Nghiên cứu chiết tách một số hoạt chất trong củ tam thất trồng ở sapa, việt nam và khả năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm (tt)

MỞ ĐẦU Ở nước ta, tam thất trồng mọc tự nhiên ở: Hà Giang, Cao Bằng, Lào Cai, Kon Tum, Quảng Nam… Tuy nhiên việc khai thác sử dụng tam thất nước hạn chế chưa có nhiều nghiên cứu khoa học so sánh thành phần hoá học hoạt chất tác dụng sinh học chúng với loài tam thất khác, đặc biệt loài tam thất trồng Trung quốc Tam thất Việt Nam chủ yếu khai thác để xuất tiểu ngạch sang Trung Quốc làm thuốc chữa bệnh Nước ta chủ yếu nhập Tam thất trồng Trung Quốc (tên khoa học Panax notoginseng) làm thuốc chữa bệnh, pha chế mỹ phẩm làm thực phẩm bổ dưỡng thể Cho tới ngày nay, việc khai thác hoạt chất saponin polyacetylen củ tam thất nghiên cứu theo phương pháp chiết tách khác nhau, phương pháp nghiên cứu chiết tách với hỗ trợ thiết bị siêu âm cho lượng chất tổng số lớn với đầy đủ hoạt chất Phương pháp sắc ký đại tinh chất có độ tinh cao, từ nghiên cứu hoạt tính sinh học chúng, mở khả ứng dụng công nghệ để sản xuất sản phẩm tốt hơn, với chất lượng cao Xuất phát từ thực tế cấp thiết trên, đề tài: “Nghiên cứu chiết tách số hoạt chất củ tam thất trồng Sapa, Việt Nam khả ứng dụng công nghệ thực phẩm” lựa chọn để nghiên cứu với mục tiêu nội dung sau: * Mục tiêu nghiên cứu - Nghiên cứu, xác định loài tam thất trồng Sapa, Việt Nam - Nghiên cứu thu nhận cao chiết từ tam thất, thành phần dinh dưỡng, đồng thời đánh giá hoạt chất có hoạt tính sinh học cao chiết từ tam thất trồng Sapa, Lào Cai - Đánh giá khả ứng dụng củ tam thất số sản phẩm công nghệ thực phẩm * Nội dung nghiên cứu - Xác định tên khoa học ba loài tam thất trồng Sapa, Lào Cai, Việt Nam là: Panax stipuleanatus, Panax bipinnatifidus, Panax notoginseng - Nghiên cứu thành phần hoá học ba loại củ tam thất trồng Sapa, Lào Cai, Việt Nam: protein, lipid, carbohydrate, amino axit, axit béo, nguyên tố đa lượng vi lượng, phenol tổng, flavonoid tổng saponin Từ đánh giá chất lượng tam thất hoang Việt Nam (Panax stipuleanatus) - Xác lập qui trình thu nhận cao tam thất từ củ tam thất hoang phương pháp chiết tách với ethanol, xác định cấu trúc hoạt chất hoạt tính sinh học chất cao tam thất hoang (Panax stipuleanatus) - Nghiên cứu ứng dụng tam thất hoang ngành công nghệ thực phẩm * Tính luận án - Đây nghiên cứu đầy đủ thành phần dinh dưỡng ba tam thất Sapa, Lào Cai (Việt Nam) Từ đánh giá chất lượng tam thất hoang (Panax stipuleanatus) so với hai loài tam thất khác (Panax bipinnatifidus, Panax notoginseng) - Tối ưu hóa qui trình chiết tách cao chiết tổng củ tam thất hoang, lượng cao thu 15,00 ± 0,02% Đồng thời tinh xác định cấu trúc hợp chất củ tam thất hoang stigmasterol (T1), axit 5-dodecenoic (T2), stipudiol (T4) 5-hydroxymetylfurfural (T5), panaxytriol (T6) đặc biệt có chất Heptadeca-8-en-4,6-diyne-3,10-diol (T3) Trong đó, T3, T4 T6 có hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào KB - Từ bột, cao chiết tổng chiết tách từ củ tam thất hoang tạo số sản phẩm như: kẹo cứng tam thất, bánh cookie tam thất, nước tam thất mật ong trà tam thất hoa cúc có tính chất cảm quan hấp dẫn người tiêu dùng Bố cục luận án Luận án gồm 145 trang, mở đầu: trang, chương 1: 37 trang, chương 2: 21 trang, chương 3: 67 trang, kết luận kiến nghị trang, danh mục công trình công bố trang, tài liệu tham khảo 13 trang Luận án có 50 bảng, 44 hình, 160 tài liệu tham khảo 1.TỔNG QUAN ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Đối tượng nghiên cứu luận án loài tam thất thu hái Sapa - Lào Cai Mẫu tam thất giám định tên khoa học hình thái Panax notoginseng F H Chen ex C Y Wu et K M Feng (tam thất Trung Quốc), Panax bipinnatifidus Seem (sâm Vũ diệp) Panax stipuleanatus H Tsai et K M Feng (tam thất hoang), thuộc họ Ngũ gia bì (Nhân Sâm) (Araliaceae) - Luận án sử dụng phương pháp thiết bị nghiên cứu sau: + Phân tích định lượng saponin sắc kí lỏng hiệu cao HPLC; thành phần axit béo xác định GC-MS; amino axit xác định HPLC với detector huỳnh quang; hàm lượng nguyên tố đa lượng vi lượng xác định thiết bị quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) Hàm lượng flanonoid, phenol tổng… xác định phương pháp quang phổ (UV-Vis) + Các chất tinh sắc kí mỏng (TLC), sắc kí cột nhồi silica gel, sephadex LH-20, sắc kí lỏng điều chế (Prep HPLC) với cột pha thường pha đảo (RP-18) Cấu trúc chúng xác định phương pháp phổ HR-ESI-MS 1D, 2D NMR + Hoạt tính kháng vi sinh vật xác định theo hai phương pháp phương pháp khuếch tán lỗ thạch phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật môi trường lỏng Hoạt tính gây độc tế bào theo phương pháp môi trường thạch (MTT) + Nghiên cứu ứng dụng sản phẩm tam thất ngành công nghệ thực phẩm phương pháp phân tích cảm quan sản phẩm, phân tích phương sai (ANOVA) Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết nghiên cứu đặc tính nguyên liệu tam thất 3.1.1 Hàm lƣợng protein Bằng phương pháp Kjeldahl, xác định hàm lượng protein có mẫu bột khô tam thất hoang P stipuleanatus 7,04 ± 0,29% khối lượng khô; sâm vũ diệp P bipinnatifidus 8,02 ± 0,15%; tam thất Trung Quốc P notoginseng 10,16 ± 0,24% 3.1.2 Hàm lƣợng lipid Bằng phương pháp Soxhlet xác định hàm lượng lipid có mẫu bột khô tam thất tính theo khối lượng khô Hàm lượng lipid có tam thất hoang 10,35 ± 0,80%; sâm vũ diệp 9,12 ± 0,3% tam thất Trung Quốc 6,72 ± 0,5% 3.1.3 Hàm lƣợng carbohydrate Từ đồ thị đường chuẩn D-glucose, xác định hàm lượng carbohydrate có mẫu bột khô tam thất hoang 50,62 ± 3,74%; sâm vũ diệp 43,28 ± 0,23% tam thất Trung Quốc 48,15 ± 0,42% 3.1.4 Hàm lƣợng amino axit Bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) sử dụng HPLC Alliance hãng Water, Mỹ với quy trình xử lý mẫu phân tích, xác định amino axit thực Phòng thí nghiệm Khoa Hóa Thực phẩm, Viện Dinh dưỡng Quốc gia, phân tích thành phần amino axit ba loại củ tam thất sau: Bảng 3.4 Thành phần amino axit ba loài tam thất (mg/100g mẫu khô) P P P stipuleanatus notoginseng bipinnatifidus Aspartic 437,5 394,6 414,7 Serine 309,9 284,5 299,5 Glutamic 304,6 282,0 311,4 Glycine 67,9 60,1 63,6 Histidine 856,8 804,2 1132,3 Arginine 346,4 312,4 343,6 Alanine 142,3 132,5 139,4 Proline 31,4 27,9 30,2 Tyrosine 225,8 194,8 206,2 10 Valine 191,0 185,8 201,9 11 Methionine 46,2 41,0 35,9 12 Lysine 292,8 272,0 287,5 13 Isoleucine 128,3 132,4 131,9 14 Leucine 327,7 309,2 328,7 15 Phenylalanine 276,3 257,3 284,5 No Amino axit 3.1.5 Thành phần axit béo Từ kết phân tích GC-MS (7000B) hãng Agilent, Mỹ với quy trình xử lý mẫu phân tích Phòng thí nghiệm Khoa Hóa Thực phẩm, Viện Dinh dưỡng Quốc gia, 14 loại axit béo phát từ ba loài tam thất Bảng 3.5 Thành phần axit béo có ba loài tam thất (mg/100g mẫu khô) No Axit béo P P P stipuleanatus notoginseng bipinnatifidus C12:0 (decanoic) 3,4 13,6 32,6 C14:0 (myristic) 11,7 30,5 30,3 C16:1 (palmitoleic) 31,5 29,9 20,7 C16:0 (palmitic) 236,5 407,0 621,4 C17:0 (margaric) 19,6 14,8 9,9 C18:2 (linoleic) 783,9 587,0 743,5 C18:1 (oleic) 251,3 350,2 354,3 C18:0 (stearic) 82,6 98,4 98,3 C20:1 (eicosenoic) 17,7 10,1 - 10 C20:0 (arachidic) 14,6 7,6 5,5 11 C21:0 (henecosanoic) 1,5 0,0 - 12 C22:0 (behenic) 8,3 4,6 - 13 C23:0 (tricosanoic) 0,9 - - 14 C24:0 (lignoceric) 2,2 2,2 - [(-) không xác định được] Từ bảng 3.5 cho thấy, thành phần axit béo hai loài P notoginseng P stipuleanatus thấy có axit linoleic, axit oleic, axit paltamic, axit béo phổ biến thành phần axit béo P ginseng, P notoginseng P quinqueflolius từ Trung Quốc 3.1.6 Nghiên cứu thành phần nguyên tố đa lƣợng vi lƣợng Bằng thiết bị Quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS-6300), sử dụng kỹ thuật nguyên tử hóa mẫu không lửa lò Graphit phân tích, xác định số nguyên tố đa lượng vi lượng loài tam thất Bảng 3.6 Thành phần nguyên tố đa lượng vi lượng tam thất (mg/kg trọng lượng khô) STT Nguyên tố Fe Cu Zn Pb Cr Ni Mn Cd P bipinnatifidus 12,6933 1,3543 4,7186 6,2865 7,4905 1,0769 10,4556 0,0487 P stipuleanatus 14,0271 1,2716 4,0570 7,0323 7,4484 0,5786 9,3159 0,0382 P notoginseng 12,0173 1,1169 4,3572 7,1158 7,2480 0,7321 8,3516 0,0422 3.1.7 Hàm lƣợng phenol tổng Kết nghiên cứu thu cho thấy hàm lượng phenol tổng cao chiết củ tam thất hoang 12,04 ± 0,08 mg/g cao so với loài tam thất khác sâm vũ diệp 11,00 ± 0,17 mg/g tam thất Trung Quốc 11,29 ± 0,11 mg/g 3.1.8 Hàm lƣợng flavonoid tổng Kết nghiên cứu cho thấy hàm lượng flavonoid tổng 1g mẫu cao ethanol loài tam thất so với chất chuẩn mg Quercetin (QE), tam thất hoang có hàm lượng flavonoid thấp 1,03 ± 0,12 mg/g Trong đó, flavonoid củ tam thất Trung Quốc 1,29 ± 0,10 mg/g flavonoid sâm vũ diệp 1,19 ± 0,07 mg/g 3.1.9 Phát saponin phản ứng định tính đặc trƣng Kết tiến hành phân tích định tính phản ứng đặc trưng ống nghiệm, phản ứng giọt sắc kí cho thấy có mặt nhóm chất saponin bột củ tam thất Các saponin phép thử thuộc nhóm saponin triterpen steroid Phép thử định tính cho thấy củ chứa chủ yếu nhóm saponin triterpen 3.1.10 Xác định saponin tam thất sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) Bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) áp dụng quy trình phân tích dược điển Trung Quốc, thực Phòng thí nghiệm Dược, Viện Kiểm nghiệm, Bộ Y tế, kết bảng sau: Bảng 3.10 Định lượng saponin bột củ ba loài tam thất Mẫu Bột TTH Bột SVD Bột NOTO Khối lượng (g) 0,6 0,6 0,6 Thể tích (ml) 50 50 50 R1 (%) Rb1 (%) Rg1 (%) 0,015 0,008 1,140 0,062 0,034 4,230 0,057 0,038 4,750 R1: Notoginsenosid R1 Rb1: Ginsenosid Rb1 Saponin tổng (%) 0,080 0,134 10,12 Rg1: Ginsenosid Rg1 Nhận xét: Qua việc nghiên cứu khảo sát đặc tính nguyên liệu loài tam thất phổ biến Sapa, Lào Cai Chúng thấy tam thất hoang loài dược liệu quí, vùng phân bố rộng, tam thất đặc thù Việt Nam Do để làm rõ hoạt chất có hoạt tính sinh học loài Chúng tập trung nghiên cứu xác định thành phần hoạt chất củ để làm sở khoa học cho việc ứng dụng tam thất vào sản phẩm thực phẩm 3.2 Xây dựng quy trình chiết tách cao tổng từ củ tam thất hoang 3.2.1 Nghiên cứu khảo sát phƣơng pháp chiết tách thu cao tổng Nghiên cứu chọn ethanol làm dung môi chiết ethanol dễ hòa tan hầu hết hợp chất thiên nhiên, không độc hại đến sản phẩm, cất thu hồi lại dung môi Các thí nghiệm tiến hành sau: cho khoảng gam bột mẫu tam thất lượng dung môi theo tỉ lệ dung môi/nguyên liệu 50/1(thể tích/khối lượng; v/m) Các phương pháp chiết sau: Bảng 3.11 Kết khảo sát phương pháp chiết tách nồng độ dung môi chiết Phƣơng pháp tách Chiết Soxhlet Trong Nồng độ ethanol (% V) 99,6 95 90 85 80 75 70 65 60 Khối lƣợng mẫu (g) Cao chiết tổng (% chất khô) 2,0685 2,0674 2,0787 2,0769 2,0776 2,0916 2,0702 2,0794 2,0694 9,78 12,51 12,08 12,99 11,80 8,49 8,91 8,91 8,91 (DPPH) IC50 (mg/ml) 25,82 26,41 26,21 26,30 25,86 25,75 25,91 25,78 25,95 Ngâm nhiệt độ thường Trong 48 Siêu âm 30 phút Siêu âm 99,6 90 80 70 60 50 40 30 90 80 70 60 50 40 90 80 70 60 50 40 2,0069 2,0214 2,0409 2,0219 2,0066 2,0703 2,0591 2,0675 2,0311 2,0465 2,0286 2,0436 2,0632 2,0568 2,078 2,0413 2,0638 2,0048 2,0532 2,0732 6,93 9,15 10,608 11,49 14,04 13,59 13,08 13,07 7,60 9,25 10,36 10,34 10,01 10,13 9,06 11,07 14,17 13,19 12,36 12,32 25,92 26,02 26,61 26,28 26,65 26,08 26,41 26,51 26,56 25,89 26,35 26,13 26,46 26,53 26,24 26,60 26,67 26,48 26,18 26,24 Nồng độ ethanol (%V) Hình 3.1: Khảo sát phương pháp chiết tách cao chiết tổng Kết bảng 3.11 cho thấy thay đổi phương pháp chiết thay đổi nồng độ % ethanol, kiểm tra hoạt tính quét gốc tự cao chiết thu (% chất khô), kết quét DPPH không thay đổi nhiều (ở nồng độ IC50 chất đối chứng axit ascorbic IC50 = 0,030 mg/ml; DPPH thấp cao chiết Soxhlet IC50 = 25,75 cao cao chiết có hỗ trợ siêu âm IC50 = 26,67 mg/ml) Từ kết cho ta sở để tiến hành nghiên cứu 3.2.2 Kết khảo sát điều kiện tối ƣu hoá phƣơng pháp chiết siêu âm Từ nghiên cứu khảo sát trên, nhận thấy phương pháp chiết cho cao chiết tổng có hoạt tính chống oxy hóa (IC50) không thay đổi, phương pháp chiết sử dụng siêu âm thu lượng cao chiết tổng lớn Do đó, tiến hành nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng như: tỉ lệ dung môi/nguyên liệu, nồng độ cồn, thời gian chiết siêu âm nhiệt độ chiết đến lượng cao chiết tổng thu Hình 3.2: Khảo sát tỉ lệ dung môi/nguyên liệu (v/m) Hình 3.3: Khảo sát nồng độ dung môi ethanol (%) c, Khảo sát thời gian ngâm mẫu chiết (hỗ trợ rung siêu âm) Ngâm khoảng gam mẫu 100 ml dung môi ethanol có nồng độ cồn 65% rung siêu âm trì nhiệt độ khoảng từ 350C đến 400C Khảo sát thời gian ngâm mẫu chiết hỗ trợ siêu âm máy Powersonic 405 - Hàn Quốc (tần số 33 - 40 kHz) mức thời gian từ 30 phút đến 90 phút Kết thu hình 3.4 sau: Hình 3.4: Khảo sát thời gian chiết (thời gian rung siêu âm) 10 Kết quả: nồng độ dung môi 65%, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 55/1 (v/m) thời gian siêu âm 75 phút Với điều kiện tối ưu mục tiêu lượng cao chiết tổng đạt cao là: 15,00 ± 0,02% Đạt tỷ lệ lượng cao chiết lớn cho mục đích chiết tách cao tam thất Mẫu tam thất 2,0419g (qui khô) - Nghiền thành bột ø 0,2-1mm - Nồng độ dung môi 65% - Tỷ lệ dm/bột (55/1) - Chiết siêu âm t0≤ 450C EtOH Dịch EtOH - Lọc lấy dịch chiết - Cô chân không đến cặn, t0≤ 500C - Pck = 550 mmHg Sấy chân không loại EtOH (Pck =550 mmHg, 500C, giờ) Lượng cao chiết tổng 0,3065g Hình 3.9: Qui trình công nghệ chiết tách cao chiết tổng từ tam thất Từ sản phẩm cao chiết tổng thu phân tích xác định hàm lượng saponin thành phần phương pháp phân tích (HPLC) hãng Hitachi (Nhật Bản) thu kết bảng 3.20 đây: 11 Bảng 3.20 Định lượng saponin thu cao chiết ethanol tam thất hoang Mẫu Cao TTH Khối lượng (g) Thể tích (ml) R1 (%) Rb1 (%) Rg1 (%) Saponin tổng (%) 0,6 50 0,046 0,190 0,187 0,423 R1: Notoginsenosid R1 Rb1: Ginsenosid Rb1 Rg1: Ginsenosid Rg1 3.3 Hoạt tính sinh học phân đoạn chiết xuất từ củ tam thất hoang 3.1.1 Hoạt tính chống oxy hóa – quét gốc tự DPPH Bảng 3.21: Hoạt tính chống oxy hóa cao phân đoạn từ củ tam thất hoang Mẫu n-hexane Ethyl acetat n-butanol Axit ascorbic Phần trăm ức chế gốc tự DPPH nồng độ khác mẫu (%) 0,1 0,5 1,0 2,0 (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) 0,99 2,48 4,09 1,4 4,45 5,17 7,11 0,65 4,09 7,65 11,53 0,005 0,01 0,05 0,1 0,5 (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) 0,32 1,61 37,07 80,92 88,15 Từ kết bảng 3.21 cho thấy hoạt tính chống oxy hóa phân đoạn củ tam thất hoang thấp Hoạt tính chống oxy hóa cao phân đoạn n-butanol 11,53% với mg/ml mẫu thử Trong chất đối chứng axit ascorbic 0,05 mg/ml đạt 37,07% 3.3.2 Hoạt tính kháng vi sinh vật Chúng tiến hành đánh giá khả kháng vi sinh vật cao phân đoạn củ tam thất hoang theo hai phương pháp phương pháp khuếch tán lỗ thạch phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật môi trường lỏng 12 Bảng 3.22: Hoạt tính kháng vi sinh vật cao phân đoạn từ củ tam thất hoang môi trường thạch Kích thƣớc vòng kháng khuẩn (mm) Tên vi khuẩn n-hexane Nƣớc n-butanol (10mg/ml) (20mg/ml) (20mg/ml) - 10,7 ± 1,2 - 10,4 ± 1,1 24,6 ± 0,5 - - - 11,4 ± 1,2 S typhimurium 22,8 ± 1,6 - - - 14,4 ± 0,5 E coli 23,4 ± 1,6 - 16,3 ± 4,0 - 12,0 ± 2,2 P aeruginosa 21,4 ± 1,6 - 19,0 ± 1,4 2,5 ± 0,58 9,2 ± 1,3 S enterica 18,7 ± 1,5 - - - - ĐC (+) ĐC (-) B subtilis 21,8 ± 1,7 S aureus ĐC (+) : kanamycine, ĐC (-) : methanol, "-" : không xác định (Giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, n =3) Bảng 3.23: Hoạt tính kháng số vi sinh vật cao phân đoạn củ tam thất hoang môi trường lỏng Nồng độ ức chế 50% phát triển vi sinh vật IC50 (g/ml) Mẫu Gram (+) Gram (-) Nấm S B L S E P C aureus subtilis fermentum enterica coli aeruginosa albican n-hexane 5,03 5,00 > 128 > 128 > 128 > 128 > 128 n-butanol 8,00 > 128 > 128 > 128 > 128 > 128 > 128 3.3.3 Hoạt tính ức chế sinh tổng hợp melanin Tyrosinase enzyme có vai trò quan trọng trình sinh tổng hợp melanin Tyrosinase enzyme xúc tác cho trình phân giải tyrosine dopaquinon tạo melanin 13 Bảng 3.25: Nồng độ ức chế 50% hoạt tính tyrosinase (IC50) cao phân đoạn từ củ tam thất hoang Mẫu chất chuẩn IC50 (mg/ml) n- hexane 0,4312 ± 0,0332 n-butanol 0,3231 ± 0,0787 Nước 0,4151 ± 0,0919 Axit kojic 0,0044 ± 0,0005 (Giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, n =3) Từ kết hai bảng 3.25 trên, thấy hoạt tính ức chế tyrosinase tăng tuyến tính theo dãy nồng độ cao phân đoạn Và ba cao phân đoạn thể khả ức chế tyrosinase thấp so với chất đối chứng axit kojic 3.3.4 Hoạt tính kháng tế bào ung thƣ Bảng 3.26: Hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư cao phân đoạn từ củ tam thất hoang (IC50, µg/ml) Hoạt tính gây độc tế bào dòng ung thư - IC50 (µg/ml) Cao LU HepG2 n-hexane 0,26 0,26 n-butanol 39,34 Ellipticin 0,45 Đối chứng SK- MCF-7 KB 0,21 0,51 0,86 54,03 67,79 48,24 63,37 0,35 0,56 0,53 0,31 MEL Theo kết từ bảng 3.26, ta thấy cao phân đoạn n-butanol nhexane củ tam thất hoang có hoạt tính gây độc tế bào năm dòng tế bào thử nghiệm 3.4 Phân lập, xác định cấu trúc hoạt tính số thành phần hóa học cao chiết tam thất hoang 3.4.1 Chiết phân đoạn từ cao chiết tổng củ tam thất hoang 14 * Quy trình chiết xuất phân đoạn từ cao chiết TTH trình bày sau Cao chiết tổng (200,0g) 1.Hòa nước 2.Chiết với dung môi có độ phân cực khác 3.Thu hồi dung môi áp suất giảm - 10 mbar n- hexane (15,0g) n-butanol (48,98g) Nước (135,01g) Hình 3.10: Quy trình chiết xuất phân đoạn từ cao chiết tổng củ tam thất hoang 3.4.2 Xác định cấu trúc hợp chất tinh từ cao phân đoạn 3.4.2.1 Hợp chất H3C2 (T1) Cấu trúc T1 xác định phổ 1H NMR so sánh với tài liệu, kết luận T1 stigmasterol (Hình 3.15) Hình 3.15: Cấu trúc hợp chất T1 (stigmasterol) 3.4.2.2 Hợp chất H5A1 (T2) Hợp chất T2 xác định phổ 1H NMR GC-MS Kết T2 axit 5-dodecenoic O HO Hình 3.17: Cấu trúc hợp chất T2 (axit 5-dodecenoic) 15 3.4.2.3 Hợp chất H6A1 (T3) Hợp chất T3 (4 mg) dạng dầu, màu vàng, chiết tách từ phân đoạn H6A qua hệ thống sắc kí lỏng điều chế (prep HPLC) với hệ dung môi H:E=3:1, detector UV 254 nm Phổ ESI-FTICR-MS cho pic ion giả phân tử m/z 263,2006 [M+H]+ từ xác định công thức phân tử T3 C17H26O2 Phổ 1H NMR hình 3.18 cho thấy: - Ở vùng trường thấp có olefinic ptoron 5,76 ppm (d, J = 16 Hz) 6,32 ppm (dd, J = 5,5, 16,0 Hz) Chúng có J lớn 16 Hz chứng tỏ chúng gắn với cacbon mang liên kết đôi với cấu hình trans - Có hai vân 4,19 ppm 4,42 ppm đặc trưng cho cộng hưởng proton thuộc nhóm carbinol CH-OH - Ở vùng trường mạnh, δ từ 0,68 đến 2,31 ppm cộng hưởng CH3, CH2, hai tín hiệu 0,88 ppm 1,03 ppm gán cho proton nhóm metyl (-CH3); ba tín hiệu 1,29 ppm; 1,57 ppm 1,75 ppm gán cho proton nhóm metylen (-CH2-) Hình 3.18: Phổ 1H NMR hợp chất T3 16 Hình 3.19: Phổ 13C NMR hợp chất T3 Phổ 13C NMR hợp chất T3 có tín hiệu 18 cacbon, có 16 pic vùng trường mạnh (0 - 100 ppm) pic vùng trường trung bình (100 - 160 ppm) Kết hợp với phổ HSQC quy kết 18 cacbon bao gồm: - nguyên tử cacbon bậc (-CH3 ) cộng hưởng 9,33 ppm 14,1 ppm - nguyên tử cacbon bậc (-CH2 ) cộng hưởng 22,6 ppm; 25,2 ppm 29,2 ppm; 29,4 ppm; 29,8 ppm; 30,7 ppm; 31,8 ppm 36,9 ppm (nằm vùng từ 22 - 45 ppm) - nguyên tử cacbon nối ba (-C≡C-) cộng hưởng 71,0 ppm; 73,7 ppm; 77,3 ppm 83,0 ppm (nằm vùng từ 70 - 100 ppm) - nguyên tử cabon nối đôi (-CH=CH-) cộng hưởng 108,2 ppm; 149,7 ppm (nằm vùng từ 110 - 150 ppm) - nguyên tử cacbon đính với nhóm OH cộng hưởng 64,3 ppm 72,1 ppm → có nhóm CH3, nhóm CH2, nhóm CH nguyên tử C 17 Hình 3.20: Phổ HMBC hợp chất T3 Phổ HMBC hình 3.20 cho thấy tương tác xa C-H phân tử: Proton nhóm metyl (-CH3) (0,88 ppm) có tương tác với 2C nhóm metylen (-CH2-) (22,6 ppm 31,8 ppm) Proton nhóm metyl (CH3) lại (1,03 ppm) có tương tác với C nhóm metylen (-CH2-) (30,72 ppm) tương tác với C nhóm CH-OH (64,3 ppm) Proton nhóm metylen (-CH2-) (1,29 ppm) có tương tác với C nhóm metyl (-CH3) (14,1 ppm), C nhóm metylen (-CH2-) (31,8 ppm) Proton nhóm metylen (-CH2-) (1,57 ppm) có tương tác với C nhóm metylen (-CH2-) (29,4 ppm) C nhóm CH-OH (72,1 ppm) Proton nhóm metylen (-CH2-) (1,75 ppm) có tương tác với C nhóm metyl (-CH3) (9,33 ppm), C nhóm CH-OH (64,3 ppm) nhóm -C≡C- (77,3 ppm 83,0 ppm) Proton nhóm CH-OH (4,19 ppm) có tương tác với C nhóm olefin –CH=CH- (108,2 ppm) Proton nhóm –CH=CH- có tương tác với C nhóm CH-OH -C≡C- Từ phân tích đây, xác định cấu tạo T3 Heptadeca8-en-4,6-diyne-3,10-diol, chất tiến hành quy kết giá trị phổ bảng 3.30 Chúng chưa xác định cấu hình hai trung tâm bất đối C-3 C-10 Mặc dù cố gắng sử dụng phương pháp Mosher cải tiến tinh sản phẩm este mong muốn 18 OH 12 10 16 13 17 OH Hình 3.21: Heptadeca-8-en-4,6-diyne-3,10-diol Bảng 3.30: Các giá trị phổ hợp chất T3 13 H NMR (H, J in Hz) 1,05, t, 6,0 1,57, m; 1,74, m 4,42, t, 6,5 5,76, d, 16,0 6,32, dd, 5,5, 16,0 4,19, d, 6,5 1,57, m 1,29, m 1,29, m 1,29, m 1,29, m 1,29, m 0,88, t, 7,0 10 11 12 13 14 15 16 17 C NMR (C) 9,33 30,7 64,3 82,9 71,0 73,7 77,3 108,2 149,7 72,1 37,0 25,2 29,4 29,8 31,8 22,6 14,1 3.4.2.4 Hợp chất H6A2 (T4) Hợp chất T4 xác định 1,8-octadecadiene-4,6-diyn-3,10-diol (stipudiol) phổ 1D 2D NMR với cấu trúc sau OH Ha Hb 12 10 11 13 14 15 16 18 17 OH Hình 3.25: Cấu trúc stipudiol (T4) 3.4.2.5 Hợp chất HAB2A3 (T5) Từ kết phân tích phổ kết hợp so sánh với tài liệu kết luận hợp chất T5 5-hydroxymetylfurfural có công thức hình 3.30 sau: 19 Hình 3.30: Cấu trúc 5-hydroxymetylfurfural 3.4.2.6 Hợp chất HAB2C3 (T6) Từ kết phân tích phổ 1D 2D NMR kết hợp với tài liệu tham khảo, kết luận hợp chất T6 hợp chất Panaxytriol có công thức hình 3.35 sau: OH 14 12 OH OH 16 10 11 13 15 17 Hình 3.35: Cấu trúc hợp chất Panaxytriol Kết luận: Đã xác định cấu trúc hợp chất tinh từ cao phân đoạn củ tam thất hoang (Panax stipuleanatus) 3.4.5 Hoạt tính kháng khuẩn độc tính tế bào chất tinh Bảng 3.34 Hoạt tính kháng số vi sinh vật chất tinh cao phân đoạn củ tam thất hoang môi trường lỏng Nồng độ ức chế 50% phát triển vi sinh vật - IC50 ( g/ml) Gram (+) Gram (-) Nấm S B L S E P C aureus subtilis fermentum enterica coli aeruginosa albican T3 25,6 128 >128 >128 >128 >128 >128 T4 128 128 >128 >128 >128 >128 >128 T5 25,6 >128 >128 >128 >128 >128 >128 T6 >128 128 >128 >128 >128 >128 >128 Bảng 3.35 Kết kháng dòng tế bào KB chất tinh củ tam thất hoang Mẫu STT Tên mẫu T3 T4 T5 T6 Ellipticin Giá trị IC50 (µg/ml); KB 10,05 8,11 101,97 14,57 0,31 20 Từ việc thử hai hoạt tính kháng khuẩn hoạt tính kháng ung thư chất tinh cao chiết xuất từ củ tam thất hoang cho thấy cao phân đoạn n-hexane chất tinh phân lập từ cao phân đoạn có tác dụng tốt so với cao phân đoạn n-butanol chất tinh phân tách từ cao phân đoạn 3.5 Độc tính chuột thí nghiệm - liều an toàn Bảng 3.36: Kết thử độc tính chuột thí nghiệm mẫu bột củ tam thất hoang Stt Liều dùng( g/kg thể trọng) 0,5 1,0 2,5 5,0 (%) chuột chết 6,7 30,0 56,7 100 Từ kết bảng xác định LD50 mẫu thử 1,65g/kg thể trọng Khi xác định LD50 liều an toàn để thử nghiệm dược lý 1/10 LD50 loại động vật đường dùng thuốc Vậy ta xác định liều tương đối an toàn dùng cho thử nghiệm dược lý ban đầu 0,16g/kg thể trọng Liều dùng an toàn đưa 0,16g/kg/ngày 3.6 Ứng dụng tam thất hoang sản xuất thực phẩm Từ bột cao chiết tổng củ tam thất hoang đưa vào ứng dụng sản xuất thử nghiệm 04 sản phẩm: bánh cookie tam thất, nước tam thất mật ong, kẹo cứng tam thất trà tam thất hoa cúc Kết thu thập xử lý thuật toán ANOVA phân tích phương sai cho hai yếu tố để kiểm tra thị hiếu chọn công thức tối ưu cho sản phẩm *Nghiên cứu bổ sung chế phẩm cao tam thất vào sản phẩm kẹo cứng Sử dụng công thức làm kẹo cứng để tiến hành bổ sung cao tam thất vào sản phẩm Tiến hành đánh giá cảm quan so sánh cặp để tìm, xác định ngưỡng phân biệt lượng cao tối thiểu bổ sung vào sản phẩm kẹo để người thử cảm nhận mùi vị đặc trưng Đánh giá cảm quan 10 người cho bảng tổng hợp xử lý kết bảng 3.45 21 Bảng 3.45 Kết phép thử so sánh cặp đôi với sản phẩm kẹo cứng tam thất Lượng cao (g) bổ sung - 0,3g - 0,45g 0,3 - 0,5g 0,5 - 1,0g Kí hiệu E = F = nhiều E F E F E F E F Số câu trả lời Đắng Nhạt 13 15 12 15 13 15 12 15 Giá Giá trị trị χ2tc χ2 Kết luận 3,6 Không phân biệt 10 Phân biệt 3,81 1,6 Không phân biệt 10 Phân biệt *Nghiên cứu thị hiếu ngƣời tiêu dùng sản phẩm kẹo cứng tam thất Sau làm kẹo cứng bổ sung tam thất theo tỉ lệ xác định (0,5; 1,0; 1,5 2,0g/100g kẹo), tiến hành đánh giá cảm quan thị hiếu người tiêu dùng sản phẩm kẹo Tổng hợp số liệu thu xử lý phân tích phương sai (ANOVA) cho hai yếu tố thu kết bảng 3.46 Bảng 3.46 Kết phân tích thị hiếu với sản phẩm kẹo cứng tam thất Sản phẩm Tính chất 1,0g 1,5g 2,0g Giá trị (p) Vị đắng 3,82a 5,32b 6,20c 4,42a 3,17.10-12 Vị 4,72a 5,70c 6,17b 6,32b 8,34.10-12 Trạng thái 3,75a 4,18a 4,77b 4,77b 7,66.10-9 4,12a 5,67b 6,80c 7,65d 1,81.10-30 6,48c 3,60.10-16 Màu sắc 0,5g Điểm thị hiếu chung 4,32a 5,45b 5,38c (Chú thích: Các mẫu khác số mũ khác với p