Nghiên cứu thu nhận, đánh giá đặc tính của lipase thực vật và khả năng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm TT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG PHAN THỊ VIỆT HÀ NGHIÊN CỨU THU NHẬN, ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA LIPASE THỰC VẬT VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG CƠNG NGHIỆP THỰC PHẨM Chun ngành: Cơng nghệ thực phẩm Mã số: 62 54 01 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT ĐÀ NẴNG – 2021 Cơng trình hồn thành ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS ĐẶNG MINH NHẬT PGS.TS TRẦN THỊ XÔ Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ hội đồng chấm luận văn tiến sĩ họp Đại học Đà Nẵng vào ngày tháng năm 2021 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin- Học liệu Truyền thông, ĐH Đà Nẵng MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Lipase hay Triacylglycerol acylhydrolases (E.C 3.1.1.3) loại enzyme xúc tác phản ứng thủy phân triacylglycerol mạch dài tạo thành diacylglycerol, monoacylglycerol, glycerol acid béo tự bề mặt liên pha nước dung mơi hữu Ngồi ra, lipase cịn xúc tác phản ứng chuyển vị ester phản ứng tổng hợp ester Lipase thu nhận từ vi khuẩn (45%), nấm (21%), động vật (18%), thực vật (11%) vi tảo (3%) So với lipase từ vi sinh vật, lipase từ thực vật có ưu điểm quan trọng như: dễ người tiêu dùng chấp nhận thực phẩm, dược phẩm hơn, dạng enzyme thơ; nguồn ngun liệu để thu nhận có sẵn tự nhiên, không độc hại Lipase thực vật cho có tiềm ứng dụng tốt cơng nghệ thực phẩm, chất tẩy rửa, tổng hợp chất hữu cơ, dược phẩm sản xuất biodiesel Lipase thực vật tìm thấy loại hạt chứa dầu, ngũ cốc mủ loại Trên giới đến 29 loại lipase từ thực vật xác định khối lượng phân tử trình tự acid amin chuỗi protein Những cơng trình nghiên cứu nước lipase cịn ít, đặc biệt lipase từ thực vật lĩnh vực khơng quan tâm Do đó, đề tài chọn cho luận án: "Nghiên cứu thu nhận, đánh giá đặc tính lipase thực vật khả ứng dụng cơng nghiệp thực phẩm" có ý nghĩa khoa học thực tiễn cao Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá hoạt tính lipase thu nhận từ số nguồn thực vật: hạt có dầu, phụ phẩm nơng nghiệp, mủ loại quả; Xây dựng quy trình cơng nghệ thu nhận lipase thô từ nguồn thực vật tiềm năng; Xác định đặc tính lipase thơ lipase tinh sạch; Đánh giá khả ứng dụng lipase thô công nghiệp thực phẩm Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu lựa chọn nguồn nguyên liệu thực vật thích hợp để thu nhận lipase; Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase thu được; Nghiên cứu xây dựng quy trình thu nhận lipase thơ có hoạt độ cao từ nguyên liệu lựa chọn; Nghiên cứu khảo sát đặc tính hố sinh lipase thô; Nghiên cứu tinh lipase thô xác định đặc tính hố sinh; Nghiên cứu ứng dụng lipase thơ quy trình sản xuất dầu cá giàu DHA EPA Phƣơng pháp nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu luận án phương pháp nghiên cứu thực nghiệm kết hợp với phân tích lý thuyết tổng hợp tài liệu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Đánh giá khả thu nhận lipase từ số nguồn nguyên liệu thực vật, ảnh hưởng yếu tố đến hoạt độ chế phẩm, từ xác định nguồn nguyên liệu thực vật có tiềm để khai thác enzyme lipase; Đề xuất quy trình thu lipase thơ từ nguồn thực vật có hiệu cao; Xác định tính đặc hiệu chất lipid lipase thô thu nhận từ nguồn thực vật; Đề xuất phương pháp tinh lipase thô từ mủ đu đủ xác định khối lượng phân tử lipase Tận dụng phế phẩm trình thu papain từ mủ đu đủ để sản xuất lipase thô Ứng dụng lipase thô từ mủ đu đủ để thủy phân dầu cá hồi nhằm thu acid béo tạo tiền đề cho trình làm giàu DHA, EPA ứng dụng công nghiệp thực phẩm Cấu trúc luận án Luận án gồm phần mở đầu; Chương Tổng quan; Chương Phương pháp nghiên cứu; Chương Kết thảo luận; kết luận kiến nghị CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan lipase Lipase (Triacylglycerol acylhydrolases EC 3.1.1.3) thuộc lớp hydrolase, enzyme xúc tác phản ứng thủy phân triglyceride để tạo glycerol acid béo tự bề mặt liên pha dầu – nước Ngoài ra, lipase xúc tác phản ứng chuyển vị ester tổng hợp ester 1.2 Lipase thực vật Lipase thực vật có nhiều hạt có dầu, chứa nhiều triacylglycerol Đối với hạt ngũ cốc, lipase xác định có lớp vỏ cám gạo, phơi lúa mì Ngồi ra, lipase cịn tìm thấy loại mủ loại mủ sung, mủ vả, mủ xương rồng mủ đu đủ 1.3 Ứng dụng lipase thực vật Lipase ứng dụng sản xuất thực phẩm để tạo acid béo sản phẩm thực phẩm phản ứng thủy phân chọn lọc chất béo dầu có thực phẩm Lipase thô từ mủ đu đủ (CPL) nghiên cứu ứng dụng tổng hợp triacylglycerol chuỗi ngắn chuỗi dài dùng sữa công thức cho trẻ sơ sinh, tổng hợp triacylglycerol cấu trúc CPL sử dụng để tổng hợp bơ ca cao nhân tạo Từ ứng dụng CPL cho thấy có tiềm ứng dụng thương mại lớn ngành cơng nghệ thực phẩm 1.6.1 Tình hình nghiên cứu giới Trên giới nghiên cứu lipase thực vật chủ yếu chiết tách, xác định đặc tính, tinh xác định khối lượng phân tử Trong năm gần đây, lipase từ mủ đu đủ quan tâm nghiên cứu nhiều đặc tính ứng dụng Năm 2011, Slim Abdelkafi chiết tách enzyme thủy phân từ mủ đu đủ, xác định đặc tính hóa sinh khẳng định enzyme chiết thể hoạt tính esterase lipase Lipase thô xem loại lipase “cố định” tự nhiên mủ, nghiên cứu nhà khoa học chưa thể tách lipase khỏi mủ đu đủ, khó khăn cần nghiên cứu khảo sát Việc nghiên cứu xây dựng quy trình thu lipase thơ từ mủ đu đủ chưa hoàn thiện Nghiên cứu ứng dụng lipase từ nguồn thực vật cho ngành cơng nghệ thực phẩm cịn hạn chế CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu Đậu nành (Glycine max): giống ĐTDH.02 Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Duyên hải Nam Trung Bộ cung cấp, đậu phộng (Arachis hypogaea L.): trồng Đắk Lắk, cám gạo: thu nhận từ nhà máy xay xát lúa Quảng Ngãi, phơi lúa mì: thu nhận từ nhà máy bột mì Việt Ý - Đà Nẵng, mủ đu đủ: thu từ số vườn đu đủ (Carica papaya) trồng xã Đại An, huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam, Mủ vả (Ficus auriculata) mủ sung (Ficus racemosa) thu nhận từ vườn hộ nông dân tỉnh Thừa Thiên Huế 2.2 Hoá chất para-Nitrophenyl palmitate (p – NPP), p-Nitrophenol (p- NP), n-hexan, Sodium Lauroyl sarcosine (SLS) cung cấp SigmaAldrich; 2-propanol, NaCl hãng Merck; Triton X-100 Canada; Ngoài ra, KCl, MgCl2, CaCl2, NaHCO3, Na2CO3, CH3COOH, Gum Arabic, CH3COONa, NaH2PO4.7H2O, NaH2PO4.7H2O, acetone đạt tiêu chuẩn phân tích 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu - Phương pháp hóa học xác định thành phần nguyên liệu: độ ẩm hàm lượng tro xác định theo phương pháp AOAC 952.08 AOAC 938.08 (1990), hàm lượng protein thô xác định phương pháp Kjeldahl, hàm lượng chất béo xác định phương pháp chiết Soxhlet - Phương pháp thu nhận lipase từ nguồn thực vật: đậu phộng, đậu nành nảy mầm; cám gạo, phơi lúa mì; mủ đu đủ, mủ sung mủ vả Mục tiêu: thu lipase, xác định hoạt độ, khảo sát ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ, pH, ion kim loại đến hoạt độ lipase từ lựa chọn nguồn nguyên liệu để thu lipase cho nghiên cứu - Phương pháp xác định hoạt độ lipase: + Phương pháp chuẩn độ: Đơn vị hoạt độ lipase (U/g U/ml) xác định lượng enzyme cần thiết để xúc tác giải phóng 1μmol acid béo tự thời gian phút điều kiện xác định Cơ chất sử dụng phương pháp chuẩn độ gồm: dầu oliu, dầu cá hồi, triolein, tristearin + Phương pháp đo quang: Lipase xúc tác phản ứng thủy phân chất p-nitrophenyl palmitate (p-NPP) tạo p-nitrophenol (p-NP) biểu màu vàng đặc trưng Hoạt độ lipase xác định cách đo cường độ màu dung dịch chứa p-NP máy UVVIS bước sóng λ = 410 nm Đơn vị hoạt độ tính lượng enzyme cần thiết để xúc tác giải phóng µmol p-NP phút Hiệu suất thu nhận lipase (mU/g) xác định tổng hoạt độ lipase (mU) thu nhận từ gam nguyên liệu ban đầu Tổng hoạt độ lipase = hoạt độ lipase thơ ×khối lượng lipase thơ thu (2.1) (2.2) - Phương pháp xây dựng quy trình thu lipase thơ từ mủ đu đủ: xác định phương pháp bảo quản mủ đu đủ phơi nắng, sấy đối lưu, sấy thăng hoa, trữ đông; nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ mủ đu đủ/ nước để rửa lượng tạp chất, nghiên cứu xác định số lần lặp rửa/ly tâm, nghiên cứu xác định phương pháp sấy để thu lipase thô - Phương pháp chiết tách tinh lipase từ mủ đu đủ: dùng dung dịch Tris HCl 0,1M pH có chứa SLS 0,5% để hịa tan lipase thơ, kết hợp phương pháp kết tủa phân đoạn lipase với muối amoni sunfat, thẩm tách qua Cellophan, sắc ký trao đổi ion cột sắc ký HiTrap Q Sepharose Fast flow Mục tiêu: thu nhận lipase tinh từ mủ đu đủ - Phương pháp xác định tính chất lipase tinh sạch: khối lượng phân tử lipase xác định phương pháp điện di SDS, giá trị Km Vmax xác định dựa phương trình Lineweaver – Burk - Phương pháp nghiên cứu ứng dụng lipase thô từ mủ đu đủ: phương pháp thu nhận dầu cá hồi, số acid, số xà phịng hóa, số iod dầu cá xác định theo TCVN 6127:2010, TCVN 6126:2015, TCVN 6122:2010; thành phần acid béo có dầu cá hồi xác định theo phương pháp AOAC 996.06; phương pháp thủy phân dầu cá hồi CPL hệ nhũ tương dầu/nước hệ pha iso-octan/nước xác định thông qua hiệu suất thủy phân DH % (2.3) - Phương pháp xác định lượng hoạt hóa (EA) phản ứng thủy phân dầu cá hồi CPL xác định dựa đồ thị phương trình Arrhenius - Các phương pháp tốn học: tối ưu hóa q trình thủy phân dầu cá hồi CPL phương pháp quy hoạch thực nghiệm tâm xoay cấp II theo Box Hunter, sử dụng phần mềm Minitab 18 để xử lý số liệu thực nghiệm Các thí nghiệm thực với lần lặp để lấy giá trị trung bình xác định độ lệch chuẩn Microsoft Excel Sự khác biệt có nghĩa kết thí nghiệm đánh giá kiểm định Fisher (p  0,05) phần mềm Minitab 18 Các chữ số a, b, c, đồ thị bảng thể khác biệt có nghĩa kết nghiên cứu CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đánh giá khả thu nhận lipase từ số nguồn thực vật 3.1.1 Hoạt tính lipase từ loại hạt có dầu nảy mầm 3.1.1.2 Ảnh hưởng thời gian nảy mầm đến hoạt tính lipase hạt đậu nành đậu phộng nảy mầm Lipase từ hạt chứa dầu tìm thấy có hoạt độ cao giai đoạn nảy mầm Kết nghiên cứu cho thấy hoạt độ lipase tối đa từ đậu nành nảy mầm thu sau ngày (0,82U/ml) chất dầu oliu Giá trị cao so với hoạt độ lipase tối đa từ hạt đậu phộng nảy mầm (0,72 U/ml) Do lipase từ hạt đậu nành nảy mầm lựa chọn để nghiên cứu đặc tính 3.1.1.3 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase từ hạt đậu nành nảy mầm Từ 20 gam đậu nành nảy mầm thu 2,08 gam lipase thô Kết nghiên cứu cho thấy lipase từ hạt đậu nành nảy mầm hoạt động tối ưu 30 oC, pH chất p-NPP Các ion kim loại Ca2+, Mg2+ nồng độ 0,1M làm tăng hoạt độ lipase từ đậu nành nảy mầm, Na+ K+ làm giảm hoạt độ lipase từ đậu nành nảy mầm 3.1.2 Hoạt tính lipase từ phụ phẩm nông nghiệp: cám gạo phôi lúa mì Kết nghiên cứu cho thấy từ 40 g cám gạo thu 176,6 ml dịch enzyme thô; từ 40 g phơi lúa mì thu 182 ml dịch enzyme thơ Lipase từ cám gạo phơi lúa mì có nhiệt độ tối ưu 45 °C Lipase cám gạo hoạt động tối ưu pH với hoạt độ lipase 0,238 mU/ml Lipase từ phơi lúa mì hoạt động tối ưu pH 9,5 với hoạt độ 0,199 mU/ml Sự có mặt ion kim loại Mg2+, Cu2+, Na+, Mn2+ EDTA nồng độ 0,1M làm giảm hoạt độ lipase cám gạo, lipase phơi lúa mì 3.1.3 Hoạt tính lipase từ mủ loại Từ 17,25 g mủ đu đủ tươi thu 0,58 g lipase thô Lipase thô từ mủ đu đủ (CPL) hoạt động tối ưu 45 oC, pH 8,5 với hoạt độ lớn đạt 120,43 mU/g chất p-NPP Từ 71,58 g mủ vả thu 49,34 ml dịch lipase thô Từ 60,25 g mủ sung thu 41,69 ml dịch lipase thô Lipase từ mủ sung mủ vả có nhiệt độ tối ưu 45 oC chất p – NPP Lipase từ mủ sung hoạt động tối ưu pH 8,5 lipase từ mủ vả hoạt động tối ưu pH Sự có mặt ion K+, Ca2+, Mg2+, Zn2+, EDTA nồng độ 0,1M làm giảm hoạt độ lipase từ mủ sung mủ vả 11 Kết theo dõi hoạt độ lipase sau khoảng thời gian trữ đông thể Bảng 3.6 Bảng 3.6 Sự thay đổi hoạt độ lipase mủ đu đủ theo gian trữ đông Thời gian trữ đông (tuần) Hoạt độ lipase (mU/g CK) Mẫu đối chứng 129,61 ± 7,08a 128,88 ± 7,46ab 127,00 ± 7,35ab 126,08 ± 8,64ab 123,51 ± 5,86ab 117,37 ± 7,30bc 109,74 ± 8,64c Kết cho thấy hoạt độ lipase thu từ mủ đu đủ tươi cấp đông đến tuần có hoạt độ tương đương với hoạt độ lipase thu từ mủ khô sau sấy thăng hoa Do thu lipase từ ngun liệu mủ tươi mủ đu đủ bảo quản trữ đơng đến tuần, mủ cần để thời gian dài chọn phương pháp sấy thăng hoa mủ tối ưu 3.2.2 Thu nhận enzyme thô 3.2.2.1 Chọn tỷ lệ mủ đu đủ/ nước Bảng 3.7 Ảnh hưởng tỷ lệ nước đến hiệu thu nhận lipase thô STT Tỷ lệ mủ đu đủ/nước Khối lượng lipase thô (w/w) (g) 1:4 1,9861±0,0343 1:5 1,6927±0,0082 1:6 1,3626±0,0376 1:7 1,1382±0,0125 1:8 1,1315±0,0148 1:9 1,1250±0,0110 Độ ẩm (%) 9,54 9,56 9,57 9,54 9,55 9,54 12 Kết Bảng 3.7 cho thấy tăng dần lượng nước hòa tan mủ đu đủ theo tỷ lệ từ 1:4 đến 1:7 lượng lipase thơ thu giảm dần chứng tỏ lượng tạp chất hòa tan nhiều Tuy nhiên, lượng nước tăng thêm đến tỷ lệ 1:9 khối lượng lipase thơ thay đổi 80 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 Hoạt độ riêng lipase (mU/g) 70 60 50 40 30 20 10 1:4 Hoạt độ lipase tổng (mU) không đáng kể 1:5 1:6 1:7 1:8 1:9 Tỷ lệ mủ đu đủ/nƣớc Hoạt độ riêng lipase (mU/g) Hoạt độ lipase tổng (mU) Hình 3.18 Ảnh hưởng tỷ lệ mủ đu đủ/nước đến hoạt độ riêng hoạt độ tổng CPL Trong đó, kết Hình 3.18 cho thấy hoạt độ riêng lipase thô tăng dần lượng nước hòa tan tăng hoạt độ tổng giảm không đáng kể Điều chứng tỏ tỷ lệ mủ đu đủ/nước 1:7 lượng nước thích hợp cho q trình hịa tan mủ đu đủ thu lipase thô 3.2.2.2 Chọn số lần lặp rửa-ly tâm Quá trình rửa mủ đu đủ lặp lại nhiều lần làm tăng khả hịa tan enzyme tan nước lượng tạp chất có mủ Dựa vào kết nghiên cứu trên, chọn tỷ lệ mủ đu đủ/ nước 1:7 để rửa lipase 13 Bảng 3.8 Ảnh hưởng số lần lặp rửa – ly tâm đến hiệu thu nhận lipase thô STT Số lần lặp rửa - ly tâm Khối lượng lipase thô Độ ẩm 1 1,1378±0,0107 9,59 2 0,8959±0,0195 9,55 3 0,6386±0,0154 9,56 4 0,6333±0,0176 9,54 5 0,6324±0,0068 9,57 Kết Bảng 3.8 cho thấy cho thấy số lần lặp rửa ly tâm tăng từ đến lần khối lượng lipase thơ thu giảm từ 1,1378g xuống 0,6386g Dễ dàng nhận thấy số lần lặp tăng khả hịa tan tạp chất nước mủ đu đủ tăng Nếu tăng số lần lặp rửa – ly tâm lên lần lượng lipase thô thu Hoạt độ riêng lipase (mU/g) 140 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 120 100 80 60 40 20 Hoạt độ lipase tổng (mU) thay đổi không đáng kể Số lần lặp rửa - ly tâm Hoạt độ riêng lipase (mU/g) Hoạt độ lipase tổng (mU) Hình 3.19 Ảnh hưởng số lần lặp rửa – ly tâm đến hoạt độ riêng hoạt độ tổng CPL 3.2.2.3 Nghiên cứu phương pháp sấy để thu lipase thô 14 Phần rắn thu sau ly tâm cần sấy khô đến độ ẩm bảo quản để thu chế phẩm enzyme thơ Mục đích nghiên cứu nhằm đánh giá hoạt độ chế phẩm lipase thô từ mủ đu đủ theo phương pháp sấy khô khác Từ đề xuất quy trình thu nhận chế phẩm lipase thô từ mủ đu đủ Bảng 3.9 Hoạt độ chế phẩm lipase thô thu phương pháp sấy khác Phương pháp sấy Độ ẩm Hoạt độ kết thúc (%) (mU/ g enzyme khô) Sấy thăng hoa 9,13 120,349 (-40 oC, 24 giờ) Sấy đối lưu 9,55 32,069 (55 oC, 36 giờ) Kết cho thấy hoạt độ lipase thô thu mẫu sau sấy thăng hoa (120,349 mU/g) cao nhiều so với mẫu lipase thô sau sấy đối lưu (32,069 mU/g) Do lipase thu nhận phương pháp sấy thăng hoa bảo tồn hoạt tính lipase 3.2.2.4 Đề xuất quy trình thu lipase thơ Dựa vào kết nghiên cứu trên, quy trình thu lipase thơ từ mủ đu đủ đề xuất Hình 3.21 15 Mủ đu đủ Bảo quản lạnh đông Rã đông Nƣớc cất Ngâm, rửa tạp chất (5 phút) Tỷ lệ mủ đu đủ/nƣớc Lặp lại lần (1:7; w/w) o Ly tâm (6000 vòng, 20 phút, C) Dịch thải o Sấy thăng hoa (-40 C, 16 ) Lipase thơ CPL) Hình 3.21 Quy trình thu lipase thô từ mủ đu đủ 3.3 Tinh enzyme lipase từ mủ đu đủ 3.3.1 Chiết tách lipase mủ đu đủ muối sodium lauroyl sarcosinate (SLS) Tiến hành hịa tan lipase thơ dung dịch Tris HCl 0,1M, pH có SLS 0,5%, kết trình thu Bảng 3.11 Bảng 3.11 Hoạt tính CPL sau hịa tan mà khơng loại lipid Mẫu Phần rắn Phần lỏng Khối lượng/thể tích 1,016 g 0,498g 97mL Hoạt độ riêng 115,07mU/g 20,83mU/g 50,16mU/mL Hoạt độ tổng 116,91mU 10,37mU Lipase thô 4865,5mU 16 Kết cho thấy hoạt tính lipase có phần rắn phần lỏng Hoạt tính cịn lại phần rắn (10,37 mU) chiếm 8,87% so với hoạt tính ban đầu lipase thơ Tuy nhiên, hoạt tính lipase phần dịch lỏng cao gấp 40 lần so với dịch lỏng có loại lipid phương pháp trước Sự tăng vượt trội hoạt độ lipase cho thấy lượng lipase đáng kể mủ SLS hòa tan khỏi mủ 3.3.2 Ảnh hưởng nồng độ SLS lên hoạt độ lipase Kết dung dịch Tris HCl pH có SLS 0,5% sử dụng để hịa tan mủ đu đủ thu lipase có hoạt độ cao 3.3.3 Tủa lipase dung dịch amoni sunfat (AS) Dịch thu sau hòa tan mủ đu đủ dung dịch Tris HCl pH có SLS 0,5% tủa dung dịch AS nồng độ khác Kết cho thấy phân đoạn 50-60% AS có hoạt tính thủy phân tốt khối lượng lipase tủa lớn nên phân đoạn chọn để tinh sắc ký trao đổi ion 3.3.5 Kết tinh enzyme lipase từ mủ đu đủ sắc ký trao đổi ion Mẫu phân đoạn tủa 50-60% AS thẩm tách muối qua Cellophan 48 sau nạp vào cột sắc ký trao đổi ion Sử dụng cột Q Sepharose Fast Flow với điều kiện tách phân đoạn sau: cột cân đệm Tris-HCl 0,01M, pH 9; tốc độ chảy 0,1ml/phút với gradient nồng độ 1M NaCl Hình 3.27 Sắc ký đồ phân đoạn lipase tủa 50-60% AS 17 Kết Hình 3.27 cho thấy có xuất peak chứng tỏ có loại protein có mẫu Peak rửa giải từ 2,58 phút đến 6,87 phút, peak thứ xuất từ 6,87 phút đến 11,29 phút Hoạt độ lipase xác định tương ứng với peak 0,316mU/mL 0,338mU/mL 3.4 Nghiên cứu tính chất lipase tinh 3.4.1 Xác định khối lượng phân tử lipase Kết Hình 3.28 cho thấy có loại lipase có khối lượng phân tử khoảng 35-55 kDa phân đoạn tủa với AS 50-60% M: standard proteins (10-170 kDa) 1-3: mẫu lặp phân đoạn tủa AS 50-60% Hình 3.28 Hình ảnh điện di SDS 3.4.2 Xác định Km Vmax Theo đồ thị Lineweaver-Burk Hình 3.29, giá trị Km Vmax lipase tinh từ mủ đu đủ thủy phân chất p – NPP xác định tương ứng 1,12mM 1,2×10-6 mM/min.mL Hình 3.29 Đồ thị Lineweaver-Burk 18 3.5 Đánh giá khả ứng dụng lipase mủ đu đủ quy trình sản xuất dầu cá giàu DHA EPA 3.5.3.1 Khảo sát đặc tính thủy phân CPL chất dầu cá hồi Bảng 3.1 Phần trăm acid béo có dầu cá hồi trước sau thủy phân ST T Acid béo methyl ester Kí hiệu Tên thơng thường % mẫu ban đầu % phân đoạn dầu không bị thuỷ phân C14:0 Myristic acid methyl ester 3,23 2,64 C16:0 Palmitic acid ester 12,17 10,59 C16:1 Palmitoleic acid methyl ester 3,22 2,96 C18:0 Stearic acid methyl ester 2,99 2,9 C18:1 Oleic acid methyl ester 40,89 40,93 C18:2 Linoleic acid methyl ester 16,78 15,96 C20:0 Arachidic acid methyl ester 0,36 C18:3 Linolenic acid methyl ester 6,08 5,83 C20:1 cis-11-Eicosenoic acid methyl ester 0,99 2,59 2,52 0,95 5,1 4,97 5,66 7,73 0,25 0,83 cis-11,14-Eicosadienoic acid methyl ester cis-5,8,11,14,17-Eicosapentaenoic acid methyl ester (EPA) Cis-4,7,10,13,16,19-Docosahexaenoic acid methyl ester (DHA) cis-8,11,14-Eicosatrienoic acid methyl ester cis-11,14,17-Eicosatrienoic acid methyl ester 10 C20:2 11 C20:5 12 C22:6 13 C20:3 14 C20:3 15 C22:1 Erucic acid methyl ester 0,32 16 C20:4 Arachidonic acid methyl ester 0,56 19 Thành phần acid béo có dầu cá hồi trước sau thủy phân xác định phương pháp sắc ký khí thể Bảng 3.15 Sau thời gian thủy phân 24 giờ, cho thấy tỷ lệ % acid béo lại mẫu triglyceride không bị thủy phân so với mẫu dầu ban đầu khác không đáng kể Điều cho thấy CPL xúc tác thủy phân không đặc hiệu với acid béo có dầu cá hồi 3.5.3.2 Tối ưu hóa q trình thủy phân dầu cá hồi CPL a Xác định nhiệt độ pH tối ưu cho hiệu suất trình thủy phân dầu cá hồi CPL Thực tối ưu hóa điều kiện thủy phân dầu cá CPL công cụ tối ưu hoá phần mềm Minitab 18.0 cho kết nhiệt độ tối ưu 290C pH tối ưu 7,6 b Xác định tỷ lệ nước/cơ chất nồng độ enzyme tối ưu cho hiệu suất trình thủy phân dầu cá hồi CPL Kết tối ưu hóa phần mềm Minitab 18.0 cho biết điều kiện thủy phân với tỷ lệ nước/cơ chất 4,36 nồng độ enzyme 1,34% hiệu suất thủy phân đạt cao 49,4% c Thí nghiệm kiểm chứng Tiến hành thủy phân dầu cá hồi CPL với điều kiện tối ưu: nhiệt độ 29 oC, pH đệm 7,6; tỷ lệ nước/cơ chất 4,36% nồng độ enzyme 1,34% Thí nghiệm lặp lại lần cho kết hiệu suất thủy phân 48,2% ± 0,3% Kết gần giống với tính tốn theo lý thuyết 3.5.3.5 Tối ưu hóa q trình thủy phân dầu cá hồi CPL hệ pha iso-octan/nước Quá trình tối ưu hóa yếu tố: nồng độ enzyme, tỷ lệ dung mơi/cơ chất, nhiệt độ đến q trình thủy phân dầu cá hồi CPL 20 thực theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm tâm xoay Box-Hunter Thời gian thủy phân giờ, kết hiệu suất thủy phân thể Bảng 3.21 Bảng 3.21 Hiệu suất phản ứng thủy phân qua thí nghiệm Biến thực Số thí nghiệm Nồng độ enzyme (x1) 10 11 12 13 14 T1 T2 T3 1,8 1,6 1,4 1,6 1,4 1,94 1,8 1,4 1,4 1,26 1,6 1,8 1,8 1,6 1,6 1,6 1,6 Tỷ lệ dung môi/cơ chất (x2) 1,5 1,84 1,5 1,5 0,5 0,5 0,5 1 1,5 0,5 0,16 1 Biến mã hoá Nhiệt độ X1 (x3) 30 35 30 26,6 40 35 40 30 40 35 43,4 40 30 35 35 35 35 +1 -1 -1 +α +1 -1 -1 -α +1 +1 0 0 Hiệu suất (%) X2 X3 Y +1 +α +1 +1 -1 -1 -1 0 +1 -1 -α 0 -1 -1 -α +1 +1 -1 +1 +α +1 -1 0 0 30,8 32,4 27,5 25,9 31,3 31,9 33,4 26,4 31,9 27,1 32,0 33,1 33,9 30,4 35,0 35,5 36,1 Kết thu phương trình hồi quy thể ảnh hưởng yếu tố đến mục tiêu sau: Y = -265,4 + 189,2x1 + 7,42x3 – 44,8x12 – 4,62x22 - 0,081x32 Sử dụng cơng cụ tìm điểm tối ưu phần mềm Minitab, kết thu nồng độ enzyme tối ưu 1,68% tương ứng với 0,084g 21 enzyme cho 1g dầu cá hồi, tỷ lệ dung môi/cơ chất tối ưu 0,97 nhiệt độ tối ưu 36,4oC Hiệu suất thủy phân đạt 35,98% điều kiện tối ưu sau khoảng thời gian 3.5.3.6 Xác định thông số động học trình thủy phân dầu cá hồi CPL hệ pha iso-octan/nước a Xác định Km Vmax Các thông số động học Km Vmax CPL thủy phân chất dầu cá hồi xác định tương ứng 293,3 µmol FAs/ml 266,4 (µmol FFAs/giờ.ml) b Xác định lượng hoạt hóa EA Năng lượng hoạt hóa (EA) phản ứng thủy phân dầu cá hồi CPL xác định dựa đồ thị phương trình Arrhenius thể Hình 3.38 -0.8 0.00315 0.0032 0.00325 0.0033 0.00335 lnk -1 -1.2 -1.4 y = -4873.6x + 14.646 R² = 0.9811 -1.6 1/T (K-1) Hình 3.38 Đồ thị Arrhenius thủy phân dầu cá CPL Phương trình ln k  ln A0    E A  tương ứng với  RT  y = -4873,6x + 14,646 Từ đây, lượng hoạt hóa xác định EA = 40,5 kJ/mol Một phản ứng có lượng hoạt hóa nhỏ tốc độ phản ứng lớn 22 3.5.3.7 Ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất trình thủy phân dầu cá hệ có iso octan điều kiện tối ưu cho thấy, hiệu suất phản ứng thủy phân dầu cá hồi xúc tác CPL chế độ thủy phân Hiệu suất (%) Từ đồ thị Hình 3.39 80 57d 63.9c 64b 63.9a 60 40 chọn tăng dần theo thời 20 gian Sau thời gian e 24 48 hiệu suất thủy phân tăng 72 96 120 Thời gian (giờ) gần khơng đổi Hình 3.39 Biểu đồ ảnh hưởng Nguyên nhân hệ thời gian đến hiệu suất phản ứng đạt trạng thái trình thủy phân cân Vì trình thủy phân dầu cá hồi CPL hệ isooctan/nước không cần kéo dài 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ A KẾT LUẬN 1/ Đã thu nhận lipase thô từ số nguồn nguyên liệu thực vật Việt Nam xác định điều kiện hoạt động tối ưu chúng chất p-NPP Lipase từ mủ đu đủ có nhiệt độ tối ưu 45 oC, pH tối ưu khoảng 8-9 Kết so sánh hoạt độ lipase từ nguồn nguyên liệu thực vật khảo sát điều kiện hoạt động tối ưu chúng cho thấy lipase từ mủ đu đủ có hoạt độ cao nhất, có tiềm để khai thác quy mô công nghiệp 2/ Đã xây dựng quy trình sản xuất lipase thô từ mủ đu đủ (CPL) Sản phẩm thu có độ ẩm 9,13%, hoạt độ riêng 120,349 mU/g, có khả thủy phân dầu cá hồi tốt so với dầu đậu 23 nành, triolein, tristearin 3/ Lần đầu tiên, lipase từ mủ đu chiết tách cách sử dụng dung dịch đệm Tris – HCl chứa SLS 0,5% Bước đầu phân lập phân đoạn chứa loại lipase có khối lượng phân tử khoảng 35 – 55 kDa Các thông số động học Km Vmax phân đoạn lipase chất p –NPP xác định tương ứng 1,22mM 1,2.10-6 mM.min-1.ml-1 4/ Bằng kỹ thuật sắc ký khí xác định CPL thủy phân không đặc hiệu acid béo có dầu cá hồi 5/ Điều kiện tối ưu trình thủy phân dầu cá hồi CPL hệ nhũ tương dầu/ nước xác định 29 oC, pH tối ưu 7,6, tỷ lệ lượng nước/cơ chất 4,36, nồng độ enzyme 1,34%, hiệu suất thủy phân tối ưu đạt 49,4% sau 24 Điều kiện tối ưu trình thủy phân dầu cá hồi CPL hệ pha iso- octan/nước xác định 36,4 oC, nồng độ enzyme 1,68%, tỷ lệ dung môi/ chất 0,97, hiệu suất thủy phân tối ưu đạt 57% sau 24 6/ Các thông số động học Km, Vmax lượng hoạt hóa q trình thủy phân dầu cá hồi CPL hệ pha isooctan/nước xác định tương ứng 15,8mol FFAs/ml, 270,6mol FFAs/h.ml 40,5 kJ/mol B NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Các kết nghiên cứu luận án xác định có đóng góp cho khoa học mặt học thuật thực tiễn sau: - Đã chiết phần lớn lipase khỏi cấu trúc mủ đu đủ nhờ vào điểm cải tiến so với quy trình trước cơng bố: tiến hành đông khô nhanh mủ đu đủ, không sử dụng dung môi hữu để loại lipid sử dụng chất hoạt động bề mặt SLS 0,5% Đã phân lập lipase từ mủ đu đủ có khối lượng phân tử 24 khoảng 35 – 55kDa - Đã xác định enzyme lipase từ mủ đu đủ tính đặc hiệu với acid béo có dầu cá hồi Các thông số tối ưu cho trình thuỷ phân dầu cá hồi hệ nhũ tương dầu nước hệ hai pha với iso-octan xác định, mở khả ứng dụng lipase thô từ mủ đu đủ quy trình làm giàu DHA EPA từ dầu cá hồi nói riêng loại dầu cá khác nói chung C KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 1/ Nghiên cứu thu nhận lipase từ nguồn nguyên liệu thực vật khác có sẵn Việt Nam 2/ Nghiên cứu ứng dụng lipase từ mủ đu đủ phản ứng ester hóa, phản ứng chuyển ester 25 CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ Phan Thị Việt Hà, Đặng Minh Nhật, Trần Châu Cẩm Hằng (2015), “Nghiên cứu động thái sinh tổng hợp lipase hạt đậu nành q trình nảy mầm số đặc tính loại enzyme này”, Hội thảo khoa học quản lý chất lượng & An toàn thực phẩm, ISBN 987-604-913-415-9, pp 17 – 23 Phan Thị Việt Hà, Đặng Minh Nhật, Trần Thị Xô, Phan Thị Luyến (2015), “Nghiên cứu thu nhận khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính lipase từ mủ đu đủ”, Tạp chí Hóa học, Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam, 53 (6e1,2), p.291294 Phan Thị Việt Hà, Đặng Minh Nhật, Trần Thị Bích Hà (2016), “Nghiên cứu thu nhận khảo sát đặc tính lipase từ mủ đu đủ (carica papaya latex)”, Tạp chí khoa học cơng nghệ, Đại học Đà Nẵng, 108 (11), pp 82-85 Phan Thị Việt Hà, Huỳnh Thị Tuyết Mai, Đặng Minh Nhật, Trần Thị Xô (2017), “Nghiên cứu chiết tách khảo sát đặc tính lipase từ hạt đậu phộng nảy mầm”, Tạp chí Hóa học, Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam, (4E23), pp 118-223 Dang Minh Nhat, Phan Thi Viet Ha (2019), “The isolation and characterization of lipase from carica papaya latex using zwitterion sodium lauroyl sarcosinate as agent”, Potravinarstvo Slovak Journal of Food Sciences, 13 (1), pp 773-778 Phan Thị Việt Hà, Huỳnh Thị Phương Thu, Đặng Minh Nhật (2020), Tối ưu hóa q trình thủy phân dầu cá hồi lipase từ mủ đu đủ, Tạp chí khoa học cơng nghệ, Đại học Đà Nẵng, 18 (1), pp 55-59 ... nghệ thu nhận lipase thô từ nguồn thực vật tiềm năng; Xác định đặc tính lipase thơ lipase tinh sạch; Đánh giá khả ứng dụng lipase thô công nghiệp thực phẩm 2 Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu lựa... trình nghiên cứu nước lipase cịn ít, đặc biệt lipase từ thực vật lĩnh vực khơng quan tâm Do đó, đề tài chọn cho luận án: "Nghiên cứu thu nhận, đánh giá đặc tính lipase thực vật khả ứng dụng cơng nghiệp. .. Nghiên cứu khảo sát đặc tính hố sinh lipase thô; Nghiên cứu tinh lipase thô xác định đặc tính hố sinh; Nghiên cứu ứng dụng lipase thơ quy trình sản xuất dầu cá giàu DHA EPA Phƣơng pháp nghiên cứu