Khảo Sát Đặc Tính Hình Thái Và Di Truyền Của Nấm Bào Ngư

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH HÌNH THÁI VÀ DI TRUYỀN CỦA NẤM BÀO NGƢ CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS NGÔ THỊ PHƢƠNG DUNG SINH VIÊN THỰC HIỆN PHẠM HỒNG QUANG MSSV: 3064410 LỚP:CNSH TT K32 Cần Thơ, Tháng 10/2010 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Ngô Thị Phương Dung Phạm Hồng Quang DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2010 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) CẢM TẠ     Trong suốt trình thực đề tài Luận văn tốt nghiệp, nhận động viên, giúp đỡ từ nhiều phía Tơi xin chân thành bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến: TS Ngô Thị Phương Dung tận tình giúp đỡ, thăm hỏi, động viên, hướng dẫn tạo điều kiện tốt cho suốt trình thực đề tài nghiên cứu Anh Huỳnh Xuân Phong Anh Nguyễn Ngọc Thạnh – Cán phịng thí nghiệm Vi sinh Thực phẩm – nhiệt tình chia sẻ kinh nghiệm theo sát tơi q trình thực đề tài Chị Liễu Như Ý – Cán phịng thí nghiệm Sinh học Phân tử – tận tình hướng dẫn, cung cấp tài liệu cho lời khuyên bổ ích giúp tơi hồn thành đề tài nghiên cứu Chị Đặng Thị Bích Tuyền – Học viên Cao học K15 chuyên ngành Công nghệ Sinh học – hỗ trợ, chia sẻ kinh nghiệm thơng tin q báu giúp tơi hồn thiện đề tài Xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến q Thầy, Cơ Cán Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học tạo điều kiện cho tiếp cận sử dụng trang thiết bị, tài liệu phục vụ cho trình nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn q Thầy, Cơ Khoa, Viện tận tình truyền dạy kiến thức, giúp tơi có kiến thức tảng hữu ích phục vụ cho việc thực đề tài Xin cảm ơn bạn sinh viên Trần Thanh Tâm, Lý Huỳnh Liên Hương, Dương Hải Nguyên, anh chị cao học, bạn sinh viên làm việc phịng thí nghiệm Vi sinh Thực phẩm phịng thí nghiệm Sinh học Phân tử Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học hỗ trợ nhiệt tình, giúp tơi hồn thành đề tài tiến độ Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến gia đình người thân động viên, khích lệ hỗ trợ tơi nhiều mặt vật chất tinh thần, giúp vững tin thực đề tài nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT TÓM TẮT Nấm ăn từ lâu xem loại thực phẩm thơm ngon, vừa có giá trị dinh dưỡng cao, vừa có tác dụng chữa bệnh Nghề trồng nấm nước ta nói chung, Đồng sơng Cửu Long nói riêng khơng ngừng phát triển, nhiều lồi nấm ăn sản xuất với sản lượng lớn đáp ứng nhu cầu nước xuất khẩu, có nấm bào ngư Mặc dù sản xuất tiêu thụ rộng rãi, dòng nấm bào ngư khác phân biệt đơn giản dựa vào màu sắc, mùi vị gọi bào ngư nhật có màu vàng nâu bào ngư trắng có màu trắng Các dịng mức độ giống loài chưa xác định nhiều Bên cạnh đó, nhu cầu sản xuất tăng cao, lượng meo giống dành cho ni trồng tăng mạnh, địi hỏi cần phải có qui trình sản xuất meo giống hiệu ổn định Để góp phần cung cấp thông tin làm sở khoa học nghiên cứu giải vấn đề trên, đề tài tiến hành với mục tiêu phân lập khảo sát đặc tính hình thái, di truyền dịng nấm bào ngư, đồng thời xác định độ ẩm thích hợp cho phát triển meo giống Qua trình thực hiện, dòng nấm bào ngư phân lập Mỗi dịng nấm ly trích DNA, khuếch đại đoạn gen mã hóa 18S rRNA cặp mồi ITS1 – ITS4 phân tích trình tự đoạn gen Kết khảo sát, định danh theo hình thái học sinh học phân tử cho kết tương đồng: nấm bào ngư trắng thuộc loài Pleurotus floradinus, nấm bào ngư nhật thuộc loài Pleurotus cystidiosus Kết nuôi cấy meo nấm ẩm độ 40%, 50%, 60% 70% cho thấy độ ẩm thích hợp cho meo giống phát triển khoảng 50% – 60% Từ khố: định danh hình thái, định danh phân tử, ITS, nấm bào ngƣ, ribosomal RNA Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang KÝ TÊN HỘI ĐỒNG CẢM TẠ TÓM LƢỢC i MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG iv DANH SÁCH HÌNH v TỪ VIẾT TẮT vi CHƢƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài CHƢƠNG LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lƣợc nấm 2.1.1 Cấu tạo chung nấm 2.1.2 Hệ thống phân loại nấm 2.2 Các phƣơng pháp định danh nấm học 2.2.1 Phương pháp hình thái học 2.2.2 Phương pháp sinh học phân tử 2.3 Khái quát nghề trồng nấm Việt Nam 11 2.4 Sơ lƣợc nấm bào ngƣ 12 CHƢƠNG PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu 14 3.1.1 Dụng cụ, thiết bị 14 3.1.2 Nguyên vật liệu 14 3.1.3 Hóa chất 14 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 14 3.2.1 Công tác thu mẫu 14 3.2.2 Phân lập nấm bào ngư 15 3.2.3 Trồng thử nghiệm nấm bào ngư phịng thí nghiệm 15 3.2.4 Khảo sát đặc tính hình thái dòng nấm bào ngư phân lập 16 3.2.5 Khảo sát đặc tính di truyền dòng nấm bào ngư phân lập 16 3.2.6 Khảo sát ảnh hưởng độ ẩm lên phát triển meo nấm bào ngư 19 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 4.1 Phân lập nấm bào ngƣ 22 4.2 Trồng thử nghiệm nấm bào ngƣ phịng thí nghiệm 22 4.3 Khảo sát đặc tính hình thái dòng nấm bào ngƣ phân lập 23 4.4 Khảo sát đặc tính di truyền dòng nấm bào ngƣ phân lập 26 4.4.1 Ly trích DNA phản ứng PCR 26 4.4.2 Giải trình tự sản phẩm PCR 27 4.5 Khảo sát ảnh hƣởng độ ẩm lên phát triển meo nấm bào ngƣ 30 4.5.1 Kiểm tra men thủy giải dòng nấm phân lập 30 4.5.2 Khảo sát ảnh hưởng ẩm độ lên phát triển meo nấm bào ngư 31 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33 5.1 Kết luận 33 5.2 Đề nghị 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 PHỤ LỤC Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Tên bảng Trang Bảng Tên nấm địa điểm thu mua loại nấm 15 Bảng Thành phần dung dịch lysis buffer 17 Bảng Công thức chạy phản ứng PCR 18 Bảng Kết đo OD mẫu DNA 26 Bảng Kết đo độ phân giải tinh bột dòng nấm 31 Bảng Thời gian tơ nấm lan đầy túi meo nấm bào ngư 31 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Tên hình Trang Hình Hệ thống phân loại nấm Ainsworth G C(1973) Hình Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR 19 Hình Hệ sợi nấm bào ngư trắng TCT 22 Hình Hệ sợi nấm bào ngư trắng TBT 22 Hình Hệ sợi nấm bào ngư nhật NBT 22 Hình Thể dòng nấm TCT 23 Hình Thể dòng nấm TBT 23 Hình Thể dịng nấm NBT 23 Hình Sợi nấm bào ngư trắng TCT 24 Hình 10 Sợi nấm bào ngư trắng TBT 24 Hình 11 Sợi nấm bào ngư nhật TCT 24 Hình 12 Bào tử xuất hệ sợi nấm bào ngư NBT 24 Hình 13 Cuống thể có lớp lơng mịn 25 Hình 14 Phiến nấm tỏa hình quạt 25 Hình 15 Bào đảm với bào tử đảm đính phía 25 Hình 16 Vết in bào tử nấm bào ngư tạo thành vệt trắng 25 Hình 17 Bào tử nấm bào ngư thn dài hình hạt đậu 25 Hình 18 Kết chạy điện di DNA ly trích 26 Hình 19 Kết chạy điện di sản phẩm PCR gel agarose 27 Hình 20 Hệ sợi nấm bào ngư môi trường tinh bột sau nhỏ dung dịch iod 0.02M 30 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT TỪ VIẾT TẮT BLAST : Basic Local Alignment Search Tool ddNTP : Dideoxyribonucleotide DNA : Dideoxyribonucleic acid dNTP : Deoxyribonucleotide OD : Optical density PCR : Polymerase chain reaction PGA : Potato glucose agar RNA : Ribonucleic acid rRNA : Ribosomal ribonucleic acid Tm : Melting temperature – nhiệt độ nóng chảy Chun ngành Cơng nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Lu ận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 32 – 2010 Trường ĐHCT CHƢƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Nấm ăn người phát sử dụng từ hàng trăm năm Trong giới sinh vật có hàng vạn lồi nấm, có 100 lồi ăn dùng làm thuốc, thơng dụng mộc nhĩ đen, ngân nhĩ, nấm hương, nấm sò, nấm mỡ, nấm rơm, nấm kim châm, nấm trư linh Ngoài nguồn thu hái từ thiên nhiên, người ta trồng 60 lồi theo phương pháp cơng nghiệp với suất sản lượng cao, đáp ứng nhu cầu không ngừng gia tăng nấm ăn giới, với sản lượng nấm tiêu thụ năm 2004 lên đến 1,5 triệu Nhiều nước giới giới hóa hồn tồn qui trình trồng nấm, từ khâu xử lý nguyên liệu, thu hái chế biến nấm Hà Lan, Pháp, Ý, Nhật Bản, Hoa Kỳ, Đức, Ở Việt Nam, đặc biệt vùng Đồng sông Cửu Long, nghề trồng nấm phát triển mạnh mẽ nhờ lợi điều kiện thời tiết, nguồn nhân công dồi dào, nguồn chất trồng nấm phong phú Các loại nấm tiêu thụ mạnh kể đến nấm rơm, nấm mèo, nấm bào ngư, nấm bào ngư trở thành ăn quen thuộc, hấp dẫn bổ dưỡng bữa cơm nhiều gia đình Nhiều hộ nông dân sở sản xuất đầu tư trồng nấm bào ngư thu lợi nhuận khả quan Tuy việc sản xuất tiêu thụ nấm bào ngư phát triển rầm rộ, loài nấm phân biệt dựa đặc điểm đơn giản màu sắc, mùi vị nấm bào ngư nhật nấm có màu vàng nâu, mùi hắc đặc trưng nấm bào ngư trắng nấm có màu trắng Các dịng lồi nấm ăn tiêu thụ thị trường chưa nghiên cứu xác định nhiều mức độ giống loài Mặt khác, phát triển ngành trồng nấm kéo theo nhu cầu nguồn meo giống cung cấp cho sản xuất Một yếu tố ảnh hưởng đến sản lượng meo giống độ ẩm chất khơng thích hợp Với mục đích xác định lồi nấm bào ngư trồng tiêu thụ phổ biến theo sở khoa học, cung cấp mơ tả đặc trưng cho lồi nấm này, đồng thời góp phần cung cấp thơng tin làm sở khoa học nghiên cứu giải hiệu vấn đề trình sản xuất meo giống, đề tài thực nhằm Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Lu ận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 32 – 2010 TTGACAGGTC Trường ĐHCT GGCTCCTCTT AAATGCATTA GCAGGACTTC 511 TCATTGCCTC TGCGCATGAT GTGATAATTA TCACTCATCA ATAGCACGCA 561 TGAATAGAGT CCAGCTCTCT AATCGTCCGC AAGGACAATT ACCTCAAATC AGTAGGACTA CCCGCTGAAC TGACAATTTG 611 TTAAGCATAT GACCT So sánh trình tự với liệu ngân hàng gen trang web http://www.ncbi.nlm.nih.gov chương trình BLAST, kết cho thấy trình tự nhận giống với trình tự lồi Pleurotus floridanus – mã số (Accession number) GU721058 – với độ tương đồng 99% Đoạn gen tương đồng bao gồm phần vùng 18S rRNA; toàn vùng ITS1, vùng 5,8S rRNA, vùng ITS2; phần vùng 28S rRNA Theo đó, dịng nấm bào ngư trắng TCT thuộc phân loại Eukaryota; Fungi; Dikarya; Basidiomycota; Agaricomycotina; Agaricomycetes; Agaricomycetidae; Agaricales; Pleurotaceae; Pleurotus loài Pleurotus floridanus Đoạn gen mẫu nấm NBT có độ dài 661 bp có trình tự sau: 01 ATACATTCAA CCACTTGTGC ACTTTTGATA GATTCGCAGA AATGACTTGG TTGGTCGGGA GTTGCCCTCT CAGGTCAGTA 61 TTGTCACAGT CCTGGCTTTG ACTTTGTGGG 110 TATACACACT TGTATGTCCA TGAATGTTAT TTTCTTGGGC TCTATTATCT 161 CATGTGCCTA TAAAACCTAA TACAACTTTC AACAACGGAT CTCTTGGCTC 210 TCGCATCGAT GAAGAACGCA GCGAAATGCG ATAAGTAATG AATTCAGTGA ATCATCGAAT CTTTGAACGC CCGAGGGGCA TGCCTGTTTG TGAATTGCAG 261 ACCTTGCGCC CCTTGGTATT AGTGTCATTA AATTCTCAAA TCTATAGAGC 360 TATAGATTTG GATTGTTGGG GGCTGCTGGC TTTTTACCAA 310 TTTTTTGTGA 410 GTTGGCTCCT CTTAAATGCA TTAGCGGGAC TTTATTGCCT CTGCGCACAG 460 TGTGATAATT ATCTACGCTG GCCGACATGC AATGACTTTA TTTCTAACTG TCTTTCAAGA CAATGACTTG GTAGGACTAC CCGCTGAACT CAAGTCCAGC 510 ACAATTTGAC CTCAAATCAG 560 TAAGCATATC AATAAGCGGA GGAAAGATCA ACTCATGAAG CTGATGCTGG TCTCTCGGGA Đối chiếu với liệu ngân 610 TTAATGAATT CATGTGCACG 661 C hàng gen trang web http://www.ncbi.nlm.nih.gov chương trình BLAST, trình tự tương đồng với Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 28 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Lu ận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 32 – 2010 Trường ĐHCT đoạn gen loài Pleurotus cystidiosus với mã số (Accession number) DQ978222.1 – độ tương đồng 100% Đoạn gen tương đồng bao gồm phần vùng 18S rRNA; toàn vùng ITS1, vùng 5,8S rRNA, vùng ITS2; phần vùng bán đơn vị lớn rRNA Như vậy, dòng nấm bào ngư trắng nhật NBT thuộc loài Pleurotus cystidiosus xếp bậc phân loại sau: Eukaryota; Fungi; Dikarya; Basidiomycota; Agaricomycotina; Agaricomycetes; Agaricomycetidae; Agaricales; Pleurotaceae; Pleurotus loài Pleurotus cystidiosus Đoạn gen mẫu nấm TBT có độ dài 593 bp có trình tự sau: 01 AGTCTTCCCA ACCACCTGTG AACTTTTGAT AGACAGTGAA ACTTGGTTGC TGGGATTTAA GTCGTCTCTC AAGTCGTCAG 61 ACGTCTCGGT GTGACTACGC AGTCTATTTA 110 CCAAATGTAT GTCTACGAAT GTCATTTAAT GGGCCTTGTG CTTACACACC 161 CCTTTAAACC ATAATACAAC TTTCAACAAC GGATCTCTTG GCTCTCGCAT 210 CGATGAAGAA CGCAGCGAAA TGCGATAAGT AATGTGAATT GTGAATCATC GAATCTTTGA ACGCACCTTG GGCATGCCTG TTTGAGTGTC GCAGAATTCA 260 CGCCCCTTGG TATTCCGAGG 310 ATTAAATTCT CAAACTCACT TTGGTTTCTT 360 ATGTTTGGAT TGTTGGGGGC TGCTGGCCTT GACAGGTCGG TCCAATTGTG 410 CTCCTCTTAA ATGCATTAGC AGGACTTCTC ATTGCCTCTG CGCATGATGT 460 GATAATTATC ACTCATCAAT AGCACGCATG AATAGAGTCC TCGTCCGCAA GGACAATTTG ACAATTTGAC CCGCTGAACT TAAGCATATC AGCTCTCTAA 510 CTCAAATCAG GTAGGACTAC AATAGACGGA GGAAGGA 560 So sánh trình tự nhận với liệu ngân hàng gen trang web http://www.ncbi.nlm.nih.gov chương trình BLAST, kết cho thấy đoạn gen mẫu TBT giống với trình tự lồi Pleurotus floridanus – mã số FJ810170.1 – với độ tương đồng 98% Đoạn gen tương đồng bao gồm phần vùng 18S rRNA; toàn vùng ITS1, vùng 5,8S rRNA, vùng ITS2; phần vùng 28S rRNA Như vậy, dòng nấm bào ngư trắng TBT thuộc phân loại Eukaryota; Fungi; Dikarya; Basidiomycota; Agaricomycotina; Agaricomycetes; Agaricomycetidae; Agaricales; Pleurotaceae; Pleurotus lồi Pleurotus floridanus Chun ngành Cơng nghệ Sinh học 29 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Lu ận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 32 – 2010 Trường ĐHCT Kết định danh theo hình thái học sinh học phân tử có tương đồng Cả dòng nấm thuộc giống Pleurotus, ngành phụ nấm đảm Basidiomycota Kết phân loại theo phương pháp sinh học phân tử bổ sung thêm số bậc phân loại ngành Agaricomycotina, lớp Agaricomycetes, lớp Agaricomycetidae Ngoài ra, nấm bào ngư xếp vào họ Agaricaceae theo phương pháp định danh hình thái học, họ Pleurotaceae theo phương pháp định danh sinh học phân tử Sự khác biệt bắt nguồn tự hệ thống phân loại khác hai phương pháp Phương pháp hình thái học thiết lập dựa theo bậc phân loại G.C Ainsworth (1973) có bổ sung Sharma (1998) Bậc phân loại theo sinh học phân tử thiết lập dựa việc so sánh trình tự gen dịng nấm, đặc biệt gen mang thông tin phiên mã rRNA Nhiều tác giả tham gia xây dựng bậc phân loại nấm dựa theo thông tin sinh học phân tử Các kết David S Hibbett et al (2007) tổng hợp đưa phân loại nấm Nhìn chung, phương pháp sinh học phân tử bổ sung, xếp lại thay đổi số bậc phân loại giống; tên giống loài dòng nấm giữ nguyên Như vậy, phương pháp định danh nấm hình thái học có giá trị định, áp dụng phương pháp đánh giá sơ dòng nấm nghiên cứu 4.5 Khảo sát ảnh hƣởng độ ẩm lên phát triển meo nấm bào ngƣ 4.5.1 Kiểm tra men thủy giải dòng nấm phân lập đƣợc Cấy dịng nấm lên mơi trường chứa tinh bột đo vùng tinh bột bị phân giải với trợ giúp phản ứng màu tinh bột – iod (Hình 20) Kết đo trình bày Bảng Hình 20 Hệ sợi nấm bào ngƣ mơi trƣờng tinh bột sau nhỏ dung dịch iod 0.02M Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 30 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Lu ận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 32 – 2010 Trường ĐHCT Bảng Kết đo độ phân giải tinh bột dòng nấm Dòng nấm Đƣờng kính vùng phân giải tinh bột (cm) TCT 6,22a TBT 4,25b NBT 3,38b Ghi chú: Các số liệu bảng giá trị trung bình lần lặp lại Trong cột số có chữ theo sau giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê mức 5% Kết Bảng cho thấy khả phân giải tinh bột hai dòng nấm TBT NBT tương đương với đường kính vùng phân giải tinh bột 4.25 cm 3.38 cm Dịng nấm TCT có độ phân giải tinh bột cao hẳn hai dòng nấm trên, có khác biệt ý nghĩa mức 5% với vùng phân giải tinh bột đạt đường kính 6.22 cm Vì thế, dịng nấm bào ngư trắng TCT dùng để khảo sát ảnh hưởng độ ẩm lên phát triển meo nấm 4.5.2 Khảo sát ảnh hƣởng ẩm độ lên phát triển meo nấm bào ngƣ Dòng nấm bào ngư trắng TCT cấy vào túi môi trường lúa với độ ẩm khác Thời gian tơ nấm lan đầy túi môi trường ghi nhận Bảng Bảng Thời gian tơ nấm lan đầy túi meo nấm bào ngƣ Nghiệm thức Độ ẩm Thời gian tơ nấm đầy túi (ngày) 40% 12,67b 50% 11,00a 60% 10,33a 70% 17,33c Ghi chú: Các số liệu bảng giá trị trung bình lần lặp lại Trong cột số có chữ theo sau giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê mức 5% Dựa theo kết Bảng 6, thời gian tơ nấm lan đầy túi độ ẩm 50% 60% khơng có khác biệt, độ ẩm thích hợp cho tơ nấm phát triển với thời gian ngắn nhất, từ 10 đến 11 ngày Ở độ ẩm 40%, tơ nấm có khả phát triển, thời gian để tơ nấm lan đầy túi kéo dài, 12 ngày Ở độ ẩm cao hơn, 70%, tơ nấm nhiều thời gian để phủ đầy túi chất Nguyên nhân ẩm độ cao, nước nhiều, lượng ôxy dành cho sợi nấm hô hấp bị hạn chế, ảnh hưởng đến khả Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 31 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Lu ận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 32 – 2010 Trường ĐHCT phát triển sợi nấm Hơn nữa, chất lúa ẩm độ nhiệt độ cao khử trùng bị hồ hóa, dính cứng lại, giảm thiểu khoảng khơng để sợi nấm len lỏi, làm cho thời gian lan tơ bị kéo dài Thí nghiệm cho thấy, ẩm độ để tơ nấm phát triển nhanh trải khoảng rộng, từ 50 – 60% Đây thuận lợi cho trồng nấm, thực tế sản xuất thủ cơng khó pha trộn chất để đạt giá trị ẩm độ định Với khả thích nghi rộng với ẩm độ, nơng dân cần ý pha trộn chất với giá trị ẩm độ đạt khoảng 50 – 60% Ngoài ra, chất thiếu nước có lợi chất thừa nước Vì ẩm độ thấp 40%, tơ nấm phát triển, dù có chậm chút Tuy nhiên, nhiều nước để ẩm độ vượt qua ngưỡng 70% ảnh hưởng tiêu cực đến phát triển tơ nấm, kéo dài thời gian lan tơ, khơng có lợi Chun ngành Cơng nghệ Sinh học 32 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Lu ận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 32 – 2010 Trường ĐHCT CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua q trình thực thí nghiệm, thống kê liệu phịng thí nghiệm, đề tài đạt kết sau: - Phân lập dòng nấm bào ngư thuần: dòng nấm bào ngư trắng từ Cần Thơ, dòng nấm bào ngư trắng từ Bến Tre dòng nấm bào ngư Nhật Bến Tre Kết trồng thử nghiệm phịng thí nghiệm xác định tính xác độ dòng nấm phân lập - Khảo sát đặc tính hình thái di truyền dịng nấm này, giải trình tự đoạn gen khuếch đại cặp primer ITS1, ITS4 dòng nấm Kết cho thấy nấm bào ngư trắng Cần Thơ Bến Tre thuộc loài Pleurotus floridanus, nấm bào ngư nhật Bến Tre thuộc loài Pleurotus cystidiosus Hai phương pháp hình thái học sinh học phân tử có tương đồng kết định danh - Dòng nấm bào ngư trắng Cần Thơ có khả thủy giải tinh bột tốt - Xác định khoảng ẩm độ tốt để sản xuất meo nấm từ 50% – 60% 5.2 Đề nghị - Tiếp tục khảo sát dòng nấm ăn phổ biến lạ tiêu thụ vùng nấm kim châm, nấm linh chi trắng…, tiến tới lập đồ phả hệ dòng nấm - Nghiên cứu thêm yếu tố ảnh hưởng đến trình sản xuất nấm, thành phần chất, chất bổ sung, điều kiện nuôi trồng,… Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 33 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Lu ận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 32 – 2010 Trường ĐHCT TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Khuất Hữu Thanh 2006 Kỹ thuật gen nguyên lý ứng dụng Nxb Khoa Học & Mỹ Thuật, Hà Nội, trang 154– 72 Lê Bá Dũng, 2003 Nấm lớn Tây Nguyên Nxb Khoa học Và Kỹ thuật, Hà Nội, trang 39 – 91 Lê Duy Thắng, 1997 Kỹ thuật trồng nấm Nxb Nơng Nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh, trang 141 – 163 Nguyễn Anh Diệp, Trần Ninh Nguyễn Xuân Quýnh 2007 Nguyên tắc phân loại sinh vật Nxb Khoa Học Và Kỹ Thuật, Hà Nội, trang 167 – 187 Nguyễn Duy Điềm Huỳnh Thị Dung, 2003 Sao bạn chưa trồng nấm? Nxb Phụ Nữ, Thành phố Hồ Chí Minh, trang 12 – 28 Nguyễn Hữu Đống, Đinh Xuân Linh, Nguyễn Thị Sơn Zani Federico 1997 Nấm ăn, sở khoa học công nghệ nuôi trồng Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội, trang 9– 22 Nguyễn Lân Dũng 2001 Công nghệ nuôi trồng nấm (tập 1) Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội, trang 10 – 42 Nguyễn Lân Dũng 2002 Công nghệ nuôi trồng nấm (tập 2) Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội, trang 374 – 382 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty 1999 Vi sinh vật học Nxb Giáo Dục, Hà Nội, trang 81–108 Việt Chương, 2003 Kinh nghiệm trồng nấm rơm nấm mèo Nxb Thành Phố Hồ Chí Minh, trang 25 – 31 Tiếng Anh Ainsworth G C., 1973 The Fungi: An advanced trieatise, IVB Academic Press, New York, pp 95 – 105 Andrej Jedinak and Daniel Sliva 2008 Pleurotus ostreatus inhibits proliferation of human breast and colon cancer cells through p53-dependent as well as p53independent pathway International Journal of Oncology 33: 1307-1313 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 34 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Lu ận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 32 – 2010 Trường ĐHCT Bobek P and S Galbavý 1999 Hypocholesterolemic and antiatherogenic effect of oyster mushroom (Pleurotus ostreatus) in rabbits Research Institute of Nutrition, Bratislava, Slovak Republic, Nahrung: 339 – 342 David S H., Manfred B., Joseph F B., Meredith B., Paul F C., Ove E E., Sabine H., Timothy J., Paul M K., Robert L., Thorsten L., Franỗois L., P B M., David J M., Martha J P., Scott R., Conrad L S., Joseph W S., Joost A S., Rytas V., M C A., André A., Robert B., Dominik B., Gerald L B., Lisa A C., Pedro W C., Yu-Cheng D., Walter G., David M G., Gareth W G., Cécile G., David L H., Geir H., Kentaro H., Richard A H., Kevin H., Joseph E I., Urmas K., Cletus P K., Karl-Henrik L., Robert L., Joyce L., Jolanta M., Andrew M., Jean-Marc M., Sharon M S., Franz O., Erast P., Valérie R., Jack D R., Claude R., Leif R., José P S., Arthur S., Junta S., R G T., Leif T., Wendy A U., Christopher W., Zheng W., Alex W., Michael W., Merlin M W., Katarina W., Yi-Jian Y., Ning Z 2007 A Higher-Level Phylogenetic Classification of the Fungi Mycological Reasearch III:509-547 Josep Guarro, Josepa Geé, and Alberto M Stchigel 1999 Developments in Fungal Taxonomy Clinical Microbiology Review 12: 454 – 500 Korabecna M., 2007 The Variability in the Fungal Ribosomal DNA (ITS1, ITS2, and 5.8 S rRNA Gene): Its Biological Meaning and Application in Medical Mycology Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology: 783-787 Prewitt M Lynn, Susan V Diehl, Thomas C McElroy, and Walter J Diehl 2008 Comparison of general fungal and basidiomycete-specific ITS primers or identification of wood decay fungi Forest Products Journal Vol 58, No.4: 66 – 71 Nirod Chandra Sarker, Hossain M M., N Sultana, I H Mian, A J M Sirajul Karim and S M Ruhul Amin 2009 Effect of Packing Method and Size of Fruiting Body on the Shelf Life of Oyster Mushroom (Pleurotus ostreatus) Bangladesh J Mushroom 3(2): 19-23 Whitaker R H 1969 New Concepts of Kingdoms of Organisms Science, Vol 163: 150 – 160 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 35 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Lu ận văn tốt nghiệp Đại học Khoá 32 – 2010 Trường ĐHCT Sharma O.P., 1998 Textbook of Fungi, 5th edition Tata McGraw-Hill Publishing Company Limited, New Delhi, pp 16 – 21, 208 – 19 Travis Henry, Peter C Iwen, and Steven H Hinrichs 2000 Identification of Aspergillus Species Using Internal Transcribed Spacer Regions and Journal of Clinical Microbiology:1510–1515 White T.J., Bruns T.D., Lee S and Taylor J., 1990 Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics PCR Protocols a Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, USA , pp 315– 322 Trang web http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=m egaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_LOC=bl asthome (Ngày 30/08/2010) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 36 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT PHỤ LỤC MỘT SỐ KHOÁ PHÂN LOẠI NẤM Khóa định loại đến ngành phụ ngành Nấm thật Eumycota (Sharma, 1998) Ngành phụ Mastigomycotina: Có bào tử động, bào tử hồn thiện thường nỗn bào tử (oospores) Ngành phụ Zygomycotina: Có bào tử động, bào tử hoàn thiện thường bào tử tiếp hợp (zygospores) Ngành phụ Ascomycotina: Khơng có bào tử động hay bào tử tiếp hợp, bào tử hoàn thiện bào tử nang (ascospores) Ngành phụ Basidiomycotina: khơng có bào tử động hay bào tử tiếp hợp, bào tử hoàn thiện bào tử đảm (basidiospores) Ngành phụ Deuteromycotina: Bào tử động bào tử hoàn thiện giống bào tử tiếp hợp, khơng có bào tử nang hay bào tử đảm Khóa định loại tới lớp ngành phụ nấm đảm Basidiomycotina (Sharma, 1998) Lớp Teliomycetes: Ký sinh thực vật bậc cao, khơng có thể mà hình thành chlamydospores (smuts) teleurospores (rusts) Bào tử tập trung túi bào tử phát tán mơ ký Lớp Hymenomycetes: Hình thành thể hồn thiện, có bào đảm (basidium) bào tầng (hymenium) Quả thể dạng mở nửa kín Bào tử đảm phóng thích mơi trường theo chế bắn Thường hoại sinh, ký sinh Lớp Gasteromycetes: Hình thành thể hồn thiện, thường thể kín Bào tử đảm khơng phóng thích theo chế bắn Thường hoại sinh, ký sinh Khóa định loại tới lớp Hymenomycetes (Lê Bá Dũng, 2003) 1- Nấm khơng hình thành thể, sống ký sinh 1- Nấm hình thành thể, sống hoại sinh, sống ký sinh 2- Khơng hình thành thể, giá bào tử thường xếp thành lớp mặt lá, ký sinh gây bệnh phòng Bộ Exobasidiales 2- Đảm phân thành phần dưới, phần có cuống mang bào tử Bộ Brachybasidiales Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT 3- Đảm đơn bào, thường có biến đổi cấu trúc, thể thường chất keo hay trãi phẳng 3- Đảm đơn bào hình chùy 4- Quả thể chất keo, đảm đơn bào dạng chạc súng cao su Bộ Dacrymycetales 4- Quả thể trãi phẳng có màng sáp hay gelatin, đảm có tiểu bính phình rộng Bộ Tulasnellales 5- Quả thể chất thịt mềm hay chất gỗ, bào tầng dạng ống 5- Bào tầng dạng phiến hay dạng mạng lưới dạng ống 6- Quả thể chất thịt mềm dễ thối rữa, bào tầng dạng ống Bộ Boletales 6- Quả thể gỗ cứng hay chất bì dai, bào tầng dạng ống hay biến đổi chúng Bộ Aphylophorales 7- Quả thể chất thịt hay chất bì dai, bào tầng dạng phiến hay dạng ống Quả thể chất thịt mềm dễ nát, bào tầng dạng gân hay mạng lưới Bộ Cantharellales 8- Quả thể chất thịt mềm, xốp hay bị thương tiết dịch sữa màu trắng Bộ Russulales 8- Quả thể chất thịt hay chất bì dai, không xốp, không tiết dịch sữa bị thương, bào tầng dạng ống hay dạng phiến 9- Quả thể chất thịt hay chất bì dai, khơng xốp, ẩm ướt phục hồi dạng ban đầu .Bộ Polyporales s str 9- Quả thể chất thịt mềm, ẩm ướt không phục hồi dạng ban đầu Bộ Agaricales Khóa định loại tới họ nấm tán Agaricales (Lê Bá Dũng, 2003) 1- Phiến nấm phân nhánh dạng mạng lưới, bào tử màu vàng đến màu rỉ sắt, hình bầu dục hay hình trứng Họ nấm phiến mắt lưới Paxillaceae Mép phiến nấm chẻ dọc cuộn ngược lên Họ nấm chân chim Schizophyllaceae 1- Phiến nấm không dạng mạng lưới, bào tử có màu sắc hình dạng khác 2- Phiến nấm dày, chất sáp Đảm dài gấp lần bào tử Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT Họ nấm mũ sáp Hygrophoraceae 2- Phiến nấm mỏng, không chất sáp Đảm tương đối ngắn 3- Thịt nấm ô lưới tạo thành Họ nấm hồng Russulaceae 3- Thịt nấm khuẩn ty ken lại 4- Cuống lệch bên khơng có Họ nấm tai bên Pleurotaceae 4- Cuống nấm đính trung tâm 5- Bào tử kính hiển vi khơng màu gần khơng màu, thành đám có màu trắng màu phấn hồng nhạt 5- Bào tử kính hiển vi mau rỉ sắt đến màu đen 6- Phiến nấm tiếp liền với cuống, tổ chức cuống dính liền với mũ Họ nấm trắng Tricholomataceae 6- Phiến nấm rời, cuống nấm dễ tách khỏi mũ Họ nấm độc Amanitaceae 7- Bào tử màu vàng đến màu rỉ sắt Họ nấm tán vàng Cortinariaceae 7- Bào tử màu nâu sẫm đến màu đen Họ nấm đen Agariaceae Khóa định loại tới chi (giống) họ nấm tai bên Pleurotaceae (Lê Bá Dũng) 1- Mũ nấm dịn, khơng dễ nát, ẩm ướt phục hồi lại hình dạng ban đầu 1- Mũ nấm chất thịt, không chất màng, dễ nát 2- Cuống nấm bên, ngắn khơng có 2- Cuống nấm phát triển lệch gần 3- Tầng thịt nấm có chất keo Chi nấm hắc luân Resupinatus 3- Thịt nấm đồng Chi nấm quạt Panellus 4- Bào tầng dạng nang (liệt bào) Chi nấm tai da Panus 4- Bào tầng khơng dạng nang, đơi có khuẩn ty trụ Chi nấm phễu Lentinus 5- Thường đầu mũ phiến có mạng (voile) phủ Chi nấm mạng quạt Tectella 5- Thường đầu mũ phiến khơng có mạng phủ 6- Trên bào tầng dạng túi Chi nấm tai da giả Hohenbuehelia 6- Trên bào tầng khơng dạng túi 7- Bào tử không màu, suốt Chi nấm tai bên Pleurotus 7- Bào tử màu nhạt, suốt Chi nấm tai vàng Crepidotus Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT PHỤ LỤC BẢNG SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM Kiểm tra men thuỷ giải dòng nấm sau ngày ủ 30oC Dòng nấm Lần lặp lại Đƣờng kính vùng phân giải tinh bột (cm) TCT 6,75 6,65 5,25 4,15 4,05 4,55 3,40 3,2 3,55 TBT NBT Khảo sát ảnh hƣởng độ ẩm lên phát triển meo nấm bào ngƣ Độ ẩm Lần lặp lại Thời gian tơ nấm lan đầy túi (ngày) 40% 13 12 13 12 11 10 10 11 10 16 18 18 50% 60% 70% Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT PHỤ LỤC BẢNG SỐ LIỆU THỐNG KÊ Kiểm tra men thuỷ giải dòng nấm sau ngày ủ 30oC Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT Khảo sát ảnh hƣởng độ ẩm lên phát triển meo nấm bào ngƣ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học ... lập nấm bào ngư 15 3.2.3 Trồng thử nghiệm nấm bào ngư phịng thí nghiệm 15 3.2.4 Khảo sát đặc tính hình thái dòng nấm bào ngư phân lập 16 3.2.5 Khảo sát đặc tính di truyền dòng nấm. .. 22 4.2 Trồng thử nghiệm nấm bào ngƣ phịng thí nghiệm 22 4.3 Khảo sát đặc tính hình thái dòng nấm bào ngƣ phân lập 23 4.4 Khảo sát đặc tính di truyền dịng nấm bào ngƣ phân lập 26 4.4.1... mịn Hình 15 Bào đảm với bào tử đảm đính phía Hình 16 Vết in bào tử nấm bào ngƣ tạo thành vệt trắng Hình 17 Bào tử nấm bào ngƣ thn dài hình hạt đậu Thịt nấm bào ngư hình thành ken chặt sợi nấm,