Nghiên Cứu Sản Xuất Men Rượu Từ Nấm Men Và Hệ Enzyme Amylase Trong Mầm Lúa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT MEN RƯỢU TỪ NẤM MEN VÀ HỆ ENZYME AMYLASE TRONG MẦM LÚA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: SINH VIÊN THỰC HIỆN: TS NGÔ THỊ PHƯƠNG DUNG Viện NC&PT Công nghệ Sinh học BÙI DUY NHÂN Lớp: Công nghệ Sinh học K32 CẦN THƠ, THÁNG 05/2010 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS NGÔ THỊ PHƯƠNG DUNG BÙI DUY NHÂN DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2010 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ LỜI CẢM ƠN Hoàn thành đề tài luận văn tốt nghiệp phần quan trọng đánh giá tiến hoàn thiện sinh viên đại học Quá trình làm luận văn khoảng thời gian dài kiểm tra lại kiến thức, học hỏi trau dồi kỹ năng, hành trang quan trọng để bước vào công việc thực tế Trong q trình thực luận văn, tơi nhận nhiều hỗ trợ, động viên từ phía gia đình, thầy cơ, anh chị hướng dẫn bạn bè Mọi người tiếp thêm niềm tin, nghị lực để tơi vượt qua khó khăn hồn thành luận văn Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến: - Cô Ngô Thị Phương Dung anh Huỳnh Xuân Phong tận tình hướng dẫn kiến thức, kỹ động viên tinh thần cho tơi suốt q trình thực luận văn - Các thầy cô, anh chị hướng dẫn phịng thí nghiệm Viện NC&PT CNSH tận tình hỗ trợ trang thiết bị cho tơi hồn thành luận văn - Các thầy truyền đạt kiến thức cho năm học tập mái trường đại học - Chị Nhan Thanh Thúy, bạn Nguyễn Duy Tiến hỗ trợ cho tơi hồn thành tiêu quan trọng luận văn - Các thầy cô, anh chị cao học, bạn sinh viên công tác học tập Viện NC&PT CNSH thăm hỏi động viên tơi suốt q trình thực luận văn - Cô Trần Thị Xuân Mai, Thầy Trần Nguyên Tuấn bạn sinh viên lớp Cơng nghệ Sinh học khóa 32 chỗ dựa tinh thần, nguồn động viên to lớn, tạo điều kiện thuận lợi hoạt động học tập, giúp hoàn thành tốt luận văn nhiệm vụ khác - Những người thân gia đình tơi cảm thơng, chia sẽ, giúp tơi an tâm có lịng tin hoàn thành năm đại học thực luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn Chúc người sức khỏe thành đạt Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ TĨM TẮT Những ăn thức uống lên men góp phần quan trọng để tạo nên phong phú đa dạng cho văn hóa ẩm thực Rượu thức uống lên men phổ biến gắn liền với đời sống người dân Việt Nam Sản xuất thành công loại men rượu có hiệu suất cao rút ngắn thời gian lên men phương pháp khả quan việc hạn chế tình trạng rượu chất lượng thị trường Với mục tiêu trên, đề tài, “Nghiên cứu sản xuất men rượu từ nấm men hệ enzyme amylase mầm lúa” thực Kết xác định mật số nấm men loại men rượu thị trường đạt từ 7,49 đến 10,23 log cfu/g, đồng thời phân lập 26 dòng nấm men Từ thí nghiệm so sánh khả lên men ethanol dòng men sơ tuyển dòng men mạnh từ loại men tiến hành so sánh với dòng men Saccharomycese cerevisiae Kết chọn dòng men S cerevisiae làm nguồn men giống cho bột men Đề tài khảo sát biến đổi lượng enzyme amylase mầm lúa qua ngày ủ, mầm lúa có hoạt tính enzyme cao sau ngày ủ (9,0 U/g) Ngoài bước đầu thử nghiệm sản xuất bột men có khả lên men rượu phương pháp phối trộn bột men bột mầm lúa theo tỉ lệ định Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC PHẦN KÝ DUYỆT LỜI CẢM ƠN TÓM TẮT i MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG iv DANH SÁCH HÌNH v Chương 1: GIỚI THIỆU Chương 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Hệ vi sinh vật men làm rượu 2.1.1 Hệ vi sinh vật men rượu cổ truyền 2.1.2 Hệ vi sinh vật men rượu thị trường 2.2 Q trình đường hóa q trình lên men rượu 2.2.1 Q trình đường hóa 2.2.2 Quá trình lên men rượu 2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nấm men trình lên men rượu 2.3 Quy trình sản xuất rượu gạo truyền thống 2.4 Quy trình sản xuất men rượu 11 2.4.1 Quy trình sản xuất men rượu cổ truyền 11 2.4.2 Các loại men truyền thống 13 2.5 Hệ enzyme amylase hạt malt 13 2.5.1 Giới thiệu chung hệ enzyme amylase 13 2.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến enzyme amylase trình đường hóa….14 Chương 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1 Phương tiện nghiên cứu 16 3.1.1 Nguyên liệu 16 3.1.2 Hóa chất 16 3.1.3 Môi trường phân lập nấm men 16 3.1.4 Thiết bị - dụng cụ 16 3.2 Phương pháp nghiên cứu 17 3.2.1 Thí nghiệm 1: Thu thập đánh giá loại men rượu thị trường 17 3.3.2 Thí nghiệm 2: Phân lập ghi nhận hình ảnh dịng nấm men 17 3.2.3 Thí nghiệm 3: So sánh tuyển chọn dịng nấm men có khả lên men ethanol mạnh 18 3.2.4 Thí nghiệm 4: Xác định hoạt tính hệ enzyme amylase mầm lúa 20 3.2.5 Thí nghiệm 5: Sản xuất bột men gồm nấm men enzyme amylase 20 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ 3.2.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát khả lên men bột men gồm nấm men enzyme amylase 22 3.3 Phương pháp phân tích 24 3.3.1 Khả lên men rượu nấm men S cerevisiae từ dịch đường hóa 24 3.3.2 Thử nghiệm sản xuất bột men 24 3.3.3 Phương pháp xác định mật số nấm men 24 3.3.4 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme amylase 24 3.3.5 Phương pháp phân tích thống kê 24 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 25 4.1 Thí nghiệm 1: Thu thập đánh giá loại men thị trường 25 4.2 Thí nghiệm 2: Phân lập dòng nấm men từ loại men thị trường 25 4.3 Thí nghiệm 3: So sánh khả lên men ethanol tuyển chọn dòng nấm men tốt 26 4.3.1 Thí nghiệm so sánh khả lên men ethanol 26 4.3.2 Thí nghiệm so sánh khả lên men ethanol dòng men chọn dòng men S cerevisiae 28 4.4 Thí nghiệm 4: Xác định hoạt tính hệ enzyme amylase q trình lên mầm lúa 31 4.5 Thí nghiệm 5: Sản xuất bột men gồm nấm men enzyme amylase 32 4.5.1 Sản xuất bột men 32 4.5.2 Sản xuất bột mầm lúa 32 4.5.3 Thử nghiệm sản xuất bột men gồm nấm men enzyme amylase 32 4.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát khả lên men bột men gồm nấm men enzyme amylase 32 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 5.1 Kết luận 35 5.2 Kiến nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC 1: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ PHỤ LỤC 3: HÌNH ẢNH CÁC DỊNG NẤM MEN PHÂN LẬP PHỤ LỤC 4: BẢNG KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Bố trí thí nghiệm khảo sát khả lên men bột men gồm nấm men enzyme amylase 23 Bảng Mật số nấm mốc, nấm men loại men rượu thị trường 25 Bảng 3: Chiều cao trung bình cột khí CO (cm) 26 dòng men 27 Bảng 4: Kết đo độ cồn mẫu 20oC sau 48 lên men 30 Bảng 5: Độ cồn 20oC sau lên men mẫu 33 Bảng 6: Phân tích phương sai ảnh hưởng dịng nấm men đến độ cồn PL2 Bảng 7: Kiểm định LSD 95% ảnh hưởng dòng nấm men đến độ cồn PL2 Bảng 8: Phân tích phương sai ảnh hưởng ngày ủ đến hoạt tính enzyme mầm lúa PL2 Bảng 9: Kiểm định LSD ảnh hưởng ngày ủ đến hoạt tính enzyme mầm lúa PL2 Bảng 10: Hoạt tính enzyme amylase qua ngày ủ PL4 Bảng 11: Kết dựng đường chuẩn phương pháp Nelson phương trình đường chuẩn PL4 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Lộ trình đường phân Hình 2: Quy trình sản xuất men rượu cổ truyền 11 Hình Quy trình tổng quát sản xuất men rượu đế 12 Hình 4: Sơ đồ trình thực thí nghiệm xác định mật số nấm men 15 Hình 5: Sơ đồ thí nghiệm so sánh khả lên men 20 Hình 6: Quy trình sản xuất bột men 21 Hình 7: Sơ đồ thí nghiệm khảo sát khả lên men bột men gồm nấm men enzyme amylase 23 Hình 8, 9: Dịng men Y2 Linh Chi, Y2 Dung-Đức Thành 26 Hình 10, 11: Dịng men Y2 Hải Anh Quang, Y3 Hồng Anh 26 Hình 12: Biểu đồ chiều cao cột khí CO2 (cm) theo thời gian dịng men 29 Hình 13: Biểu đồ so sánh khả lên men dòng 29 Hình 14: Hoạt tính enzyme trung bình (U/g) mầm thóc qua ngày ủ 31 Hình 15: Lượng bọt khí CO2 theo thời gian 32 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ Chương 1: GIỚI THIỆU Thưởng thức rượu phần tách rời sinh hoạt văn hóa, lễ hội giao tiếp người Việt Nam Rượu nét văn hóa mang đậm sắc riêng dân tộc vùng Ở nông thôn nước ta, đặc biệt nơng thơn Nam Bộ, rượu cịn phương tiện bày tỏ lòng hiếu khách người dân Tại nhiều nơi nước ta, tên địa phương dùng để đặt cho loại rượu ngon đặc trưng vùng, kể loạt tên rượu địa phương Kim Sơn, Làng Vân, Mẫu Sơn, Thổ Hà, Tạnh Xá, Nga Sơn, Kim Long, Làng Chuồn, Đá Bạc, Bồng Sơn, Bàu Đá, Gò Đen, Phú Lễ, Xuân Thạnh, Tân Lộc, Văn Điển, Bó Nặm, Trương Xá, Phú Lộc, Đại Lâm,… Đặc biệt, Đồng Sông Cửu Long vùng có nghề sản xuất rượu lâu đời gắn liền với địa danh thương hiệu tiếng từ xưa rượu Phú Lễ (Bến Tre), rượu đế Gò Đen (Long An), Nhị Quý (Tiền Giang) Nguyên liệu để nấu rượu thường gạo, nếp, sắn (khoai mì) Mỗi loại nguyên liệu tạo thành hương vị đặc trưng rượu Rượu gạo loại rượu phổ biến Việt Nam Mỗi sản phẩm rượu có cơng thức đặc trưng riêng mang đậm tính thủ cơng truyền thống Nhưng lí mà suất rượu làm không ổn định chất lượng sản phẩm rượu số nơi chưa đạt tiêu chuẩn Rượu Nhà nước quy định (TCVN 7043:2002), đặc biệt tiêu chất lượng hóa lý, vi sinh an tồn thực phẩm Chính mà sản phẩm rượu truyền thống vốn tiếng từ lâu đời mở rộng để phục vụ rộng rãi cho người tiêu dùng nước, xuất thị trường nước ngồi Do đó, cần hồn thiện quy trình cơng nghệ sản xuất rượu cách khoa học cải tiến chất lượng sản phẩm rượu thành phẩm; từ sản xuất sản phẩm đạt chất lượng an toàn cho người tiêu dùng, mở rộng quy mơ sản xuất, góp phần tích cực cải thiện thu nhập nâng cao đời sống cho phần đông người lao động địa phương Một số nghiên cứu khoa học gần xác định hệ vi sinh vật men rượu giữ vai trò quan trọng trình sản xuất rượu, ảnh hưởng trực tiếp đến suất chất lượng sản phẩm Việc sử dụng nguồn giống vi sinh vật chủng có hoạt tính cao q trình lên men rượu cần thiết Song song đó, việc bổ sung chế phẩm enzyme có nguồn gốc từ thiên nhiên để thay phần vai trò nấm mốc viên men bước đầu cho kết khả quan việc ổn định suất Chuyên ngành Công Nghệ Sinh học Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ rượu thành phẩm rút ngắn thời gian sản xuất Điển hình viên men rượu sử dụng thị trường nay: nấm men Saccharomyces bổ sung chế phẩm chứa hệ enzyme amylase Như vậy, vấn đề “nguồn giống vi sinh vật chủng, có hoạt tính cao” “hiệu hệ enzyme thay thế” chúng tơi đề xuất thực đề tài “Nghiên cứu sản xuất men rượu từ nấm men hệ enzyme amylase mầm lúa” Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu đề tài khảo sát thành phần nguồn men thị trường bước đầu nghiên cứu sản xuất bột men gồm nấm men enzyme Để thực mục tiêu trên, đề tài tiến hành thông qua bước sau:  Thu thập đánh giá loại men dùng thị trường  Phân lập tuyển chọn dòng nấm men loại men  So sánh dòng men phân lập với dòng nấm men Saccharomyces cerevisiae Viện NC&PT CNSH, chọn dòng nấm men tốt  Xác định hoạt tính hệ enzyme amylase q trình lên mầm lúa  Nghiên cứu quy trình sản xuất bột men cách kết hợp sử dụng dòng nấm men có hoạt tính cao hệ enzyme amylase mầm lúa  Bước đầu khảo sát khả lên men rượu bột men thành phẩm Chuyên ngành Công Nghệ Sinh học Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 4: Kết đo độ cồn mẫu 20oC sau 48 lên men SỐ LIỆU ĐO ĐỘ CỒN Ở 20oC SAU 48H LÊN MEN Lần Lần Lần TRUNG BÌNH Y3HA 9,0 9,5 8,0 8,83b Y2HAQ 9,5 9,5 9,5 9,50ab Y2LC 9,5 9,0 9,0 9,17ab Y1QM 8,5 9,5 9,5 9,17ab SAC 9,5 10,0 9,5 9,67a Y2DĐT 9,0 9,0 9,5 9,17ab Ghi chú:: Các giá trị trung bình có mẫu tự khơng khác biệt mức độ ý nghĩa 5% Dựa kết độ cồn sinh sau 48 lên men 20oC Bảng nhận thấy dòng men S cerevisiae cho độ cồn cao (trung bình 9,67%) khác biệt khơng ý nghĩa so với dòng men lại (8,83-9,50%) Nhận xét chung: Dịng men Y2DĐT có q trình lên men nhanh độ cồn sinh không cao, mức trung bình Ngun nhân dịng men chịu ảnh hưởng nồng độ cồn định Nồng độ cồn gây ức chế trình lên men nên dịng men Y2DĐT khơng cho độ cồn cao Dịng men S cerevisiae Y2HAQ cho kết tốt, hiệu suất lên men tương đối cao Chứng tỏ hai dòng men lên men chậm hiệu suất cao Từ kết thí nghiệm, chọn dịng men S cerevisiae tiến hành với thí nghiệm dùng làm nguồn giống cho bột men gồm nấm men enzyme amylase Đây dòng men nghiên cứu chứng nhận an toàn lên men thực phẩm Chuyên ngành Công Nghệ Sinh học Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 30 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ 4.4 Thí nghiệm 4: Xác định hoạt tính hệ enzyme amylase q trình lên mầm lúa Thí nghiệm tiến hành khảo sát hoạt tính hệ enzyme amylase mầm lúa qua ngày ủ lên mầm Đồng thời so sánh với hoạt tính enzyme bột men gồm nấm men enzyme amylase 10 9.00a Hoạt tính enzyme (U/g) b 6.06 b 6.31 5.23 bc 5.10 bc 3.97 cd d 2.54 1 Ngày Hình 14: Hoạt tính enzyme trung bình (U/g) mầm thóc qua ngày ủ Ngày ủ lên mầm hoạt tính enzyme mầm thóc thấp Hoạt tính enzyme tăng dần từ ngày cao ngày thứ (trung bình 9,0 U/g) Sau ngày thứ hoạt tính enzyme bắt đầu giảm So với hàm lượng enzyme có 5g chất khơ bột men thị trường (21,96 U/g) lượng enzyme mầm lúa ngày cao thấp nhiều lần (2,44 lần) Theo kết Hình 14, hoạt tính enzyme mầm lúa ngày ủ khác biệt có ý nghĩa độ tin cậy 99% so với hoạt tính enzyme ngày cịn lại nên chọn để tiến hành thí nghiệm sản xuất bột mầm lúa Tuy nhiên, cần khảo sát tỷ lệ phối trộn mầm lúa bột men để đạt lượng enzyme có bột men thị trường cao 4.5 Thí nghiệm 5: Sản xuất bột men gồm nấm men enzyme amylase 4.5.1 Sản xuất bột men Nấm men ni bình 250ml với 100ml mơi trường, dịch huyền phù nấm men sau thời gian nuôi cấy trộn với bột gạo với tỷ lệ 1:1, sấy khô 40oC xay nhỏ Bột men trữ điều kiện nhiệt độ môi trường tự nhiên chứa bọc PP, ép miệng Chuyên ngành Công Nghệ Sinh học Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 31 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ 4.5.2 Sản xuất bột mầm lúa Bột mầm lúa sản xuất sở kết thí nghiệm Lúa rửa sạch, ngâm ủ ngày theo quy trình lên mầm lúa giống nơng hộ Sau mầm lúa ngày ủ mang sấy khô 40oC ngày.sau mang nghiền Bột mầm lúa trữ điều kiện nhiệt độ môi trường tự nhiên chứa bọc PP, ép miệng 4.5.3 Thử nghiệm sản xuất bột men gồm nấm men enzyme amylase Bột men gồm nấm men enzyme amylase thử sản xuất sở phối trộn bột men bột mầm lúa với tỷ lệ thích hợp Bột men trữ điều kiện nhiệt độ môi trường tự nhiên chứa bọc PP, ép miệng 4.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát khả lên men bột men gồm nấm men enzyme amylase Bột men bột mầm lúa khảo sát tỷ lệ phối trộn tương ứng 1:3; 1:4; 1:5 Đồng thời bố trí phương pháp lên men khác để tiến hành khảo sát khả lên men bột men gồm nấm men enzyme Các mẫu thí nghiệm so sánh lượng bọt khí CO2 sinh sau 12 ngày đo độ cồn sau ngày 30 25 Bọt khí 20 15 10 12 24 B1 A1 36 B1 A2 48 B1 A3 60 B2 A1 B2 A2 72 Thời gian (giờ) B2 A3 Hình 15: Lượng bọt khí CO2 theo thời gian Ở mẫu B1, chênh lệch lượng bọt khí tỷ lệ phối trộn bột men : bột mầm lúa không cao Quá trình lên men diễn tốt 12 24h, điều thể phương thức chan nước trực tiếp sau trình trộn men phát huy tác dụng enzyme nấm men thích nghi với phương thức Ở mẫu B2 sau ngày ủ hiếu khí ta nhận có khác biệt lượng bọt khí sinh tỷ lệ bột men : bột mầm Chuyên ngành Công Nghệ Sinh học Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 32 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ lúa Tỷ lệ 1:4 cho kết bọt khí tương đối cao sau 12h chan nước Quá trình kết thúc lên men nghiệm thức xảy thời gian Bảng 5: Độ cồn 20oC sau lên men mẫu Độ rượu 20oC sau lên men Nhân tố A Nhân tố B n=1 n=2 n=3 Trung bình B1 6 5,7 B2 5 5,3 B1 6 5,7 B2 6 6,0 B1 6,0 B2 6,3 A1 A2 A3 * Ghi A1: tỷ lệ phối trộn bột men : bột mầm lúa 1:3 A2: tỷ lệ phối trộn bột men : bột mầm lúa 1:4 A3: tỷ lệ phối trộn bột men : bột mầm lúa 1:5 B1: phương pháp lên men chan nước trực tiếp sau trộn men B1: phương pháp lên men chan nước ngày sau trộn men Độ rượu phương thức lên men tỷ lệ phối trộn bột men : bột mầm lúa khác biệt không ý nghĩa Lượng rượu sinh thấp tất mẫu Ở nghiệm thức B1 sau ngày lên men sản phẩm có mùi khó chịu chua, chứng tỏ sau trình lên men rượu xảy trình lên men lactic Có khả lượng rượu thất q trình lên men chua Lượng dịch lên men sản phẩm nhiều lượng chất bị phân hủy tương đối Nghiệm thức B2 sau ngày chan nước sản phẩm có hương cơm rượu đặc trưng, lượng chất chưa sử dụng hết lượng dịch lên men sinh không nhiều Điều chứng tỏ nấm men hoạt động lượng enzyme không phát huy tác dụng Do thời gian thí nghiệm khơng cho phép nên chưa khảo sát phương thức lên men tối ưu tỷ lệ phối trộn bột men bột mầm lúa tốt Chuyên ngành Công Nghệ Sinh học Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 33 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Các loại men rượu thị trường có mật số nấm men trung bình khoảng 7,4910,23 log cfu/g, nấm mốc 5,93-7,61 log cfu/g hoạt tính enzyme loại men ngẫu nhiên (men Quang Minh) 21,96 U/g Phân lập 26 dòng men từ loại men thị trường Sơ tuyển dịng men có khả lên men cao từ dòng men phân lập So sánh tuyển chọn dòng men S cersvisiae làm nguồn giống sản xuất bột men Mầm lúa ủ ngày cho hoạt tính enzyme cao (9,00 U/g) chọn làm bột mầm lúa Bước đầu sản xuất bột men gồm nấm men enzyme amylase có khả lên men ethanol cách phối trộn bột men bột mầm mầm lúa 5.2 Kiến nghị Nghiên cứu điều kiện tối ưu để sản xuất bột mầm lúa có hoạt tính enzyme cao Nghiên cứu tỷ lệ phối trộn bột men bột mầm lúa, kết hợp rút ngắn thời gian lên men men gồm nấm men enzyme amylase nhằm nâng cao hiệu kinh tế trình chưng cất rượu Khảo sát khả phối trộn enzyme amylase công nghiệp vào bột men gồm nấm men enzyme amylase Chuyên ngành Công Nghệ Sinh học Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 34 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi Ái 2005 Công nghệ lên men ứng dụng Công nghệ thực phẩm, Nhà xuất Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Hồ Sưởng, Lương Đức Phẩm, Lê Văn Tố Nguyễn Thị Hoa 1982 Vi sinh vật bảo quản chế biến thực phẩm, Nhà xuất nông nghiệp, TP Hồ Chí Minh Hồng Vĩ Tài 2006 Nghiên cứu sản xuất nấm mốc nấm men lên men rượu, Luận án Thạc sĩ Khoa học ngành Công nghệ sinh học, Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ sinh học, Đại học Cần Thơ Huỳnh Tố Quyên 2006 Khảo sát khả lên men tính chịu cồn nấm men, Luận văn tốt nghiệp Đại học ngành Công Nghệ Sinh Học, Đại học Cần Thơ Nguyễn Đình Thưởng Nguyễn Thanh Hằng 2005 Công nghệ sản xuất kiểm tra cồn etylic, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Đức Lượng (1998), Công nghệ vi sinh vật, Tập 3, Nhà xuất Đại học Kỹ thuật TP Hồ Chí Minh Tiếng Anh Casey, G.P and W.M.Ingledew 1986 Ethanol tolerance in yeast, Micobiol., Vol 13, pp219-280 Dung N.T.P 2004 Defined fungal starter granules for purple glutinous rice wine, ISBN: 90-8504-099-X, Doctoral Thesis, Wageningen University, The Netherlands Dung N.T.P, F.M Rombouts, M.J.R Nout 2005 Development of defined mixedculture fungal fermentation starter granulate for controlled production of rice wine Innovative Food Science and Emerging Technology 6, pp429 – 441 Navaro et al 1982 Saccharomyces uvarum hexokinase behavior during alcoholic fermentation, cell Mol Biol., pp18, 85 Nout, Rob et al 1999 Food fermentation, Wageninger Agricultural University Trang web: Nguồn http://vi.wikipedia.org/wiki/Rượu_trắng (2/1/2010) Nguồn http://tuyluy.com/index.php?mod=article&cat=Lichsuruu&article=119 (2/1/2010) Chuyên ngành Công Nghệ Sinh học Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 35 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC 1: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Phương pháp xác định hoạt tính hệ enzyme amylase thuốc thử Nelson (1942): a Chuẩn bị hóa chất - Dung dịch đệm Maleic: hịa tan 11,6g acid maleic 900ml nước cất chỉnh pH 6,0 NaOH, thêm 0,74g CaCl2.H2O, chỉnh pH 6,0 sau đưa thể tích lít - Tinh bột 1% (w/v) (tinh bột hòa tan nước, đun nóng khuấy hồ hóa hồn tồn (dung dịch trong, khơng lắng cặn)) - Tinh bột 1% hòa tan dung dịch đệm maleic pH 6,0 - 2% (w/v) Tris-baz - Sodium phosphate buffer 0.2M (Na2HPO4/NaH2PO4) với dãy pH tăng dần từ 5,0-8,0 - Thuốc thử Đồng: Hỗn hợp A1 : A2 = 4:1  A1: hòa tan 15g K-Na-tartrate.4 H2O (muối Rochelle) 30g Na2CO3 (khan) vào 300ml H2O Thêm 20g NaHCO3 Hòa tan 180g Na2SO4 (khan) 500ml H2O nóng đun sơi để loại khí Trộn dung dịch sau làm nguội đưa thể tích lít nước cất  A2: Hòa tan 5g CuSO4.5H2O 45g Na2SO4 khan 250ml nước cất - Thuốc thử Arsenomolybdate: hỗn hợp B3 : B4 = 1:2  B1: 26,5g (NH4)6Mo7O24.4H2O 450ml H2O Vừa khuấy vừa thêm 21ml H2SO4 đậm đặc  B2: 3g Na2HAsO4.7H2O 25ml H2O  B3: Hòa trộn B1 B2 với nhau, để tủ ủ 37oC thời gian từ 24 đến 48 bảo quản tối  B4: 41ml H2SO4 đậm đặc lít nước cất ta thu H2SO4 1.5 N - 100mM dung dịch đệm Sodium Acetate pH 5.0 - Dung dịch chuẩn Glucose 0-1mM 50mM dung dịch đệm Sodium Acetate pH 5,0 b Cách tiến hành: Dựng đường chuẩn glucose: Chuyên ngành Công Nghệ Sinh học Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 36 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ  Pha dung dịch đường chuẩn: chuẩn bị ống nghiệm, cho vào ống thành phần chất theo bảng sau: [Glucose](mM) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 0,0ml 0,2ml 0,4ml 0,6ml 0,8ml 1,0ml Âmc pH 5,0 1ml 0,8ml 0,6ml 0,4ml 0,2ml 0ml Tổng thể tích 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml Dung dịch glucose (1mM)  Dựng đường chuẩn: chuẩn bị dãy ống eppendorf (lặp lại lần) [Glucose](mM) 0,0mM 0,2mM 0,4mM 0,6mM 0,8mM 1,0mM Dung dịch glucose 150l 150l 150l 150l 150l 150l Thuốc thử Đồng 150l 150l 150l 150l 150l 150l Đun sôi 10 phút, để nguội nhiệt độ phòng Thuốc thử Arseno-molybdate 150l 150l 150l 150l 150l 150l 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml Nước cất Ủ 20 phút Ly tâm có cặn, đo quang phổ bước sóng 520nm  Ghi nhận kết Vẽ biểu đồ đường chuẩn Tính tốn kết quả:  Đơn vị hoạt tính enzyme 1ml enzyme tính theo cơng thức:  a *Vt   * k U    T * VE  Trong U: hoạt tính enzyme (U/ml) X: Hàm lượng glucose dung dịch đo T: thời gian phản ứng (120 phút) VE: Thể tích enzyme (300l) k: hệ số pha lỗng  Đơn vị hoạt tính riêng enzyme (hoạt tính đặc hiệu) số đơn vị hoạt tính 1mg protein U/mg Chuyên ngành Công Nghệ Sinh học Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 37 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ Phương pháp sản xuất sinh khối nấm men Sinh khối nấm men nuôi môi trường lỏng gồm hai giai đoạn: - Chuẩn bị giống chủng: giống chủng nuôi môi trường khoai tây glucose bình tam giác loại 250 ml với thể tích mơi trường ni cấy 50 ml, đậy nút gòn nắp giấy, tiệt trùng 121 oC 15 phút để nguội đến 30-40oC, dùng que cấy chủng nấm men (lấy khoảng đầu kim cấy) từ ống men giống nuôi cấy môi trường thạch nghiêng PGA sau ngày ủ 30 oC Bình mơi trường sau chủng giống đậy nút gòn, nắp giấy lắc qua đêm máy lắc 16 (từ 16 chiều hơm trước đến sáng hơm sau) thu hoạch sử dụng trữ tủ lạnh 4oC - Sản xuất sinh khối nấm men: sử dụng môi trường PG môi trường nuôi giống chủng để nuôi sinh khối nấm men với khối lượng lớn ni bình 20 lít có cánh khuấy Bình mơi trường sau tiệt trùng 121oC, 15 phút, để nguội đến 30 - 40 oC tiến hành chủng giống, tỉ lệ giống chủng 1% so với thể tích mơi trường ni cấy Bình mơi trường sau chủng giống khuấy qua đêm máy khuấy 16 (từ 16 chiều hôm trước đến sáng hôm sau) thu hoạch Sinh khối nấm men dịch huyền phù sau thời gian nuôi cấy thu hoạch cách ly tâm 7000 vòng/phút 20 phút 4oC Sinh khối nấm men sau thu hoạch có dạng khối nhão (paste) trộn với bột gạo sấy khử trùng 100oC 17 làm nguội đến 30-40 oC Tỉ lệ phối trộn sinh khối nấm men bột gạo 1:1,5 theo khối lượng Trộn sấy khô 42oC Thời gian sấy xác định dựa thay đổi khối lượng mẫu đại diện g đựng đĩa petri sấy đồng thời đến khối lượng không đổi Men khô sau sấy xay nhỏ thành bột Chuyên ngành Công Nghệ Sinh học Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 38 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ Kết phân tích thống kê thí nghiệm 1.1 Bảng 6: Phân tích phương sai ảnh hưởng dòng nấm men đến độ cồn ANOVA Table for DO CON by MAU Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1.29167 0.258333 1.33 0.3166 Within groups 2.33333 12 0.194444 Total (Corr.) 3.625 17 1.2 Bảng 7: Kiểm định LSD 95% ảnh hưởng dòng nấm men đến độ cồn Multiple Range Tests for DO CON by MAU -Method: 95.0 percent LSD MAU Count Mean Homogeneous Groups -Y3HA 8.83333 X Y2DDT 9.16667 XX Y1QM 9.16667 XX Y2LC 9.16667 XX Y2HAQ 9.5 XX SAC 9.66667 X Kết phân tích thống kê thí nghiệm trang 31 2.1 Bảng 8: Phân tích phương sai ảnh hưởng ngày ủ đến hoạt tính enzyme mầm lúa ANOVA Table for HT ENZYME by NGAY Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 73.725 12.2875 17.71 0.0000 Within groups 9.71413 14 0.693867 Total (Corr.) 83.4391 20 2.2 Bảng 9: Kiểm định LSD ảnh hưởng ngày ủ đến hoạt tính enzyme mầm lúa Multiple Range Tests for HT ENZYME by NGAY -Method: 95.0 percent LSD NGAY Count Mean Homogeneous Groups -1 2.53667 X 3.97 XX 5.1 XX 5.23333 XX 6.05667 X 3 6.30667 X 9.00333 X Chuyên ngành Công Nghệ Sinh học Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 39 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC 3: HÌNH ẢNH CÁC DỊNG NẤM MEN PHÂN LẬP Các dịng nấm men phân lập từ men thị trường 1.1 Các dòng men phân lập từ men rượu Quang Minh Hình : Dịng men Y1QM Hình : Dịng men Y2QM Hình : Dịng men Y3QM Hình : Dịng men Y4QM Hình : Dịng men Y5QM Hình : Dịng men Y6QM Chun ngành Công Nghệ Sinh học Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 40 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ 1.2 Các dịng men phân lập từ men rượu Hồng Anh Hình : Dịng men Y1HA Hình : Dịng men Y2HA Hình : Dịng men Y3HA Hình : Dịng men 4HA Hình : Dịng men Y5HA Chun ngành Cơng Nghệ Sinh học Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 41 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ 1.3 Các dòng men phân lập từ men rượu Hải Anh Quan Hình : Dịng men Y1HAQ Hình : Dịng men Y2HAQ Hình : Dịng men Y3HAQ Hình : Dịng men Y4HAQ 1.4 Các dòng men phân lập từ men rượu Dung – Đức Thành Hình : Dịng men Y1DĐT Hình : Dịng men Y2DĐT Hình : Dịng men Y3DĐT Chun ngành Cơng Nghệ Sinh học Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 42 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ 1.5 Các dòng men phân lập từ men rượu Linh Chi Hình : Dịng men Y1LC Hình : Dịng men Y2LC Hình : Dịng men Y3LC Hình : Dịng men Y4LC Hình : Dịng men Y5LC Chun ngành Cơng Nghệ Sinh học Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 43 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC 4: BẢNG KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Bảng 10: Hoạt tính enzyme amylase qua ngày ủ HOẠT TÍNH ENZYME AMYLASE (U/g) THEO THỜI GIAN Lần Lần Lần Trung bình Ngày 2,11 2,71 2,79 2,54d Ngày 5,94 6,69 5,54 6,06b Ngày 7,09 6,45 5,38 6,31b Ngày 7,41 8,96 10,64 9,00a Ngày 4,90 5,38 5,42 5,23bc Ngày 4,94 5,10 5,26 5,10bc Ngày 3,94 3,03 4,94 3,97cd Bảng 11: Kết dựng đường chuẩn phương pháp Nelson phương trình đường chuẩn Đường chuẩn Glucose OD 595 nm Lần Lần Glucose (µl/ml) Lần 0 0 0,000 0,2 0,091 0,09 0,084 0,088 0,4 0,205 0,202 0,201 0,203 0,6 0,299 0,311 0,296 0,302 0,8 0,39 0,418 0,406 0,405 0,505 0,489 0,486 0,493 TB Phương trình đường chuẩn: y = 0,5021x – 0,0026 R2 = 0,9989 Chuyên ngành Công Nghệ Sinh học Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học 44 ... 5: Sản xuất bột men gồm nấm men enzyme amylase 3.2.5.1 Sản xuất bột men từ dòng men tuyển chọn Sản xuất bột men từ dòng nấm men tuyển chọn dùng làm nguyên liệu giống cho bột men gồm nấm men enzyme. .. nghiệm 5: Sản xuất bột men gồm nấm men enzyme amylase 32 4.5.1 Sản xuất bột men 32 4.5.2 Sản xuất bột mầm lúa 32 4.5.3 Thử nghiệm sản xuất bột men gồm nấm men enzyme amylase. .. cao” “hiệu hệ enzyme thay thế” đề xuất thực đề tài ? ?Nghiên cứu sản xuất men rượu từ nấm men hệ enzyme amylase mầm lúa? ?? Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu đề tài khảo sát thành phần nguồn men thị trường