Tối ưu quy trình phân tích đa hình vùng promoter của gen UGT1A1 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng001

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC NGUYỄN HUY HỒNG TỐI ƢU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐA HÌNH VÙNG PROMOTER CỦA GEN UGT1A1 Ở BỆNH NHÂN UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH BÁC SĨ ĐA KHOA KHÓA 2012-2018 Hà Nội - 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC NGUYỄN HUY HOÀNG TỐI ƢU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐA HÌNH VÙNG PROMOTER CỦA GEN UGT1A1 Ở BỆNH NHÂN UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH BÁC SĨ ĐA KHOA KHÓA 2012-2018 Ngƣời ƣớng dẫn: ThS Phạm Thị Hồng Nhung TS BS Trần Quốc Hùng Hà Nội - 2018 LỜI CÁM ƠN Tôi xin đặc biệt gửi lời cám ơn đến ThS Phạm Thị Hồng Nhung trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu khoa học hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm tạ sâu sắc tới TS BS Trần Quốc Hùng, Khoa ung bướu Bệnh viện 198 Bộ Công an tạo điều kiện giúp thu thập số liệu nghiên cứu cho tơi góp ý chun ơn vơ giá trị Để thực tốt khóa luận này, tơi trân trọng cảm ơn tài trợ Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội cho đề tài mã số CS.15.09 Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc đến thầy cô cán nghiên cứu Bộ môn Y dược học sở, Khoa Y dược – Đại học Quốc Gia Hà Nội ln ủng hộ nhiệt tình giúp đỡ cho tơi có điều kiện tốt cho tơi thực nghiên cứu khoa học Tôi xin cảm ơn bạn sinh viên Bùi Xuân Nhật, Nguyễn Thùy Linh Kiều Hồng Nhung hỗ trợ thự hiệ nghiên cứu cho tơi góp ý chân thành viết khóa luận Để có thành cơng khóa luận này, tơi xin cảm ơn gia đình quan tâm động viên, khuyến khích giúp tơi vững vàng vượt qua khó khăn trình học tập nghiên cứu DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN bp CN1 CN2 dNTP DHPLC EDTA HRM kb NCBI OD PCR UDP UGT UGT1A1 UGT1A1 RFLP SNP SSCP TAE Axit Deoxyribonucleic (Deoxyribo Nucleic Acid) Cặp bazơ nitơ (Base pair) Hội chứng Crigler – Najar type Hội chứng Crigler – Najar type Deoxyribo Nucleic triphosphat Sắc kí lỏng cao áp biến tính (Denaturing high perfomance liquid chromatography) Axit ethylene diamine tetraacetic (Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid) Kĩ thuật phân tích phân giải cao nhiệt độ nóng chảy (High resolution melt) Kilobazơ (=1000 bp) Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc Gia – Mỹ (National Center for Biotechnology I formation) Mật độ quang học (Opti al de sity) Phản ứng tổng hợp chuỗ (Polymerase chain reaction) Uridine 5’ diphosphat Enzym Uridine 5’ diphosphat glucoronosyltransferase Enzym Uridine 5’ diphosphat glucoronosyltransferase A1 Gen mã hóa cho Uridine 5’ diphosphat glucoronosyltransferase A1 Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (Restriction fragment length polym rphism) Đa hình di truyền đơn nucleotit (Single nucleotide polymorphism) Phân tích đa hình cấu hình sợi đơn (Single strand conformation polymorphism) Đệm Tris base/ axit acetic/ EDTA DANH MỤC CÁC BẢNG Tran g Bảng Các đa hình di truyền UGT1A1 phổ biến Bảng Nồng độ ADN tổng số tách từ mẫu mô đúc paraffin phương pháp đo mật độ quang OD 22 Bảng Thành phần điều kiện phản ứng PCR 25 Bảng Đa hình vùng promoter UGT1A1 38 bệnh nhân nghiên cứu .27 Bảng Chỉ định xét nghiệm UGT1A1*28 sử dụng số loại thuốc 30 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Tran g Hình 1.1 Cây phát sinh chủng loại protein UGT Hình 1.2 Phản ứng chuyển nhóm glycosyl nhờ UGT Hình 1.3 Sơ đồ locus UGT1A1 người Hình 1.4 Tỉ lệ mắc tử vong 10 ung thư phổ biến năm 2012 Hình 1.5 Đa hình di truyền UGT1A1 chuyển hóa irinotecan 10 Hình 1.6 Irinotecan phác đồ điều trị ung thư đại trực tràng liên quan đến kiểu gen UGT1A1 11 Hình 1.7 Biên độ nhiệt đa hình vùng promoter gen UGT1A1 15 Hình 1.8 Kết điện di kiểu gen (TA)6/(TA)7 (TA)6/(TA)8 sử dụng gel agarose 3% 15 Hình 2.1 Quy trình tách chiết ADN cột silica đơn giản 17 Hình 2.2 Quy trình PCR 19 Hình 3.1 Điện di gel agarose 0.7% sả phẩm tinh ADN từ mẫu máu .21 Hình 3.2 Điện di gel agarose 1.5% thí nghiệm tối ưu nhiệt độ gắn mồi PCR nhân vùng promoter UGT1A123 Hình 3.3 Điện di gel agarose 1.5% thí nghiệm tối ưu nồng độ ADN PCR nhân vùng promoter UGT1A1 24 Hình 3.4 Điện di gel agarose 1.5% sử dụng quy trình PCR tối ưu nhân vùng promoter UGT1A1 chạy với 10 mẫu bệnh nhân 24 Hình 3.5 Kết giải trình tự kiểu gen đồng hợp (TA)6/(TA)6 25 Hình 3.6 Kết giải trình tự kiểu gen (TA)5/(TA)6 26 Hình 3.7 Kết giải trình tự kiểu gen (TA)5/(TA)6 26 Hình 3.8 Tần số ác alen UGT1A1*28, UGT1A1*36 UGT1A1*6 số quần thể 28 MỤC LỤC MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Enzym Uridine 5’ diphosphat glucuronosyltransferases A1 .2 1.2 Một số bệnh lý liên quan đến enzym UGT1A 1.2.1 Hội chứng Gilbert 1.2.2 Hội chứng Crigler – Najar 1.3 Đa hình di truyền UGT1A1*28 1.4 Ung thƣ đại trực tràng mối liên quan irinotecan với đa hình di truyền UGT1A1*28 1.5 Các phƣơng pháp phân tích đa hình di truyề n UGT1A1*28 11 1.5.1 Giải trình tự ADN 11 1.5.2 Phân tích đa hình cấu hình sợi đơn ( Single-strand conformation polymorphism - SSCP): 12 1.5.3 Phân tích dị sợi kép (heteroduplex analysis): 13 1.5.4 Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạ (R striction fragment length polymorphism – RFLP) 13 1.5.5 Real – time PCR 14 1.5.6 Phân giải cao nhiệt độ chảy 14 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 16 2.2 Hóa chất 16 2.3 Thiết bị địa điểm nghiên cứu 16 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 17 2.4.1 Tách chiết ADN t số 17 2.4.2 Đánh giá chất lượng sản phẩm tách ADN tổng số .18 2.4.3 Phản ứng PCR nhân dòng vùng promoter UGT1A1 18 2.4.4 Xác định kiểu gen UGT1A1*28 phương pháp giải trình tự .20 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 3.1 Kết qu ả tách chiết ADN tổng số 21 3.3 Kế t qu ả giải trình tự kiểu gen UGT1A1*28 25 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC MỞ ĐẦU Ung thư ảnh hưởng nhiều tới sức khỏe chất lượng sống Theo tổ chức Y tế giới, ung thư đứng hàng thứ nguyên nhân tử vong, với khoảng 14 triệu người mắc vào năm 2012 tiếp tục có xu hướng tăng lên Ung thư đại trực tràng ung thư phổ biến nhất, với tỉ lệ mắc đứng hàng thứ tư tỉ lệ tử vong cao thứ năm hai giới [33] Mặc dù có tiến chẩn đoán sớm điều trị, nhiên tỉ lệ bệnh nhân ung thư đại trực tràng tiến triển đến giai đoạn muộn (giai đoạn IV) cao Một thuốc điều trị giai đoạn muộn Irinotecan, việc điều trị gặp nhiều khó khăn, đặc biệt tác dụng khơng mong muốn thuốc Thời điểm cá thể hóa điều trị xu hướng tất yếu ngày ảnh hưởng sâu rộng đến trình điều trị ung thư đại trực tràng bác sĩ Một cơng cụ hữu ích với bác sĩ lâm sàng việc đối đầu với ung thư đại trực tràng sinh học phân tử Các nghiên cứu đa hình di truyền vùng promoter gen UGT1A1 có ảnh hưởng lớn đến q trình chuyển hóa irinotecan, liên quan chặt chẽ đến hiệu điều trị mức độ trầm trọng tác dụng không mong muốn thuốc Năm 2005, Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration, viết tắt FDA) đưa khuyến cáo nên xét nghiệm gen UGT1A1*28 dùng irinotecan có hướng dẫn điều trị tương ứng với kiểu gen[23] Tuy nhiên chưa có nhiều nghiên cứu gen UGT1A1 đa hình di truyền UGT1A1*28 Việt Nam Chính vậy, tiến hành đề tài “Tối ưu quy trình phân tích đa hình di truyền vùng promoter gen UGT1A1 bệnh nhân ung thư đại tr ực tràng” Kết đề tài cung cấp công cụ hỗ trợ đắc lực cho bác sĩ không việc điều trị ung thư đại trực tràng mà cịn việc ẩn đốn số bệnh lý di truyền hội chứng Gilbert hay hội chứng Crigler – Najar Mục tiêu nghiên cứu: Tối ưu quy trình phân tích đa hình di truyền vùng promoter củ a gen UGT1A1 Nội dung nghiên cứu: Tối ưu quy trình phân tích đa hình di truyền vùng promoter gen UGT1A1 mẫu mô bệnh phẩm đúc paraffin mẫu máu Áp dụng quy trình phân tích gen mẫu bệnh phẩm thu từ Bệnh viện 198 Bước đầu xác minh tần số alen tần số kiểu gen đa hình di truyền vùng promoter thuộc gen UGT1A1 nhóm mẫu nghiên cứu CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Enzym Uridine 5’ diphosphat glucuronosyltransferases A1 Uridine 5’ diphosphat glucurosyltransferases A1 (viết tắt UGT1A1) thành viên họ enzym Uridine 5’ diphosphat glucuronosyltransferase (viết tắt UGT), đóng vai trị xúc tác cho hoạt động chuyển hóa giải độc gan UGT họ lớn bao gồm 22 loại protein, chia làm họ phân đoạn vào sở giải trình tự gen cấu trúc (Hình 1.1) [25] Hình 1.1 Cây phát sinh chủng loại protein UGT [25] Các protein UGT chủ yếu xúc tác cho phản ứng chuyển nhóm glucosyl axit uridine 5’ dip osphat glucuronic đến chất phù hợp hình thành chất hịa tan nước Các chất gắn nhóm glucosyl bao gồm chất khơng phân cực kích thước phân tử nhỏ steroit, bilirubin, hormon thuốc Phả n ứng chuyển hóa xúc tác UGT mơ tả Hình 1.2 [25] Trong UGT, protein thuộc phân họ UGT1A quan tâm cả, đóng vai trị t en chốt việc chấm dứt hoạt động sinh học tăng cường việc đào thải chất khơng phân cực thận Chính vậy, chúng giúp trì nồng độ chất đảm bảo cân nội môi [25] UGT1A tập trung chủ yếu gan đường ống tiêu hóa (dạ dày, ruột non, đại tràng) Bên cạnh cịn ghi nhận biểu UGT1A phổi, buồng trứng, tinh hoàn, tuyến vú tuyến tiền liệt [17] Uridine 5’ diphosphat glucuronic Nucleophin Enzym UGT Gốc glucuronyl Uridine 5’ diphosphat Hình 1.2 Phản ứng chuyể hóm glycosyl nhờ UGT UGT1A1 mã hóa gen UGT1A1 nằm nhiễm sắc thể số (2q37), gồm có 13 exon chia làm nhóm Nhóm bao gồm exon kí hiệu A1, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10) Nhóm gồm bốn exon, kí hiệu từ đến (Hình 1.3) exon nhóm mã hóa cho vị trí liên kết với chất với enzym có promoter riêng Sau phiên mã tổng hợp mARN, exon nhóm nối với exon nhóm 2, tạo chuỗi mARN khác nhau, từ tạo thành polypeptit khác [2] Hình 1.3 Sơ đồ locus UGT1A1 người Mỗi gen UGT1A bao gồm exon nhóm (A) exon nhóm phía sau (exone 2-5) Các exon nhóm luân phiên nối với exon nhóm phía sau tạo thành loại protein khác [25] 30 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Dựa vào kết nghiên cứu thu được, rút kết luậ n sau: Chúng tối ưu quy trình phân tích đa hình vùng promoter UGT1A1 mẫu mô bệnh phẩm đúc paraffin Áp dụng thành cơng quy trình phân tích gen bệnh nhân ung thư đại trực tràng làm phẫu thuật ngoại khoa 198 Bước đầu đánh giá tần số alen tần số kiểu gen đa vùng promoter thuộc gen UGT1A1 nhóm mẫu nghiên số alen UGT1A1*36, UGT1A1*1 UGT1A1*28 0,08 Tần số kiểu gen *1/*36, *36/*36 *1/*28 0,16 Kiến nghị Đa hình vùng promoter UGT1A1 nhiều nghiên cứu chứng minh có ảnh hưởng đến đáp ứng nhiều thuốc sử dụng điều trị liên quan đến hội chứng Gilbert, hội chứng Crigler – Najar Tuy nhiên chưa có nghiên cứu Việt Nam phân tích đa hình di truyền ứng dụng y dược Chính vậy, tơi kiến nghị: - Áp dụng quy trình phân tích đa hình vùng promoter gen UGT1A1 vào thực hành lâm sàng cho bệnh nhân sử dụng irinotecan điều trị ung thư đại trực tràng - Thu thập số liệu lâm sàng dược lý để tiến hành nghiên cứu sâu mối tương quan đa hình vùng promoter UGT1A1 với chuyển hóa thuốc chất chất ức chế UGT1A1 - Đánh giá khả phát hội chứng Gilbert, hội chứng Crigler – Naja thơng qua đa hình UGT1A1*28 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Long, Đ.Đ (2008), Cơ sở di truyền học phân tử tế bào pp.3 Luật, N.N (2012), Hóa Sinh - Sách đào tạo bác sĩ đa khoa, Bộ Y t ế Hà Nội, pp.7 TIẾNG ANH Akaba, K., T Kimura, A Sasaki, S Tanabe, T Wakabayashi, M Hiroi, S Yasumura, K Maki, S Aikawa, and K Hayas ka (1999), “Neonatal hyperbilirubinemia and a common mutation of the bilirubin uridine diphosphate-glucuronosyltransferase gene in Japanese”, Journal of human genetics, 44(1), pp 22-25 Anderson P.L., Lamba J., Aquilante C.L., and Schuetz E (2006), “Pharmacogenetic characteristics of indi vir, zidovudine, and lamivudine thrapy in HIV - infected adults: A pilot study”, J Acquir Immune Defic Syndr., 42, pp 441-449 Beutler, E., T Gelbart, and A Demina (1998), “Racial variability in the UDP-glucuronosyltransferase (UGT1A1) promoter: a balanced polymorphism for regulation of bilirubin metabolism?”, Proceedings of the National Academy of Sci nc s of the United States of America, 95(14), pp 8170-8174 Bosma, P.J., J.R Chowdhury, C Bakker, S Gantla, A De Boer, B.A Oostra, D Lindh ut, G.N Tytgat, P.L Jansen, R.P Oude Elferink, and Et Al (1995), “The genetic basis of the reduced expression of bilirubin UDPglucuronosyltransferase in Gilbert's syndrome”, The New England journal of medi ine, 333(18), pp 1171-1175 Boyd, M.A., P Srasuebkul, K Ruxrungtham, P.I Mackenzie, V Uchaipichat, M.J Stek, J.M.A Lange, P Phanuphak, D.A Cooper, W Udomuksorn, and J.O Miners (2006), “Relationship between hyperbilirubinaemia and UDP-glucuronosyltransferase 1A1 (UGT1A1) polymorphism in adult HIV-infected Thai patients treated with indinavir”, Pharmacogenetics and Genomics, 16(5), pp 321-329 Bulmer, A.C., J.T Blanchfield, I Toth, R.G Fassett, and J.S Coombes (2008), “Improved resistance to serum oxidation in Gilbert's syndrome: a 32 mechanism for cardiovascular protection”, Atherosclerosis, 199(2), pp 390396 Cady, N.C., S Stelick, and C.A Batt (2003), “Nucleic acid purification using microfabricated silicon structures”, Biosensors & bioelectronics, 19(1), ap 59-66 10 11 Fretzayas, A., M Moustaki, O Liapi, and T Karpathios (2012), “Gilbert syndrome”, European journal of pediatrics, 171(1), pp 11-15 Gupta, E., T.M Lestingi, R Mick, J Ramirez, E.E Vokes, and M.J Ratain 12 (1994), “Metabolic fate of irinotecan in hum ns: correlation of glucuronidation with diarrhea”, Cancer research, 54(14), pp 3723-3725 Hall, D., G Ybazeta, G Destro-Bisol, M.L etzl-Erler, and A Di Rienzo (1999), “Variability at the uridine diphosphate glucuronosyltransferase 1A1 promoter in human populations and primates”, Pharmacogenetics, 9(5), pp 591-599 13 Hirschfield, G.M and G.J Alexand r (2006), “Gilbert's syndrome: an overview for clinical biochemists”, A nals of clinical biochemistry, 43(Pt 5), ap 340-343 14 Iyer, L., C.D King, P.F Wh t ngton, M.D Green, S.K Roy, T.R Tephly, B.L Coffman, and M.J Ratain (1998), “Genetic predisposition to the metabolism of irinotecan (CPT-11) Role of uridine diphosphate glucuronosyltransferase isoform 1A1 in the glucuronidation of its active metabolite (SN-38) in human liver microsomes”, The Journal of clinical investigation, 101(4), pp 847-854 15 Jansen, P.L (1999), “Diagnosis and management of Crigler-Najjar syndrome”, European journal of pediatrics, 158 Suppl 2, pp S89-94 16 17 Lin, J.P., L.A Cupples, P.W Wilson, N Heard-Costa, and C.J O'donnell (2003) , “Evidence for a gene influencing serum bilirubin on chromosome 2q telomere: a genomewide scan in the Framingham study”, American journal of human genetics, 72(4), pp 1029-1034 Marques, S.C and O.N Ikediobi (2010), “The clinical application of 18 UGT1A1 pharmacogenetic testing: gene-environment interactions”, Human genomics, 4(4), pp 238-249 Marques, S.C and O.N Ikediobi (2010), “The clinical application of UGT1A1 pharmacogenetic testing: Gene-environment interactions”, Human genomics, 4(4), pp 238-249 33 19 Maruo, Y., M Behnam, S Ikushiro, S Nakahara, N Nouri, and M Salehi 20 (2015), “Two Different UGT1A1 Mutations causing Crigler- ajjar Syndrome types I and II in an Iranian Family”, Journal of gastrointestinal and liver diseases : JGLD, 24(4), pp 523-526 Maruo, Y., K Nishizawa, H Sato, Y Doida, and M Shimada (1999), “Association of neonatal hyperbilirubinemia with bilirubin UDPglucuronosyltransferase polymorphism”, Pediatrics, 103(6 Pt 1), pp 12241227 21 Minami, H., K Sai, M Saeki, Y Saito, S Ozawa, et l (2007), “Irinotecan pharmacokinetics/pharmacodynamics and UGT1A genetic polymorphisms in Japanese: roles of UGT1A1*6 and *28”, Pharmacogenet Genomics, 17(7), pp 497-504 22 Nataraj, A.J., I Olivos-Glander, N Kusukawa, and W.E Highsmith, Jr (1999), “Single-strand conformation polymorphism and heteroduplex analysis for gel-based mutation det ction”, Electrophoresis, 20(6), pp 11771185 23 Perera, M.A., F Innocenti, and M.J Ratain (2008), “Pharmacogenetic testing for uridine diphosphate glucuronosyltransferase 1A1 polymorphisms: are we there yet?”, Pharmacotherapy, 28(6), pp 755-768 24 Placeres Alsina M ., Tuset Creus M., and Miró J.M (2008), “Pharmacokinetics and interactions of raltegravir”, Enferm Infecc Microbiol Clin., 26, pp 23-28 25 Rowland, A., J.O Miners, and P.I Mackenzie (2013), “The UDPglucuronosyltransferases: their role in drug metabolism and detoxification”, The internati nal journal of biochemistry & cell biology, 45(6), pp 11211132 26 Schmid, R (1995), “Gilbert's syndrome a legitimate genetic anomaly?”, The New England journal of medicine, 333(18), pp 1217-1218 27 Syvanen, A.C (2001), “Accessing genetic variation: genotyping single nucleotide polymorphisms”, Nature reviews Genetics, 2(12), pp 930-942 Teh, L.K., H Hashim, Z.A Zakaria, and M.Z Salleh (2012), 28 “Polymorphisms of UGT1A1(*)6, UGT1A1(*)27 & UGT1A1(*)28 in three major ethnic groups from Malaysia”, The Indian journal of medical research, 136(2), pp 249-259 34 29 30 Tubbs, R.R., Do, M H.Stoler, and M Eds (2008), Cell and tissues based molecular pathology, ed 1st, Elsevier pp.23 Thomas, V., B Mazard, C Garcia, P Lacan, M.C Gagnieu, and P Joly (2013), “UGT1A1 (TA)n genotyping in sickle-cell disease: high resolution melting (HRM) curve analysis or direct sequencing, what is the best way?”, 31 32 Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry, 424, pp 258-260 Yamamoto, K., H Sato, Y Fujiyama, Y Doida, and T Bamba (1998), “Contribution of two missense mutations (G71R and Y486D) of the bilirubin UDP glycosyltransferase (UGT1A1) gene to p enotypes of Gilbert's syndrome and Crigler-Najjar syndrome type II”, Biochimica et biophysica acta, 1406(3), pp 267-273 Arias, I.M., L.M Gartner, M Cohen, J.B Ezzer, and A.J Levi (1969), “Chronic nonhemolytic unconjugated hyperbilirubinemia with glucuronyl transferase deficiency: Clinical, biochemical, pharmacologic and genetic evidence for heterogeneity”, The Am rican Journal of Medicine, 47(3), pp 395-409 33 34 35 TÀI LIỆU WEB http://gco.iarc.fr/today ngày 28/4/2017 https://www.nature.com/scitable/topicpage/the-biotechnology-revolution-pcr -and-the-use-553 ngày 28/4/2018 http://www.yeastern.com ngày 28/4/2017 35 PHỤ LỤC Phụ lục Quy trình tách chiết từ mẫu mơ đúc paraffin sử dụng Kit ReliaPrep™ FFPE gADN Miniprep System (Promega) Bước 1: Cắt mẫu thành khối nhỏ sấp xỉ 20 mg rửa lần PBS 1X lạnh, cắt nhỏ mẫu dao khử trùng o Bước 2: Chuyển mẫu vào ống 1.5 ml, thêm 500 µl dầu paraffin vào mẫu, ủ 80 C phút Trộn hỗn hợp Bước 3: Thêm 200 µl Lysis buffer vào mẫu Bước 4: Ly tâm 10.000 vòng 15 giây nhiệt độ p òng, dung dịch ống phân thành pha, pha nước pha dầu Bước 5: Thêm 20 µl Proteinase K vào pha dưới, trộn pha pipet Bước 6: Ủ 56oC 1h Bước 7: Ủ 80oC 4h Bước 8: Để nguội mẫu nhiệt độ phòng Ly tâm để thu kết tủa Bước 9: Thêm 10 µl RNase vào pha dưới, trộn pha pipet Bước 10: Ủ nhiệt độ phòng phút Bước 11: Thêm 220 µl BL Buffer vào mẫu Bước 12: Thêm 240 µl ethanol (95-100%) Trộn mẫu Bước 13: Ly tâm 10.000 vòng 15 giây nhiệt độ phòng Bước 14: Gắn cột Binding Column vào ống 1.5 ml Bước 15: Chuyển toàn phầ n dung dịch pha vào cột Binding Column Loại bỏ phần dầu paraffin Bước 16: Ly tâm 10.000 vòng 30 giây nhiệt độ phòng Bước 17: Loại bỏ phần dịch lọc Gắn lại cột Binding Column vào ống 1.5ml Bước 18: Thêm 500 µl 1X Wash Solution vào cột Binding Column Bước 19: Ly tâm 10.000 vòng 30 giây nhiệt độ phòng Bước 20: Lặ p lại bước 17-19 Bước 21: Mở nắp cột Binding Column, ly tâm ống 16.000 vòng phút nhiệt độ phịng để làm khơ cột Bước 22: Chuyển cột Binding Column vào ống 1.5ml bỏ ống cũ Bước 23: Thêm 30-50 µl Elution Buffer vào cột đóng nắp 36 Phụ lục Quy trình tách chiết từ mẫu máu sử dụng Kit E.Z.N.A blood DNA Mini kit (Omega-Biotek) Bước 1: Lấy 100 µl mẫu máu vào ống 1.5 ml Thêm Elution buffer đến 250 µl Bước 2: Thêm 25µl OB Protease Solution 250 µl BL Buffer Ly tâm 13.000 vòng 15 giây Bước 3: Ủ 65oC 10 phút Bước 4: Thêm 260 µl Ethanol 100% Ly tâm 13.000 vòng 20 giây Bước 5: Thêm cột HiBind ADN Mini vào ống ml Bước 6: Chuyển toàn mẫu vào cột Bước 7: Ly tâm 13.000 vòng phút Bước 8: Loại bỏ dung dịch lọc ống 1.5 ml Bước 9: Gắn cột HiBind ADN Mini vào ống ml Bước 10: Thêm 500 µl HBC Buffer Bước 11: Ly tâm 10.000 vòng phút Bước 12: Loại bỏ dung dịch lọc sử dụng lạ i ống ml Bước 13: Thêm 700 µl Wash Buffer Bước 14: Ly tâm 10.000 vòng phút Bước 15: Loại bỏ phần dịch lọc sử dụng lại ống ml Bước 16: Lặp lại bước 13-15 cho Wash Buffer lần thứ hai Bước 17: Ly tâm 10.000 vòng phút để làm khô cột lọc Bước 18: Chuyển cột HiBind ADN Mini vào ống ml o Bước 19: Thêm 100-200 µl Elution Buffer làm ấm đến 65 C Bước 20: Để hỗn hợp nhiệt độ phòng phút Bước 21: Ly tâm 13.000 vòng phút Bước 22: Lặp lại bước 19-21 để lần thứ hai o Bước 23: Bảo quản ADN -20 C Bước 24: Ly tâm 16.000 vòng phút nhiệt độ phòng Loại bỏ cột Binding Column o Bước 25: Bả o quản ADN tách chiết -20 C 37 Phụ luc Đánh giá chất lượng sản phẩm tách ADN tổng số Điện di sản phẩm ADN tổng số: µl sản phẩm ADN tổng số điện di gel argarose 0,7% 100V 30 phút Thang chuẩn sử dụng Lamdba ADN/HindIII Ladder với băng có kích thước 23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564 125 bp Đo mật độ quang mẫu ADN tổng số sử dụng bước sóng 260 nm 280 nm: Bước 1: Chọn chế độ đo chuỗi xoắn kép ADN hình Bước 2: Đo mẫu trắng: lấy μl đệm dùng để pha loãng ADN Bước 3: Đo mẫu ADN: lấy μl mẫu ADN để đo, máy tự động tính tốn nồng độ ADN số OD260/280 Mỗi mẫu ADN đo lần lặp lại 38 Phụ lục Kết giải trình tự kiểu gen UGT1A1*28 Mẫu Kết U1 U2 U3 U4 U5 U6 U7 39 U8 U9 U10 U11 U12 U13 U14 40 U15 U16 U17 U18 U19 U20 U21 41 U22 U23 U24 U25 U26 U27 U28 42 U29 U30 U31 U32 U33 U34 U35 43 U36 U37 U38 44 ... kết luậ n sau: Chúng tối ưu quy trình phân tích đa hình vùng promoter UGT1A1 mẫu mô bệnh phẩm đúc paraffin Áp dụng thành cơng quy trình phân tích gen bệnh nhân ung thư đại trực tràng làm phẫu... UGT1A1 Nội dung nghiên cứu: Tối ưu quy trình phân tích đa hình di truyền vùng promoter gen UGT1A1 mẫu mô bệnh phẩm đúc paraffin mẫu máu Áp dụng quy trình phân tích gen mẫu bệnh phẩm thu từ Bệnh viện... tài ? ?Tối ưu quy trình phân tích đa hình di truyền vùng promoter gen UGT1A1 bệnh nhân ung thư đại tr ực tràng” Kết đề tài cung cấp công cụ hỗ trợ đắc lực cho bác sĩ không việc điều trị ung thư đại