với hỗ trợ siêu âm 14 enzyme, tất tế bào rong teo lại giải phóng triệt để thành phần nội bào (Hình 3.7b) 3.5 Nghiên cứu trình tinh protein Quá trình kết tủa đẳng điện kết tủa dung môi ethanol cho hiệu suất thu protein không cao, độ tinh kết tủa protein < 50% Khi sử dụng muối (NH4)2SO4 bão hòa 70%, hiệu suất tủa độ tinh nhóm protein tan nước đạt tương ứng 62,86% 58,77%, nhóm protein tan kiềm đạt tương ứng 65,29% 62,29% Mẫu đem thẩm tích màng bán thấm cellophane có kích thước lỗ 14kDa để loại bỏ muối, hiệu suất thu hồi nhóm protein tan nước tan kiềm tương ứng 70,81%, 71,08%; độ tinh tương ứng 72,80% 75,50% 3.6 Xác định tính chất chế phẩm protein concentrate 3.6.1 Thành phần sinh hoá chế phẩm protein concentrate Để thu nhận chế phẩm protein concentrate, chúng tơi tiến hành trích ly hai phân đoạn protein tan nước tan kiềm, sau kết tủa muối ammonium thẩm tích loại muối theo điều kiện tối ưu Chế phẩm protein sau sấy đông khô đến độ ẩm 10% w/w Hàm lượng protein hai chế phẩm APC-N APC-K 72,8% 76,3% 3.6.2 Thành phần acid amin protein rong Bảng 3.17 Thành phần acid amin chế phẩm protein Acid amin Hàm lượng acid amin chế phẩm protein (g/100g protein) Chế phẩm APC-N Chế phẩm APC-K Aspatic acid 11,7 ± 0,2 11,5 ± 0,15 Glutamic acid 16,1 ± 0,09 15,7 ± 0,14 Serine 5,3 ± 0,03 5,1 ± 0,1 Histidine 1,4 ± 0,07 1,7 ± 0,25 15 Arginine 5,3 ± 0,15 6,2 ± 0,1 Glycine 4,9 ± 0,18 4,9 ± 0,12 Threonine 4,1 ± 0,16 5,1 ± 0,23 Alanine 7,3 ± 0,11 7,8 ± 0,09 Tyrosine 4,5 ± 0,09 4,1 ± 0,06 Methionine 3,6 ± 0,15 3,5 ± 0,15 Valine 5,4 ± 0,18 6,5 ± 0,09 Phenylanine 5,9 ± 0,34 5,9 ± 0,18 Isoleucine 3,5 ± 0,15 4,6 ± 0,01 Leucine 8,3 ± 0,14 8,6 ± 0,09 Lysine 5,1 ± 0,18 5,6 ± 0,07 Cystine 3,0 ± 0,05 1,8 ± 0,09 Proline 4,6 ± 0,09 1,4 ± 0,05 Hàm lượng acid amin thiết yếu protein Chaetomorpha sp chiếm tỷ lệ cao, tổng hàm lượng acid amin không thay chế phẩm protein APC-N APC-K chiếm tương ứng 37,3% 41,5% so với tổng lượng protein Hàm lượng acid amin methionine, lysine threonine chế phẩm protein từ rong cao so với protein có nguồn gốc thực vật 3.6.3 Hình thái cấu trúc chế phẩm protein concentrate Hình 3.9 cho thấy cấu trúc chế phẩm protein concentrate có dạng Chế phẩm protein tan nước APC-N có cấu trúc phẳng lớn, chế phẩm protein tan kiềm APC-K có cấu trúc dạng nhỏ hơn, bề mặt gồ ghề xốp Thơng thường có cấu trúc nhỏ xốp có độ hồ tan cao Cấu trúc vi mô hai loại protein concentrate dùng để giải thích khả hồ tan chúng (Hu cộng sự, 2013) 16 a b c d Hình 3.9 Hình ảnh kính hiển vi điện tử quét protein concentrate độ phóng đại 500x, thang đo 50µm độ phóng đại 1000x, thang đo 10µm (a), (b) chế phẩm APC.N; (c), (d) chế phẩm APC.K 3.6.4 Xác định kích thước khối lượng phân tử phân đoạn protein Chế phẩm protein concentrate từ rong phân đoạn sắc ký lọc gel xác định kích thước phân tử điện di SDS-PAGE Các phân tử protein có cấu trúc phức tạp Cấu trúc khơng gian protein khả bị biến tính mơi trường chứa SDS ảnh hưởng đến khả di động protein Bên cạnh đó, protein cịn liên kết với thành phần phi protein khác khó để tách riêng protein khỏi thành phần điều kiện chạy điện di SDS-PAGE thông thường Sự ảnh hưởng hình dạng kích thước thành phần liên kết phi protein đến tính di động protein khó dự đốn Theo nhiều nghiên cứu, protein rong thường có chất glycoprotein Glycoprotein protein có chứa oligosaccharide/ polysaccharide liên kết cộng hóa trị với acid amin thích hợp Các glycoprotein có độ linh động điện di thấp trọng lượng phân tử cao, tạo tượng kéo thành dải gel điện di Hai mẫu protein tan nước tan kiềm gửi đến phịng thí nghiệm Sinh hố, trường ĐH Khoa học Tự Nhiên, ĐH Quốc 17 gia Tp.HCM để xác định kích thước phân tử phương pháp LCMS/MS, sử dụng kĩ thuật ion hoá mẫu tia lửa điện (ESI) xác định khối lượng phân tử QTOF Sắc ký đồ hai mẫu protein phân tích LC/MS/MS thể hình 3.15 hình 3.16 Kết phân tích khối phổ peak sau - Mẫu protein tan nước chứa mảnh protein có kích thước 11,4 kDa, 13,6 kDa, 15,4 kDa, 27,2 kDa 38,6 kDa (Hình 3.15) - Mẫu protein tan kiềm chứa mảnh protein có kích thước 11,4 kDa, 21,1 kDa, 27,2 kDa, 34,1 kDa 40,5 kDa 63,8 kDa (Hình 3.16) Hình 3.15 Kết phân tích MS mẫu APC-N Hình 3.16 Kết phân tích MS mẫu APC-K 3.7 Xác định tính chất sinh học protein 3.7.1 Thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật Những chủng vi khuẩn kiểm định gây bệnh người ATCC cung cấp: S.aureus, E.coli, P.aeruginosa Khi so sánh với đối chứng kháng sinh Kanamycin với nồng độ khuyến nghị 10µg/ml, hiệu kháng khuẩn protein concentrate từ rong tốt vi khuẩn S aureus P aeruginosa (Đường kính vịng kháng khuẩn vi khuẩn tương ứng mm 6,33 mm) Kháng sinh có hiệu kháng vi khuẩn E coli cao gấp đôi so với sử dụng protein concentrate từ rong Tuy nhiên, giá trị 18 MIC (nồng độ thấp chế phẩm thể hoạt tính kháng khuẩn) chế phẩm protein từ rong cao nhiều so với đối chứng kháng sinh Kanamycin Điều cho thấy, hoạt tính kháng khuẩn chế phẩm protein từ rong thấp, chưa đủ để đưa vào ứng dụng thực tế 3.7.2 Thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hố Khả chống oxi hoá hai chế phẩm Chaetomorpha protein concentrate thử nghiệm theo chế khác Ở nồng độ, chế phẩm APC.N có hoạt tính bắt gốc tự DPPH cao hẳn chế phẩm APC.K Ở nồng độ thử nghiệm 78,125 µg/ml tỉ lệ % hoạt tính bắt gốc tự DPPH hai mẫu chế phẩm APC.N APC.K 73,97% 22,22% Hoạt tính bắt gốc tự DPPH chế phẩm APC-K nồng độ thử nghiệm 312,55 µg/ml 55,18% Hoạt tính bắt gốc tự DPPH chế phẩm APC.N cao nhóm protein tan nước có chứa Phycocyanin nhóm protein có hoạt tính kháng oxi hố Ngồi ra, phân tử protein thu nhận từ rong chứa thành phần acid amin có khả kháng oxy hóa cysteine (chứa nhóm thiol), acid amin chứa nhóm phenolic tyrosin Với mục tiêu đánh giá khả ứng dụng chế phẩm APC-N thực phẩm chức giàu chất chống oxi hóa, APC-N tiếp tục sử dụng để nghiên cứu sâu khả chống oxi hoá chế khác Các thí nghiệm thực Phịng thí nghiệm Sinh hoá Trung tâm Sâm Dược liệu, ĐH Y Dược, Tp HCM Tóm lại thí nghiệm đánh giá khả kháng oxy hóa chế phẩm protein tan nước từ rong Chaetomorpha sp cho thấy, APC-N có khả kháng oxy hóa nhiều chế khác Chế phẩm APC-N protein concentrate với hàm lượng protein 72,8% w/w Ngoài protein tan nước phycocyanin, chế phẩm APC-N 19 chứa thành khác đóng góp vào hoạt tính kháng oxy hóa polysaccharide hịa tan, polyphenol thực vật, chlorophyll … Do cịn chứa tạp chất, nên hoạt tính kháng oxy hóa chế phẩm APC-N so với đối chứng hóa chất tinh khiết vitamin C, Na2EDTA Sigma thấp (thấp khoảng 5-20 lần) Tuy nhiên, thí nghiệm tế bào màng não chuột, APC-N lại thể khả ức chế peroxy hóa lipid màng tế bào tương tự Trolox tinh khiết (Calbiochem Ltd Co.) Nhìn chung, hoạt tính chống oxi hố chế phẩm APC-N theo thứ tự từ mạnh đến yếu dựa chế khả bắt gốc tự DPPH, ức chế peroxy hóa lipid màng tế bào, khả liên kết với ion Fe2+, khả trung hồ gốc tự ABTS•+ với giá trị IC50 tương ứng 19,11 µg/ml, 21,52 µg/ml, 31,46 µg/ml 52,24 µg/ml Khả kháng oxy hóa tốt nhiều chế khác nồng độ µg/ml cho thấy triển vọng ứng dụng chế phẩm APC-N để kháng oxy hóa thực phẩm chức 3.8 Xác định tính chất chức protein Độ hịa tan số quan trọng protein sử dụng cơng nghệ đồ uống Protein từ rong có khả hịa tan mơi trường trung tính kiềm, protein từ đậu nành tan tốt mơi trường acid, trung tính kiềm Chế phẩm APC-N có khả hịa tan cao chế phẩm APC-K (12,6 10,3% pH7), nguyên nhân tỉ lệ nhóm ưa nước bề mặt phân tử protein chế phẩm APC-N cao Khả hấp thu nước chế phẩm protein APC-K thấp (18,5%), thấp so với chế phẩm APC-N (57,8%) chế phẩm protein đậu nành (49,33%) Phân tử protein chế phẩm APC.N có vùng ưa nước trải rộng có cấu trúc xoắn cuộn để che giấu vùng kị nước bên Những vùng ưa nước nơi 20 hình thành liên kết hydro với phân tử nước xung quanh, giúp hấp thu nước lên đại phân tử protein Khả tạo gel có vai trị việc tạo tính chất kết cấu nhiều loại thực phẩm Gel làm tăng độ nhớt, độ bám dính, cải thiện liên kết nước dầu/chất béo Kết cho thấy hai chế phẩm protein APC-N APC-K từ rong Chaetomorpha sp có nồng độ tạo gel tối thiểu (LGC) 10%, thể khả tạo gel tốt so với protein đậu nành nhiều loại protein thực vật khác Chế phẩm APC-K có khả tạo bọt làm bền bọt tốt Chế phẩm protein APC-N protein concentrate từ đậu nành có khả tạo bọt tương đương với chế phẩm APC-K (40-43%) khả hòa tan tốt pH 7, thiếu nhóm acid amin kị nước tương tác tốt với bề mặt phân chia pha (giúp tạo lớp màng protein bao quanh bọt khí dai, bền) nên hệ bọt tạo có độ bền (75-78% so với 90%) Chế phẩm APC-K có khả tạo nhũ làm bền hệ nhũ cao Các nhóm kị nước chiếm tỷ lệ cao protein tan kiềm giúp chúng tương tác tốt với pha dầu giọt béo, đồng thời tỷ lệ acid amin aspartic acid, glutamic acid cao protein rong Chaetomorpha sp giúp tạo nên lực đẩy tĩnh điện giọt béo cải thiện khả làm bền hệ nhũ tương thực phẩm 3.9 Đánh giá giá trị dinh dưỡng điều kiện in vitro Nghiên cứu tìm hiểu giá trị dinh dưỡng điều kiện in vitro protein concentrate từ rong lục Chaetomorpha sp để đánh giá tiềm sử dụng chúng nguồn protein thực vật thực phẩm Với hàm lượng protein đạt 76,3% khả tiêu hóa IVDP 83,8%, chế phẩm APC-K có giá trị PDCAAS acid amin thiết yếu lớn ngoại trừ histidine Hàm lượng histidine chế phẩm APC- 21 K đáp ứng 95% nhu cầu người trưởng thành theo khuyến cáo WHO (2007) Chế phẩm APC-N có hàm lượng protein 72,8%, khả tiêu hóa IVDP 79 Chế phẩm bị thiếu hụt hai acid amin thiết yếu gồm lysine histidine với số PDCAAS tương ứng 0,95 0,73 Như vậy, chế phẩm APC-K có giá trị mặt dinh dưỡng cao chế phẩm APC-N 3.10 Đánh giá giá trị dinh dưỡng chế phẩm APC-K điều kiện in vivo Sau tuần, mức độ tăng trọng lượng thể nhóm chuột có khác biệt; nhóm chuột ăn thức ăn chứa protein đậu nành chế phẩm APC-K tăng 60-63%, nhóm ăn thức ăn thường tăng 54% Hệ số tăng trọng (PER) số dùng để đo lường chất lượng protein Giá trị PER sử dụng chế phẩm protein APC-K từ rong Chaetomorpha đạt tương ứng 2,12, thấp PER protein động vật trứng gà (3,9), thịt bò (2,6) cá (3,5) Tuy nhiên giá trị cao số protein thực vật bột mì (0,6), đậu (1,5) Tỷ lệ hấp thu protein tịnh (NPR) thể protein không cần cho phát triển thể mà cần để trì sống Sự chênh lệnh giá trị số tùy thuộc vào loại protein Mức độ chênh lệch số PER NPR APC-K 35% Mức độ chênh lệch số PER NPR sử dụng thức ăn thông thường cao nhất, cho thấy nguồn thức ăn đươc sử dụng nhiều cho việc trì sống sinh tổng hợp protein cho thể Giá trị sinh học (BV) thể hiệu sử dụng protein thể trình tăng trưởng trì sống BV sử dụng chế phẩm APC-K từ Chaetomorpha đạt 79,32, cao số BV protein đậu nành thức ăn thông thường Với hàm lượng protein cao (76,5%), lượng tạp chất phi protein thấp nên hiệu sử dụng protein chế phẩm APC-K tốt 22 So với nhóm chuột sử dụng protein đậu nành, nhóm chuột ăn protein Chaetomorpha có số đường huyết tương đương nhóm ăn thức ăn thường có đường huyết cao gần lần Sử dụng APCK hiệu việc giữ số triglyceride máu không tăng cao nhóm chuột ăn thức ăn thường Chỉ số LDL-C thấp so với protein đậu nành Như vậy, nói chuột sử dụng phần ăn có protein từ Chaetomorpha có tình trạng sức khỏe tim mạch ổn định Chỉ số HDL-C nhóm chuột ăn protein Chaetomorpha cao nhóm protein đậu nành Đây nhóm cholesterol cần thiết để trì sức khỏe tim mạch Với số máu này, kết luận nhóm sử dụng khầu phần ăn chứa protein từ Chaetomorpha trì sức khỏe khơng có nguy mắc loại bệnh mãn tính phổ biến có liên quan tới chế độ dinh dưỡng như tim mạch, tiểu đường, béo phì KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Rong mền Chaetomorpha sp có hàm lượng protein dao động khoảng 12,68%-20% nguyên liệu phù hợp để thu nhận chế phẩm protein concentrate Rong cần sấy khô đến hàm ẩm 10% xay nhỏ đến kích thước 0,1mm trước sử dụng để trích ly protein Q trình trích ly nhóm protein tan nước thực bể siêu âm tần số 35 kHz với hỗ trợ enzyme cellulase điều kiện tối ưu sau: dung môi trích ly dung dịch đệm phosphate 0,1M, pH 7, tỷ lệ bột rong dung dịch đệm 1: 20, nồng độ cellulase 121 UI/g chất, nhiệt độ 400C thời gian trích ly 90 phút Hiệu suất trích ly đạt 37,65 mg/g rong khô, hàm lượng Phycocyanin thu 0,378 mg/g rong khơ Bã rong sau tiếp tục sử dụng để trích ly nhóm protein tan kiềm dung môi NaOH 1,2% nhiệt độ 500C thời gian trích ly 72 phút Hiệu suất thu nhận protein đạt 68,1 mg/g rong khô 23 Sử dụng muối amonium sulphate để kết tủa protein kết hợp với loại muối thẩm tích phương án cho hiệu tinh protein concentrate tốt Chế phẩm protein concentrate tan nước APC-N tan kiềm APC-K thu có độ tinh tương ứng 72,8% 76,3% Hai chế phẩm protein concentrate APC-K APC-N đánh giá hình thái kính hiển vi điện tử quét SEM, xác định thành phần acid amin, xác định kích thước phân tử điện di LC-MS/MS Chế phẩm protein tan nước APC-N có hàm lượng protein 72,8%, có tiềm sử dụng thực phẩm chức năng, thể khả kháng kháng oxi hoá dựa chế ức chế peroxy hóa lipid màng tế bào, khả liên kết với ion Fe2+, khả trung hoà gốc tự ABTS•+ khả bắt gốc tự DPPH với giá trị IC50 tương ứng 21,52 µg/ml, 31,46 µg/ml, 52,24 µg/ml 19,11 µg/ml Chế phẩm protein tan kiềm APC-K có hàm lượng protein 76,3%, có tính chất chức tốt, đặc biệt khả tạo gel, khả nhũ hóa làm bền bọt APC.K có khả tiêu hố cao với giá trị IVPD ~80%, thành phần acid amin cân đối tương đối phù hợp với nhu cầu người trưởng thành APC-K có giá trị dinh dưỡng cao, khả tiêu hóa in vivo tốt với giá trị PER, NPR, BV tương ứng 2,12; 3,28 79,32, tương đương với protein concentrate từ đậu nành cao nhiều nguồn protein thực vật phổ biến Đề nghị Do số lý chủ quan khách quan đề tài cịn số khía cạnh chưa tiếp cận nghiên cứu hoàn thiện Chế phẩm protein concentrate từ rong có nhiều tiềm ứng dụng thực phẩm nhóm nghiên cứu có số đề nghị sau: Nghiên cứu thêm số phương án tinh thu nhận APC để thực quy mô lớn 24 Khảo sát sâu cấu tạo APC làm sơ giải thích tính chất chế phẩm protein Kiểm tra khả gây độc tế bào APC để sử dụng thực phẩm Thử nghiệm bổ sung APC vào số sản phẩm thực phẩm đánh giá giá trị dinh dưỡng cảm quan 25 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Đề tài nghiên cứu khai thác thành phần protein có rong lục Chaetomorpha sp đối tượng chưa nghiên cứu nước với kết sau đây: - Xây dựng quy trình thu nhận hai chế phẩm protein concentrate APC-N APC-K từ rong Chaetomorpha sp với hàm lượng protein đạt 75%, sử dụng kỹ thuật siêu âm cellulase - Cung cấp thơng tin có hệ thống nhóm protein rong Chaetomorpha sp., thành phần acid amin, phân đoạn protein kích thước phân tử nhóm protein tan nước tan kiềm đặc điểm hình thái chế phẩm protein - Đánh giá khả kháng vi sinh vật, kháng oxi hóa nhiều chế khác nhau, đặc biệt khả ức chế q trình peroxy hóa màng tế bào chế phẩm protein tan nước APC-N, hướng đến ứng dụng chế phẩm thực phẩm chức - Đánh giá số tính chất cơng nghệ chế phẩm protein concentrate, khả tiêu hóa điều kiện in vitro, đặc biệt khả tiêu hóa in vivo chế phẩm protein concentrate tan kiềm APC-K nhằm mục tiêu sử dụng chế phẩm chế biến thực phẩm 26 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Nghiên cứu thành phần hóa học rong nước lợ Chaetomorpha sp khu vực Đồng Sơng Cửu Long, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 52(5A) (2014) 247-254 Nghiên cứu trích ly protein từ rong nước lợ Chaetomorpha sp.bằng phương pháp kết hợp enzyme cellulase dung mơi kiềm, Tạp chí Khoa học Công nghệ 52(5A) (2014) 255-263 Ảnh hưởng dạng nguyên liệu trình xử lý nguyên liệu đến hiệu suất tách protein từ rong lục Chaetomorpha sp., Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 13(4A) (2015) 1335-1340 Khảo sát phương pháp trích ly phycocyanin từ rong lục Chaetomorpha sp., Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 15(3A) (2017) 269-274 Đánh giá tính chất chức protein cô đặc từ rong lục Chaetomorpha sp., Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 15(3A) (2017) 275-280 Determination of biochemical composition and in vitro digestibility of protein isolate from brackish algae Chaetomorpha sp., The 3rd ICSAF: Food Innovation for Asian Community Development (2018) 88-97 Tối ưu hoá q trình trích ly protein từ sinh khối rong Chaetomorpha sp phương pháp bề mặt đáp ứng, Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ 3(3) (2019) 136-143 ... loại protein từ rong thể tính chất sinh học khả kháng khuẩn, kháng oxy hóa Nghiên cứu thu nhận protein từ rong mở hội sử dụng nguồn đạm thực vật để thay nguồn đạm từ động vật thực phẩm Mục tiêu nghiên. .. tài Nghiên cứu trình thu nhận protein concentrate từ sinh khối rong Chaetomorpha sp Khảo sát tính chất sinh học, tính chất chức giá trị dinh dưỡng protein concentrate từ rong để ứng dụng vào thực. .. thực phẩm Tính ý nghĩa đề tài Đề tài tập trung nghiên cứu thu nhận chế phẩm protein concentrate từ rong Chaetomorpha sp. , nguồn nguyên liệu chưa khai thác nước giới Trong nghiên cứu sử dụng kỹ thu? ??t