Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học phần dưới mặt đất cây phong quỳ sa pa

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC HOÀNG THỊ HUYỀN DIỆU TIẾP TỤC NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC PHẦN DƢỚI MẶT ĐẤT CÂY PHONG QUỲ SA PA (Anemone chapaensis Gagnep.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Khóa: QH.2013.Y Người hướng dẫn: ThS HÀ THỊ THANH HƢƠNG TS NGUYỄN HỮU TÙNG HÀ NỘI-2018 LỜI CẢM ƠN Trong q trình hồn thiện khóa luận tốt nghiệp này, em nhận quan tâm, góp ý, bảo tận tình từ thầy giá, anh chị, gia đình bạn bè Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS.Hà Thị Thanh Hương, Giảng viên Bộ môn Dược liệu Dược cổ truyền TS Nguyễn Hữu Tùng, Giảng viên Bộ môn Hóa dược Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thiện khóa luận Em xin chân thành cảm ơn thầy Bộ mơn Hóa dược Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội giúp đỡ, tận tình dẫn cho em thực nghiên cứu Em xin gửi lời cảm ơn tới anh Phạ m Giang Nam bảo tận tình, giúp đỡ q trình nghiên cứu hồn thiện khóa luận Em xin cảm ơn tới anh chị nghiên cứu viên phịng Hóa phân tíchTiêu chuẩn, Viện Dược liệu tạo điều kiện giúp đỡ em nhiều trình nghiên cứu Viện Em gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô Khoa Y Dược dạy dỗ, trang bị kiến thức chuyên môn, tạo điều kiện cho em suốt trình học tập trường Cuối em xin cảm ơn tới gia đình, bạn bè ln quan tâm, động viên, giúp đỡ cho em hồn thiện khóa luận Em xin chân thành cảm ơn! Hà nội, tháng 4, năm 2018 Sinh viên Hoàng Thị Huyền Diệu DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT BuOH n-butanol 13C-NMR Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer ESI-MS Electrospray Ionization Mass Spectroscopy EtOAc Ethyl acetat GF245 Gypsum fluorescent 254nm 1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance HPLC High Performance Liquid Chromatography MeOH Metanol MS Mass Spectroscopy RP18 Reverse Phase C-18 SKLM Sắc ký lớp mỏng UV Ultra violet MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chi Anemone .2 1.1.1 Vị trí, phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Số lượng phân bố chi Anemone 1.2 Tổng quan Phong quỳ Sa Pa (Anemone chapaensis Gagnep.) 1.2.1 Đặc điểm thực vật 1.2.2 Phân bố 1.3 Thành phần hóa học chi Anemone 1.3.1 Các saponin 1.3.2 Các flavonoid 10 1.3.3 Một số thành phần hóa học khác 11 1.4 Tác dụng sinh học chi Anemone 14 1.4.1 Công dụng dân gian 14 1.4.2 Công dụng sinh học nghiên cứu 15 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Đối tương nghiên cứu 16 2.2 Hóa chất trang thiết bị 16 2.2.1 Hóa chất 16 2.2.2 Thiết bị, máy móc, dụng cụ 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu .17 2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu chiết xuất 17 2.3.2 Phương pháp phân lập, phân tách hợp chất 18 2.3.3 Phương pháp xác định cơng thức hóa học 18 2.3.4 Phương pháp phân tích định tính hợp chất sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 20 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 21 3.1 Phân lập xác định cấu trúc hợp chất từ phần mặt đất Phong quỳ Sa Pa .21 3.1.2 Phân lập chất từ rễ Phong quỳ Sa Pa 21 3.1.2 Xác định cấu trúc hợp chất thu 22 3.2 Phân tích định tính hợp chất sắc ký lỏng hiệu cao 28 3.3 Bàn luận 29 KẾT LUẬN 30 KIẾN NGHỊ 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤC LỤC PHỤC LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Phân bố 50 loài sử dụng làm thuốc Bảng 3.2 Số liệu phổ 1H 13C-NMR hợp chất PQRB 23 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Tiêu thực vật Anemone chapaensis Gagnep.[28] .6 Hình 1.2 Cấu trúc khung olean Hình 1.3 Các khung olean (nhóm A) phân lập từ chi Anemone Hình 1.4 Các hợp chất saponin phân lập tư Anemone raddeana Regel Hình 1.5 Các khung triterpen khác (nhóm B,C,D) từ chi Anemone Hình 1.6 Một số flavonoid phân lập từ chi Anemone 11 Hình Sơ đồ tách chiết dược liệu 18 Hình 3.1 Sơ đồ phân lập số hợp chất từ phân đoạn BuOH rễ Phong quỳ Sa Pa 22 Hình 3.2 tín hiệu methyl mũi đơn 25 Hình 3.3 Tín hiệu CH3 phổ DEPT 26 Hình 3.4 Phổ 13C-NMR: Tín hiệu olefin cacboxylic 26 Hình 3.5 Phổ 1H-NMR: protons anomer hợp chất PQRB1 27 Hình 3.6 Công thức cấu tạo hợp chất PQRB1 28 Hình 3.7 Sắc ký đồ HPLC hợp chất PQRB1 29 Hình 3.8 Sắc ký đồ HPLC cao phân đoạn n-butanol phần mặt đất Phong quỳ Sa Pa .29 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện xu hướng sử dụng sản phẩm chăm sóc sức khỏe từ thiên nhiên phát triển với ưu điểm chứa nhiều thành phần q, điều trị hiệu quả, có tác dụng phụ Vì cần trọng vào việc tìm kiếm, nghiên cứu khai thác nguồn tài nguyên Việt Nam quốc gia nằm khu vực nhiệt đới ẩm gió mùa, nguồn dược liệu (thực vật, động vật, khống vật…) dùng làm thuốc vơ phong phú Từ xa xưa ông cha ta biết khai thác nguồn tài nguyên dược liệu để phòng bệnh chữa bệnh, nhiên việc điều trị dừng lại việc dùng trực tiếp chế biến thành nguyên liệu thô sơ, điều trị theo kinh nghệm thân địa phương, chưa hiều đượ c hết tác dụng, cơng dụng thành phần hóa học tạo tác dụng c dược liệu, hầu hết loại dùng làm thuốc chưa nghiên cứu đầy đủ Cây Phong quỳ Sa Pa, loại đặ c hữu địa phương người dân sử dụng nhiều điều trị bệnh viêm họng, viêm amydal, viêm túi mận, đau dày… Song nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng sinh học Phong quỳ Sa Pa cịn Các nghiên cứu trước phân lập 04 hợp chất từ Phong quỳ Sa Pa là: Ethyl caffeat, blumenol A từ phân đoạn EtOAc phần mặt đất huzhangosid A, huzhangosid C từ phân đoạn BuOH phần mặt đất Để cung cấp thêm sở cho việc sử dụng bảo tồn loài đặc hữu Sa Pa làm thuốc Việt Nam, đề tài “Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học phần mặt đất Phong quỳ Sa Pa (Anemone chapaensis Gagnep.)” đượ c thực nhằm mục tiêu: Phân lập thêm hợp chất tinh khiết từ phần mặt đất Phong quỳ Sa Pa Xác định cấu trúc hợp chất phân lập CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chi Anemone 1.1.1 Vị trí, phân loại Vị trí phân loại chi Anemone [1, 2] Giới Thực vật (Plantae) Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Bộ Hoàng Liên (Ranunculales) Họ Hoàng Liên (Ranunculaceae) Chi Anemone 1.1.2 Đặc điểm thực vật Là loại thảo sống lâu năm, gố c thành rễ mọc thành bụi Lá mọc so le, bị cắt sâu nhiều Hoa đều, đơn độc hay thường thành tán có bao chung bao gồm chét Đài dạng cánh có màu vàng, lam, trắng, đỏ, 5-10 phiến, khơng có tràng, nhị nhiều, nốn có vịi nhụy Quả bế, đơn hạt, rời, tập hợp thành đầu.[1] 1.1.3 Số lƣợng phân bố chi Anemone Trên giới có khoảng 120-150 lồi, phân bố rộng khắp châu lục, tập trung nhiều nước ôn đới Ấn Độ, Nepal, Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Việt Nam Đặc biệt Trung Quốc tập trung tới 50 lồi [3, 15, 22, 23] Trong có 50 lồi sử dụng làm thuốc[6] Bảng 1: Phân bố 50 loài sử dụng làm thuốc STT Loài A.altaica A.amurensis A.anhuiensis A.baicalensis A.biflora A.begoniifolia A.canadensis A.cathayensis A.chosenicola var schantungensis A.cylindrica 10 A.davidii 11 A.delavayi 12 A.demissa 13 A.demissa var.major 14 A.demissa var villosis 15 A.dichotoma 16 A.drummondii 17 A.flaccida 18 A.flaccida var hofeng 19 A.fulinggensis 20 A.griffithii 21 A.hupehensis 22 A.hupehensis f alba 23 A.imdricata Pha thường Cắn n-butanol (100g) Pha đả o PĐ13 (1,3g) PĐ13.1 Hình 3.1 Sơ đồ phân l ậ p số hợp chất từ phân đoạn BuOH rễ Phong quỳ Sa Pa 3.1.2 Xác định cấu trúc hợp chất thu đƣợc Hợp chấ t PQRB1 Tính chất: Bột vơ định hình màu trắng Phổ ESI-MS (m/z): 884,6 [M+Na]+ Phổ 1H-NMR (CD3OD; 500MHz) 13C-NMR (CD3OD; 125 MHz): xem bảng 22 Bảng Số liệu phổ 1H 13C-NMR hợp chất PQRB Vị trí δCb 39,1 26,3 81,0 43,5 47,6 18,1 32,7 39,8 48,1 10 36,8 11 23,7 12 122,8 13 144,0 14 42,0 15 28,2 16 23,3 17 46,9 18 41,6 19 46,1 20 30,7 21 33,9 22 32,4 23 63,9 24 14,1 25 16,1 26 17,5 27 26,0 28 176,5 29 33,0 30 23,6 Ara 104,8 75,4 75,0 69,6 66,1 Rha I 101,3 71,9 81,2 72,7 69,6 18,4 Rib 104,5 72,7 68,8 70,2 65,2 a : Đo CD3OD; b: Đo C5D5N Hợp chất PQRB1 thu dạng bột vơ định hình, màu trắng Phổ khối ESI-MS có đỉnh ion m/z: 884,6 [M+Na]+, tương ứng với công thức phân tử C46H74O16 Trên phổ 1H-NMR, tín hiệu methyl singlet δ H 0,82 (s, H-24); 1,00 (s, H-25); 0,73 (s, H-26); 1,19 (s, H-27); 0,93 (s, H-29); 0,97 (s, H-30) Hình 3.2 tín hiệu methyl mũi đơn 25 Hình 3.3 Tín hiệu CH3 phổ DEPT Kết hợp với tín hiệu carbon olefin δC 123,8 (C-12) 144,9 (C-13) tín hiệu nhóm carboxylic δC 178,2 (C -28) phổ 13C-NMR gợi ý phần aglycon PQRB1 khung triterpenoid nhóm hederagenin ppm Hình 3.4 Phổ 13C-NMR: Tín hiệu olefin cacboxylic Ngồi cịn xuất tín hiệu proton anomeric δ H 1,55; 5,24;5,02 ppm; tương đương với carbon anomer δC 104,6; 101,6; 104,2 cho 26 thấy cấu trúc PQRB1 có đơn vị đường Đường nhận định arabisone, đơn vị đường rhamnose, đơn vị đường ribose ppm Hình 3.5 Phổ 1H-NMR: protons anomer hợp chất PQRB1 Vị trí g ắn đường với với khung olean suy luận từ tương quan HMBC Tương quan H-1(Ara)/C-3, H-1(Rha I)/C2(Ara) H-1(Rib)/C-3(Rha I) cho phép khẳng định vị trí liên kết phần aglycon với phần đường vị trí C-3 khung olean, cầu nối đường lại vị trí C-2(Ara) C-3(Rha I) Kết hợp tài liệu tham khảo[12], PQRB1 xác định 3-O–β–D–ribopyranosyl (1→3)–α-L–rhamnopyranosyl (1→2)-α–L-arabinopyranosyl hederagenin 27 Hình 3.6 Cơng thức cấu tạo hợp chất PQRB1 3.2 Phân tích định tính hợp chất sắc ký lỏng hiệu cao Lựa chọn điều kiện sắc ký dựa tài liệu tham khao SKLM sau:  Máy sắc ký lỏng hiệu cao Agilent 1260 Infinity  Cột sắc ký: Agilent Eclipse XD B-C18 (kích thước cột 4,6 x 250mm, cỡ hạt 5µ)  Detector UV phát bước sóng 208nm  Pha động: Aceton nitrin-Acid acetic 0,2%/Nước (4:1, v/v)  Tốc độ dòng: 0,8ml/phút  Thể tích mẫu bơm: 20µl  Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ phịng Pha mẫu thử: 28mg cao dược liệu phần mặt đất Phong quỳ Sa Pa hịa tan 1000µl methanol, siêu âm 10phút cho cao hịa tan hồn tồn, lọc mẫu qua màng 0,45 micromet Tương tự làm với hợp chất PQRB1: hòa tan 2mg hợp chất PQRB1 1000µl methanol, siêu âm 10 phút, lọc qua màng 0,45 micromet Kết quả:  Hợp chất PQRB1 có thời gian lưu tR=23,284 28  Diện tích pic PQRB1 bé sắc ký đồ HPLC cao nButanol, hàm lượng chất tách tương đối nhỏ phần rễ Phong quỳ Sa Pa Hình 3.7 Sắc ký đồ HPLC hợp chất PQRB1 Hình 3.8 Sắc ký đồ HPLC cao phân đoạn n-butanol phần mặt đất Phong quỳ Sa Pa 3.3 Bàn luận Quá trình phân lập hợp chất sử dụng phương pháp sắc ký: sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, sắc ký l ỏng hiệu cao Phương pháp sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng phương pháp sử dụng phổ biến giá thành rẻ, nguyên vật liệu dễ kiếm, khai triển với lượng mẫu tương đối lớn Dựa thực nghiệm, bước đầu xây dựng kiều kiện sắc ký HPLC đối v ới hợp chất saponin phân lập từ phần mặt đất Phong quỳ Sa Pa Đề tài phân lập hợp chất từ phân đoạn n-butanol Phong quỳ Sa Pa, dựa theo đặc điểm hóa lý, phương pháp phổ bao gồm phổ khối (MS), phổ cộng hưởng hạt nhân (NMR) so sánh tài liệu tham khảo xác định hợp chất PQRB1 29 KẾT LUẬN Qua trình thực hiện, đề tài đạt mục tiêu đề thu số kết sau: Đã phân lập hợp chất PQRB1 3-O–β–D–ribopyranosyl(1→3)– α-L–rhamnopyranosyl(1→2)-α–L-arabinopyranosyl hederagenin từ phần mặt đất Phong quỳ Sa Pa phương pháp sắc ký gồm: sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC Xác định cấu trúc hợp chất dựa sở liệu phổ MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC tài liệu tham khảo Hợp chất 3-O–β–D–ribopyranosyl(1→3)–α-L–rhamnopyranosyl(1→2)-α–Larabinopyranosyl hederagenin lần phân lập từ loài Anemone chapaensis Gagnep, bổ sung, hoàn thiên thêm hợp chất từ chi Anemone KIẾN NGHỊ Do thời gian nghiên cứu cịn hạn hẹp, khóa luận đóng góp phần nhỏ phân lập hợp chấ t loài Phong quỳ Sa Pa (Anemone chapaensis Gagnep.) chi Anemone Cây phong quỳ Sa Pa hứa hẹn mang lại nhiều tiêm điều trị bênh, em xin đưa số kiến nghị sau: Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn khác phần mặt đất Phong quỳ Sa Pa Nghiên cứu tác dụng sinh học chất có Định tính dấu vân tay sắc ký cho hợp chất hóa học có phân mặt đất phân mặt đất Phong Quỳ Sa Pa 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Việt Nam Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất trẻ, 320 Võ Văn Chi (2003), Từ điển thực vật thông dụng, NXB Khoa học Kỹ thuật Gagnepain F (1929), "Deux Anémones nouvelles d'Indo-Chine", Bulletin de la Société Botanique de France 76(2), tr 315-316 Gong WZ (2011), "Chemical constituents and bioactivity of Anemone cathayensis", Beijing: Minzu University of China Guan , Ying-Yu, et al (2015), "Raddeanin A, a triterpenoid saponin isolated from Anemone raddeana, suppresses the angiogenesis and growth of human colorectal tumor by inhibiting VEGFR2 signaling.", Phytomedicine 22.1, tr 910-913 Hao , Da-Cheng, Xiaojie Gu, and Peigen Xiao (2017), "Anemone medicinal plants: ethnopharmacology, phytochemistry and biology", Acta Pharmaceutica Sinica B Harvard University Herbaria (2008), Flora of North America, Anemone Genus Ji C , Cheng G, Tang H, Zhang Y, Hu Y, Zheng M, et al (2015), "Saponin of Anemone taipaiensis inhibits proliferation and induces apoptosis of U87 MG cells", Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology 31(484-486) Liao X , Li BG, Wang MK, Ding LS, Pan YJ, Chen YZ (2001), "The chemical constituents from Anemone rivularis", Chem J Chin Univ 22, tr 1338-1341 10 Liu , Qing, et al (2015), "Crude triterpenoid saponins from Anemone flaccida (Di Wu) exert anti-arthritic effects on type II collagen-induced arthritis in rats", Chinese medicine 10.1, tr 20 11 Lu Jincai et al (2009), "Structure elucidation of two trierpenoid saponins from Anemone raddeana Regel", Fitoterapia 80, tr 345-348 12 Mizutani K , Ohtani K., Wei J.-X., Kasai R., Tanaka O (1984), "Saponins from Anemone rivularis" 34(5), tr 327-331 13 Ren , F.Z., Zhang, X.X., Niu, G.Y., Zhang, l., Shan, B.E., and Liu, G.C (2005), "The research on antitumor constituents of Anemone raddeana Regel", Zhong Cao Yao 36, tr 1775-1778 14 Ren FZ , Chen SH, Zheng ZH, Zhang XX, Li LH, Dong AH (2012), "Coumarins of Anemone raddeana Regel and their biological activity", Acta Pharm Sin 47, tr 206-209 15 Shao JH , Zhao CC, Liu MX (2011), "Separation and structural identification on the anti-tumor activity of Anemone rivularis", J Yangzhou Univ (Nat Sci Ed) 14, tr 48-50 16 Shi B , Liu W, Gao L, Chen C, Hu Z, Wu W (2012), "Chemical composition, antibacterial and antioxidant activity of the essential oil of Anemone rivularis", Journal Med Plant Res 6, tr 4221-4224 17 Sun YX , Liu JC., Liu DY (2011), "Phytochemicals and bioactivities of Anemone raddeana Regel: a review", Pharmazie 66, tr 813-821 18 Toki K , Saito N, Shigihara A,Honda T (2001), "Anthocyanins from the scarlet flowers of Anemone coronaria", Phytochemistry 56, tr 711715 19 Wang B.X , Cui J.C.,and Liu A.J (1985), "Studies on pharmacological action of saponin of the root of Anemone raddeana", J Tradit Chin Med 5, tr 61-64 20 Wang JR , Peng SL.,Wang MK.,Feng JT.,Ding LS., (1999), "Chemical constituents of the Anemone tomentosa root", Acta Bot Sin 41, tr 107-109 21 Wang M.K , Ding L.S.,Wu F.E (2008), "Anti-tumor activity of crude saponin from Anemone raddeana Regel", Chin J Appl Environ Biol 14, tr 378-382 22 Wang , Xiaoyang, et al (2013), "Oleanane-type saponins from Anemone taipaiensis and their cytotoxic activities", Fitoterapia 89, tr 224-230 23 Wang YZ , Zeng G, Zhang M, Liu Y (2014), "Chemical constituents from rhizoma of Anemone altaica.", Chin Trad Herb Drug 45, tr 1219-1222 24 Xue , Gang, et al (2013), "Raddeanin A induces human gastric cancer cells apoptosis and inhibits their invasion in vitro", Biochemical and biophysical 439.2, tr 196-202 25 Yan ZK , Liu SY, Zhang YL, Ni XZ, Jia L (1990), "Preliminary study on the insecticidical activity and chemical components of Anemone hupehensis L", Acta Bot Boreali-Occident Sin 10, tr 141-148 26 Zhang Y , Huang XJ, Wang Y, Ye WC (2014), "Non-saponin compounds from the rhizomes of Anemone amurensis", Food Industr 35, tr 99-101 27 Zhang Y , Yang Q E., (2014), "The identity of Anemone chappensis (Ranunculaceae) from Vietnam", Tropical and Subtropical Botany 22(4), tr 335-340 28 ZOU Zhong-Jie , DONG Yue-Sheng, YANG Jun-Shan (2005), "Chemical constituents of the Roots of Anemone altaica Fisch ex C A Mey", Journal of Integrative Plant Biology 47 (9), tr 1145-1147 29 Zou ZJ , Yang JS (2008), "Studies on chemical constituents of rhizoma Anemones altaicae", Mod Chin Med 23, tr 10 -11 PHỤC LỤC KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC PHỤC LỤC DỮ LIỆU PHỔ HỢP CHẤT PQRB1 ... BuOH phần mặt đất Để cung cấp thêm sở cho việc sử dụng bảo tồn loài đặc hữu Sa Pa làm thuốc Việt Nam, đề tài ? ?Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học phần mặt đất Phong quỳ Sa Pa (Anemone chapaensis... KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Phân lập xác định cấu trúc hợp chất từ phần dƣới mặt đất Phong quỳ Sa Pa 3.1.2 Phân lập chất từ rễ Phong quỳ Sa Pa Phân đoạn n-butanol từ phần mặt đất Phong qu ỳ Sa Pa phân... chapaensis Gagnep.) chi Anemone Cây phong quỳ Sa Pa hứa hẹn mang lại nhiều tiêm điều trị bênh, em xin đưa số kiến nghị sau: Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn khác phần mặt đất Phong