Phân tích đột biến gen tARN và ND3 của AND ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  - NGUYỄN THỊ NGỌC TÚ PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN tARN VÀ ND3 CỦA ADN TY THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Ngọc Tú PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN tARN VÀ ND3 CỦA ADN TY THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Trịnh Hồng Thái Hà Nội – 2012 MỤC LỤC BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT a DANH MỤC CÁC BẢNG c DANH MỤC CÁC HÌNH .d MỞ ĐẦU Chƣơng 1- TỔNG QUAN .3 1.1 TY THỂ 1.1.1 Hệ genome ty thể 1.1.2 Đột biến ADN ty thể bệnh ty thể .5 1.1.3 Đột biến ADN ty thể bệnh ung thƣ 1.2 UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG 10 1.2.1 Khái quát ung thƣ đại trực tràng 10 1.2.2 Nguyên nhân gây ung thƣ đại trực tràng 11 1.2.3 Phân loại dạng ung thƣ đại trực tràng theo mô học .12 1.2.4 Các phƣơng pháp chẩn đoán ung thƣ đại trực tràng [20] 15 1.3 ĐỘT BIẾN ADN TY THỂ VÀ BỆNH UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG 16 1.3.1 Đột biến gen tARN ADN ty thể 17 1.3.2 Đa hình gen ND3 ADN ty thể 19 1.3.3 Các phƣơng pháp phát đột biến gen ty thể giúp chẩn đoán bệnh 22 1.3.4 Tình hình nghiên cứu nƣớc 24 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 26 2.1 NGUYÊN LIỆU 26 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 26 2.1.2 Hóa chất 26 2.1.3 Thiết bị 27 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.2.1 Tách chiết ADN tổng số từ mô 28 2.2.2 Khuếch đaịđoaṇ gen 10398 đoạn gen 3243 ADN ty thểbằng PCR 29 2.2.3 Phân tích RFLP 31 2.2.4 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR sản phẩm cắt bằng enzym giới hạn 32 2.2.5 Tinh ADN 35 Chƣơng - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN ĐIỂM A3243G CỦA GEN tARN TY THỂ BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP 37 3.1.1 Tách chiết ADN tổng số từ mẫu mô ung thƣ đại trực tràng 37 3.1.2 Kết nhân đoạn gen 3243 ADN ty thể 38 3.1.3 Kết phân tích RFLP đoạn gen chứa vị trí 3243 ADN ty thể 38 3.2 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐA HÌNH A10398G CỦA GEN ND3 ADN TY THỂ BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP 40 3.2.1 Kết nhân đoạn gen 10398 ADN ty thể 40 3.2.2 Kết phân tích RFLP đoạn gen mang đa hình A10398G 41 3.2.3 Kết giải trình tự đoạn gen mang đột biến A10398G 42 3.2.4 Phân tich́ mối liên quan đa hinh̀ A10398G với đăcc̣ điểm bênh học lâm sàng bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng 46 ́ KÊT LUÂN 59 KIẾN NGHỊ 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC i Phụ lục Danh sách bệnh nhân đặc điểm lâm sàng i Phụ lục Kết giải trình tự đoạn 10398 vi Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _ BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt bp CPEO cs DHPLC EDTA KSS LHON LS MELAS MERRF mtDNA NARP ND3 PCR a Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _ RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn) ROS Reactive oxygen species (Các loại oxy phản ứng) SDS Sodium dodecyl sulfate SNP Single nucleotide polymorphism (Đa hình đơn nucleotide) TBE Tris borate EDTA TNM TumorNodeMetastasis b Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _ DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Hệ thống phân loại TNM ung thƣ đại trực tràng [29] 13 Bảng Các giai đoạn bệnh TNM tỉ lệ sống sót giai đoạn bệnh khác [29] 15 Bảng Thống kê mẫu sử dụng 26 Bảng Các hóa chất đƣơcc̣ sử dụng nghiên cƣ́u 26 Bảng Các thiết bị đƣơcc̣ sử dụng nghiên cƣ́u 27 Bảng Các cặp mồi đƣợc sử dụng phản ứng PCR 29 Bảng Thành phần phản ứng PCR với thể tích phản ứng 12,5 l 30 Bảng Thành phần phản ứng cắt sử dụng enzyme cắt giới hạn HaeIII vàDdeI 32 Bảng Dải nồng độ gel agarose dùng phân tách acid nucleic [6] .33 Bảng 10 Khả phân tách gel polyacrylamide acid nucleic [6] .34 Bảng 11.Các thành phần cần sử dụng cho gel dày 0,75 mm, kích thƣớc 7cm 35 Bảng 12 Phân bố đa hình A10398G ADN ty thể bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng theo đặc điểm bệnh học lâm sàng 46 c Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _ DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Sơ đồ cấu tạo ADN ty thể ngƣời [ 75] Hình Các bệnh liên quan đến rối loạn ADN ty thể [64] .6 Hình Genome ty thể với đột biến bệnh ung thƣ [19] .8 Hình Hình ảnh đại trực tràng [76] 11 Hình Các giai đoạn phát triển ung thƣ đại trực tràng [77] 15 Hình Một số đột biến điểm tARN ty thể ngƣời [59] 17 Hình Hình ảnh điện di ADN tổng số tách chiết từ mô 37 Hình Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen 3243 38 Hình Ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn 3243 với enzyme HaeIII 39 Hình 10 Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen 10398 41 Hình 11 Ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn 10398 với enzyme DdeI 42 Hình 12 Kết giải trình tự mẫu khơng mang đột biến A10398G 43 Hình 13 Kết so sánh trình tự mẫu khơng mang đột biến với trình tự ADN chuẩn ty thể 44 Hình 14 Kết giải trình tự mẫu mang đột biến A10398G 44 Hình 15 Kết so sánh trình tự mẫu mang đột biến với trình tự ADN chuẩn ty thể 45 Hình 16 Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo vị trí mơ 48 Hình 17 Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo giới tính 49 Hình 18 Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo tuổi 50 d Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _ Hình 19 Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo vị trí khối u 51 Hình 20 Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo kích thƣớc u 52 Hình 21 Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo số hạch 53 Hình 22 Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo giai đoạn TNM 54 Hình 23 Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo mức độ biệt hóa .55 e Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _ MỞ ĐẦU Ty thể bào quan phổ biến tế bào nhân chuẩn Ty thể đƣợc coi trung tâm lƣợng tế bào, diễn q trình chuyển hóa hợp chất hữu thành lƣợng mà tế bào sử dụng đƣợc ATP Ngồi ra, ty thể cịn đóng vai trị quan trọng nhiều q trình chuyển hóa khác nhƣ apoptosis (q trình tự chết tế bào), điều khiển tín hiệu Calci, điều khiển q trình trao đổi chất tế bào, tổng hợp nhân Heme, tổng hợp Steroid [32] Cho đến nay, ngƣời ta thống kê đƣợc 150 bệnh di truyền theo mẫu hệ khác ADN ty thể định Các bệnh rối loạn ADN ty thể thƣờng đƣợc biểu đa dạng, chúng liên quan đến rối loạn q trình mã hóa protein đơn đột biến thay đổi nucleotide [57] Trong vài năm trở lại đây, rối loạn ty thể liên quan đến bệnh ty thể đƣợc xem mục tiêu nghiên cứu di truyền học y học Đặc biệt, hƣớng nghiên cứu sử dụng ADN ty thể nhƣ thị sinh học phát triển nhanh chóng nhiều lĩnh vực khác liên quan đến bệnh chuyển hóa gặp, lão hóa, xác định đặc tính di truyền quần thể sử dụng dấu chuẩn di truyền mẹ… Trong số lĩnh vực phải kể đến ung thƣ – đề tài thu hút đƣợc quan tâm nhiều nhà khoa học Ung thƣ đại trực tràng loại ung thƣ phổ biến giới, đứng hàng thứ hai sau ung thƣ phế quản nam giới ung thƣ vú nữ giới Trên giới có khoảng 3,5 triệu bệnh nhân mắc bệnh hàng năm có thêm khoảng 600000 trƣờng hợp đƣợc phát [79] Ở Việt Nam, ung thƣ đại trực tràng chiếm tỷ lệ cao, đứng thứ hai tỷ lệ mắc bệnh ung thƣ đƣờng tiêu hóa, đứng sau ung thƣ dày Để đạt đƣợc hiệu điều trị tốt bệnh nhân cần đƣợc chẩn đoán sớm tốt Với phát triển khoa học, ngày Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _ 69 Wang Y., et al (2006), "Association of decreased mitochondrial DNA content with ovarian cancer progression", British Journal of Cancer, 95, pp 1087-1091 70 Warburg O (1930), "The metabolism of tumors", London Constable Co Ltđ 71 Webb E., Broderick P., and Chandler I (2008), "Comprehensive analysis of common mitochondrial DNA variants and colorectal cancer risk", British Journal of Cancer, 99, pp 2088-2093 72 Wu C W et al (2005), "Mitochondrial DNA mutations and mitochondrial DNA depletion in gastric cancer", Genes, Chromosomes and Cancer 44, pp 19-28 73 Ye C., Shu X., and Wen W (2008), "Quantitative analysis of mitochondrial DNA 4977-bp deletion in sporadic breast cancer and benign breast diseases", Breast Cancer Research Treatment 108, pp 427-434 74 Yeh J J., Lunetta K L., and van Orsouw N J (2000), "Somatic mitochondrial DNA (mtDNA) mutations in papillary thyroid carcinoma and differential mtDNA sequence variants in case with thyroid tumour", Oncogene, 19, pp 2060-2066 Tài liệu World wide web 75 http://chemistry.umeche.maine.edu/CHY431/Code4.html http://suckhoedoisong.vn/201012280936443p0c44/khong-chuquan-voi-dau-hieu-ban-dau.htm 76 77 https://www.c3life.com/ostomy/ostomybasics/colorectal-cancer/ 78 http://www.medicinenet.com/colon_cancer/article.htm 79 http://www.cancer.gov/cancertopics/types/colon-and-rectal 68 PHỤ LỤC Phụ lục Danh sách bệnh nhân đặc điểm lâm sàng Bệnh viện K, Tam Hiệp STT Họ tên Mã số 8702 Lê Văn S 10200 Dƣơng Thị H Nguyễn Sỹ V 9802 Lê Tất L 9807 Nguyễn Thị V 10489 Đỗ Văn C 8619 Nguyễn Tiến Ƣ 10517 Triệu Thị T 10597 Hoàng Thị Q 10 10600 Nguyễn Thị T 11 10608 Ninh Thị C i 12 10611 Bùi Công H 13 10626 Nguyễn Duy A 14 10731 Lê Thu P 15 10740 Ngũ Thanh H 16 10774 Phạm Văn T 17 11777 Nguyễn Thị T 18 11781 Dƣơng Văn T 19 11803 Cao Ngọc T 20 11812 Nguyễn Trung T 21 11822 Cao Xuân V 22 10282 Nghiêm Thị M 23 8276 Vũ Quang N 24 16678 Phạm Vĩnh B 25 16756 Nguyễn Văn T ii 26 16675 Đào Tiến L 27 16689 Trần Văn T 28 16890 Chu Thị C 29 16714 Trần Thị T 30 16723 Lê Đình H 31 8614 Lê Thị Y Bệnh viện Việt Đức STT Mã Họ tên Tuổi 32 2903 Nguyễn Văn S 71 33 3035 Nguyễn Thị M 61 34 3161 Đỗ Thị H 36 35 3352 Nguyễn Viết Q 95 36 3372 Nguyễn Khắc Q 63 37 3558 Nguyễn Hữu Đ 42 iii 38 3753 Hoàng Thị T 39 X7492 Nguyễn Thị N 40 X7488 Nguyễn Thị M 41 X7835 Đào Công H 42 X7825 Nguyễn Thị T 43 3822 Đỗ Thị H 44 3825 Đinh Văn G 45 3905 Nguyễn Thị T 46 3906 Nguyễn Thị T 47 4101 Nguyễn Thị X 48 4120 Đỗ Thị V 49 4297 Phạm Văn T 50 4374 Đoàn Thị R 51 4463 Nguyễn Văn M 52 4475 Nguyễn Thị G iv 53 4539 Hồng Đình X 54 4595 Trịnh Thị N 55 4603 Trần Văn V 56 4620 Ngơ Thị H 57 4644 Hồng Hữu T 58 4779 Nguyễn Văn N 59 4833 Nguyễn Thị P 60 4841 Cà Thị V 61 4942 Nguyễn Thị C v Phụ lục Kết giải trình tự đoạn 10398 vi vii viii ix ... sâu vào đột biến ADN ty thể gen tARN (Leu) (tại vị trí A3243G) gen ND3 (tại vị trí A10398G) 1.3.1 Đột biến gen tARN ADN ty thể Đột biến điểm tARN ty thể đột biến chiếm phần lớn đột biến ty thể. .. 1.1.2 Đột biến ADN ty thể bệnh ty thể .5 1.1.3 Đột biến ADN ty thể bệnh ung thƣ 1.2 UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG 10 1.2.1 Khái quát ung thƣ đại trực tràng 10 1.2.2 Nguyên nhân. .. phát đột biến A3243G bệnh nhân ung thƣ trực tràng Lorenc cs (năm 2003) nghiên cứu đột biến ADN ty thể gồm đột biến tRNA, rRNA số gen ty thể số mẫu ung thƣ, phát mẫu ung thƣ trực tràng có đột biến