Hệ th ống sắc ký hiệu năng cao Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Mỹ).
Hệ thống chiết hồi lưu với bình cầu có dung tích từ 10-2000ml
Máy đo phổ khối HP 5989B (Viện Hoá học, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 1H-NMR ; 13C-NMR ; DEPT (Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam)
Dụng cụ chạy sắc ký: cột thủy tinh đường kính từ 1-10cm, dài 30- 100cm, bình cầu từ 50-2000ml, ống nghiệm, ống đựng mẫu, pipet… Dụng cụ trong chạy HPLC
Các dụng cụ thí nghiệm thuộc Viện Dược liệu và bộ môn Hóa dược và kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phƣơng pháp xử lý mẫu và chiết xuất
Dược liệu là rễ cây Phong quỳ Sa Pa rửa sạch, phơi khô chiết bằng phương pháp chiết nóng bằng dung dịch ethnol 96% ở 70oC, chiết 3 lần, sau đó dịch chiết cất thu hồi dung môi ta thu được cắn.
Hòa tan cắn vào nước sau đó lắc với lần lượt các dung môi có độ phân cực tăng dần (n-hexan, ethyl acetat, n-butanol). Mỗi dung môi chiết 3 lần, sau đó các phân đoạn được cất thu hồi ta thu được cao từng phân đoạn.
Dược liệu
Chiết với EtOH 96% Cô thu hồi dung môi
Cắn dược liệu
Lắc 3 lần với n-hexan Cô thu hồi dung môi
Cắn n-hexan
Lắc 3 lần với EtOAc Cô thu hồi dung môi
Hình 2. Sơ đồ tách chiết dược liệu
2.3.2. Phƣơng pháp phân lập, phân tách các hợp chất
Để phân tách, phân lập các phân chiết của dược liệu ta s ử dụng phương pháp sắc ký: sắc ký lớp mỏng (TLC dùng để khảo sảt), sắc ký cộ t với chất hấp thụ là silica gel pha thuận và pha đảo, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Sắc ký lớp mỏng (TLC): được thực hiện trên bản mỏng có đế nhôm Kieselgel 60 F254 (Merck), và bản mỏng pha đảo RP18 F245s (Merck, 0,25mm). Hiện màu băng thuốc thử acid sufuric 10%/acetat đốt trên bếp điện ở 110oC.
Sắc ký cột (CC): sử dụng cột thủy tinh có đường kính từ 1-30cm, chiều dài từ 30-100cm, sử dụng các chất hấp thụ là silica gel pha thường với cớ hạt 63-200 µm dùng cho các cột có đường kính to 10cm hoặc cỡ hạt 40-63 µm dùng cho các cột có kích thước bé hơn (đường kính nhỏ hơn 5cm), silica gel pha đảo với cỡ hạt 30-50µm.
2.3.3. Phƣơng pháp xác định công thức hóa học
Phương pháp phổ học ngày nay được sử dụng rất nhiều trong phân tích và xác định các chất. Các lo ại phổ thường dùng trong phân tích dược liệu là: phổ tử ngoại – khả kiến (UV-Vis), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lương (MS) và phổ cộng hưởng từ hạ t nhân (NMR). Ngoài ra, các loài phổ khác trong các chừng mực nhất định cũng được sử dụng (phổ nhiễu xạ đơn tinh thể tia X, phổ huỳnh quang, phổ cận hồng ngoại (near IR, NIR) và Raman, phổ lưỡng cực vòng, và tán sắc quay…).
Ưu điểm của các phương pháp phổ là cho biết các đặc điểm cấu trúc của các chất, giúp cho việc xác định cấu trúc của các chất chưa biết hay định danh các chất đã biết bằng cách so sánh phổ với các chất chuẩn. Chúng cũng được dùng trong xác định hàm lượng các chất khi so sánh độ hấp thụ/ cộng hưởng của mẫu định lượng với độ hấp thu/cộng hưởng của mẫu chuẩn.
Phổ tử ngoại và khả kiến: sự hấp thụ năng lượng điển tử trong vùng sóng ánh sáng tử ngoại gần (190-400nm) và khả kiến (400-780nm) của các
chất gây ra sự chuyển dịch của các điển tử từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích. Biểu đồ biểu diễn sự tương quan giữa cường độ hấp thụ theo bước sóng của một chất được gọi là phổ UV-Vis của các chất ấy trong những điều kiện xác định.
Phổ hồng ngoại: sự hấp thụ hồng ngoài (IR) trong vùng hồng ngoại giữa (mid IR, MIR, 4000-400 cm-1) là do các dao động (co giãn, cắt kéo hay đối xứng) của các liên kết trong phân tử. So với phổ UV-Vis, phổ hồng ngoại cho nhiều thông tin cấu trúc hơn, nhưng các thông tin về liên kết đôi, liên kết ba, liên kết với các dị tố, các nhóm thế…có ích cho việc xác định cấu trúc các chất. Phổ IR cũng có nhiều băng hấp thu đặc trưng cho từng chất hơn, đặc biệt ở vùng điểm chỉ. Vì thế việc so sánh phổ IR của các chất với chất chuẩn có thể giúp định danh các chất.
Phổ khối lượng (MS, thường đượ c gọi là phổ khối) là phổ được ứng dụng nhiều nhất hiện nay trong phân tích và xác định các hợp chất tự nhiên. Phổ khối cung cấp các thông tin về khối lượng của các ion sinh ra từ phân tử. Trong cùng một điều kiện ion hóa, sự phân mảnh tạo thành các ion con từ ion mẹ sẽ tuân theo những quy luật nhất định. Các chất có cấu trúc tương tự nhau sẽ tạo ra những phân mảnh giống nhau. Từ khối lượng phân tử và các phân mảnh phân tử, cùng với các phương pháp phổ khác người ta có thể xác định được cấu trúc của một ch ất chưa biết. So sánh phổ khối của một chất với phổ khối của một chất đã biết có thể giúp định danh chất đó dễ dàng và chính xác.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cùng với phổ khối và nhiễu xạ đơn tinh thế tia X hiện là những công cụ mạnh và thường được sử dụng nhất hiện nay trong xác đị nh c ấu trúc hợp chất hữu cơ. Có nhiều kỹ thuật xác định phổ công hưởng từ h ạt nhân khác nhau được áp dụng. Một số kỹ thuật dùng để xác định những đặc tính cộng hưởng nhất định của hạt nhân. Tùy vào mục đích và mức độ phức tạp của cấu trúc, người ta có thể đo 1 hay nhiều loại phổ khác nhau. Người ta có thể xác định phổ của cùng một loại hạt nhân (1H, hay
13C) như trong các phổ một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT), hay các mối tương quan giữa các loại hạt nhân trong các phổ hai chiều (COSY, HETCOR,
Phổ proton (1H-NMR) cho biết môi trường của các proton trong phân tử các proton trong môi trường hóa học khác nhau sẽ có các dịch
chuyển hóa khác nhau.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C-NMR) cung cấp các thông tin về môi trường hóa học của carbon
Các kỹ thuật xác định các proton trên carbon cho biết só lượng proton liên kết trên mỗi carbon. Kỹ thuật thường được sử dụ ng hiện nay là DEPT, trong phổ DEPT-135, carbon bậc IV không xuất hiện, carbon bậc II là các đỉnh âm, carbon bậc III và I là các đỉnh dương, phổ DEPT- 90 chỉ còn lại các carbon bậc III là các đỉnh dương trong phổ.
Ngoài các kỹ thuật phổ 1 chiều, các kỹ thu ật phổ hai cho biết các thông tin về tương tác giữa C và H gắn trực tiếp trên nó (HSQC), giữa proton và các carbon kế cận nhau (phổ COSY), hay phổ tương tác dị nhân (HETCOR) giữa proton và carbon kế cận (thường dùng hiện nay là HSQC) hay xa hơn (long-range HETCOR, thường dùng hiện nay là HMBC), hoặc giữa các proton gần nhau trong không gian (NOESY,ROESY)
Các loại phổ khác: phổ nhiễu xạ đơn tinh thể tia X, phổ tán sắc quay quang, phổ lưỡng cực vòng cũng được sử dụng để xác định cấu trúc các chất.
2.3.4. Phƣơng pháp phân tích định tính hợp chất bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao xác định một thành phần trong các cao dược liệu, phân đoạn chiết xuất bằng cách dựa vào các thông số thời gian lưu đặc trưng cho chất cần tách. Sử dụng hệ thống Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Mỹ).
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Phân lập và xác định cấu trúc hợp chất từ phần dƣới mặt đất cây Phong quỳ Sa Pa
3.1.2. Phân lập chất từ rễ Phong quỳ Sa Pa
Phân đoạn n-butanol từ phần dưới mặt đất cây Phong qu ỳ Sa Pa được phân tách thô bằng sắc ký cột với silica gel pha thường, cột s ắc ký được rửa sạch, lót một lớp bông mỏng dưới đáy, nhồi cột bằng phương pháp nhồi cột ướt với chất nhồi cột là silica gel pha thường, cột được ổn định từ 12-24 giờ.
Cắn phân đoạn n-butanol (100g) được hòa tan bằng MeOH, được chạy sắc ký qua cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi EtOAc:MeOH:H2O theo gradient nồng độ tỷ l ệ 15:1:0,3 đến MeOH 100%. Kiểm tra các dịch rửa giải bằng sắc ký lớp mỏng, dồn các cột có độ đồng nhất cao, ta thu được phân đoạn PĐ13.
Phân đoạn PĐ13 (1,3g) được phân lập trên sắc ký pha đảo RP-18, rửa giải với hệ dung môi MeOH: H2O theo nồng độ MeOH tăng dần từ 70%-90%. Kiểm tra các dịch rửa giải bằng SKLM, dồn các cột có độ đồng nhất cao thu được chất PQRB1 (31mg).
Cắn n-butanol (100g) th ườ ng Ph a PĐ13 (1,3g) o P ha đ ả PĐ13.1
Hình 3.1. Sơ đồ phân l ậ p một số hợp chất từ phân đoạn BuOH của rễ cây
Phong quỳ Sa Pa
3.1.2. Xác định cấu trúc hợp chất thu đƣợc Hợp chấ t PQRB1
Tính chất: Bột vô định hình màu trắng. Phổ ESI-MS (m/z): 884,6 [M+Na]+
Phổ 1H-NMR (CD3OD; 500MHz) và 13C-NMR (CD3OD; 125 MHz): xem
bảng 3.
Bảng 3. Sốliệu phổ1H và13C-NMR của hợp chất PQRB Vị trí δCb 1 39,1 2 26,3 3 81,0 4 43,5 5 47,6 6 18,1 7 32,7 8 39,8 9 48,1 10 36,8 11 23,7 12 122,8 13 144,0 14 42,0 15 28,2 16 23,3
18 41,6 19 46,1 20 30,7 21 33,9 22 32,4 23 63,9 24 14,1 25 16,1 26 17,5 27 26,0 28 176,5 29 33,0 30 23,6 Ara 1 104,8 2 75,4 3 75,0 4 69,6 5 66,1 Rha I 1 101,3 2 71,9 3 81,2 4 72,7
5 69,6 6 18,4 Rib 1 104,5 2 72,7 3 68,8 4 70,2 5 65,2
a: Đo trong CD3OD; b: Đo trong C5D5N
Hợp chất PQRB1 thu được dưới dạng bột vô định hình, màu trắng. Phổ khối ESI-MS có đỉnh ion tại m/z: 884,6 [M+Na]+, tương ứng với công thức phân tử C46H74O16.
Trên phổ 1H-NMR, 6 tín hiệu methyl singlet tại δH 0,82 (s, H-24); 1,00 (s, H-25); 0,73 (s, H-26); 1,19 (s, H-27); 0,93 (s, H-29); 0,97 (s, H-30)
Hình 3.3. Tín hiệu CH3 trên phổ DEPT
Kết hợp với 2 tín hiệu carbon olefin tại δC 123,8 (C-12) và 144,9 (C-13) và 1 tín hiệu nhóm carboxylic tại δC 178,2 (C -28) trên phổ 13C-NMR gợi ý phần aglycon của PQRB1 là bộ khung triterpenoid nhóm hederagenin.
ppm
Hình 3.4. Phổ 13C-NMR: Tín hiệu olefin và cacboxylic
Ngoài ra còn sự xuất hiện của 3 tín hiệu proton anomeric δH 1,55; 5,24;5,02 ppm; tương đương với 3 carbon anomer δC 104,6; 101,6; 104,2 cho
thấy cấu trúc của PQRB1 có 3 đơn vị đường. Đường này được nhận định là arabisone, 1 đơn vị đường rhamnose, 1 đơn vị đường ribose.
ppm
Hình 3.5. Phổ 1H-NMR: 3 protons anomer hợp chất PQRB1
Vị trí g ắn giữa các đường với nhau và với bộ khung olean được suy luận từ các tương quan HMBC. Tương quan H-1(Ara)/C-3, H-1(Rha I)/C- 2(Ara) và H-1(Rib)/C-3(Rha I) cho phép khẳng định vị trí liên kết phần aglycon với phần đường tại vị trí C-3 trên khung olean, 2 cầu nối đường còn lại tại vị trí C-2(Ara) và C-3(Rha I). Kết hợp tài liệu tham khảo[12], PQRB1
được xác định là 3-O–β–D–ribopyranosyl (1→3)–α-L–rhamnopyranosyl (1→2)-α–L-arabinopyranosyl hederagenin.
Hình 3.6. Công thức cấu tạo hợp chất PQRB1
3.2. Phân tích định tính hợp chất bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
Lựa chọn điều kiện sắc ký dựa trên các tài liệu tham khao và SKLM như sau: Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 Infinity
Cột sắc ký: Agilent Eclipse XD B-C18 (kích thước cột 4,6 x 250mm, cỡ hạt 5µ)
Detector UV phát bước sóng 208nm.
Pha động: Aceton nitrin-Acid acetic 0,2%/Nước (4:1, v/v) Tốc độ dòng: 0,8ml/phút
Thể tích mẫu bơm: 20µl
Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ phòng
Pha mẫu thử: 28mg cao dược liệu phần dưới mặt đất cây Phong quỳ Sa Pa hòa tan trong 1000µl methanol, siêu âm 10phút cho cao hòa tan hoàn toàn, lọc mẫu qua màng 0,45 micromet.
Tương tự làm với hợp chất PQRB1: hòa tan 2mg hợp chất PQRB1 trong 1000µl methanol, siêu âm 10 phút, lọc qua màng 0,45 micromet.
Kết quả:
Hợp chất PQRB1 có thời gian lưu tR=23,284
Diện tích pic của PQRB1 rất bé trong sắc ký đồ HPLC của cao n- Butanol, hàm lượng của chất tách được tương đối nhỏ trong phần rễ cây Phong quỳ Sa Pa.
Hình 3.7. Sắc ký đồ HPLC của hợp chất PQRB1
Hình 3.8. Sắc ký đồ HPLC của cao phân đoạn n-butanol phần dưới mặt đất
cây Phong quỳ Sa Pa
3.3. Bàn luận
Quá trình phân lập hợp chất sử dụng phương pháp sắc ký: sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, sắc ký l ỏng hiệu năng cao. Phương pháp sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng là phương pháp được sử dụng phổ biến do giá thành rẻ, nguyên vật liệu dễ kiếm, có thể khai triển với một lượng mẫu tương đối lớn.
Dựa trên thực nghiệm, bước đầu đã xây dựng được kiều kiện sắc ký HPLC đối v ới hợp chất saponin đã phân lập từ phần dưới mặt đất cây Phong quỳ Sa Pa.
Đề tài đã phân lập được hợp chất từ phân đoạn n-butanol của cây Phong quỳ Sa Pa, dựa theo đặc điểm hóa lý, phương pháp phổ bao gồm phổ khối (MS), phổ cộng hưởng hạt nhân (NMR) và so sánh các tài liệu tham khảo đã xác định được hợp chất PQRB1.
KẾT LUẬN
Qua quá trình thực hiện, đề tài đã đạt được mục tiêu đề ra và thu được một số kết quả sau:
Đã phân lập được hợp chất PQRB1 là 3-O–β–D–ribopyranosyl(1→3)– α-L–rhamnopyranosyl(1→2)-α–L-arabinopyranosyl hederagenin từ phần dưới mặt đất cây Phong quỳ Sa Pa bằng phương pháp sắc ký gồm: sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.
Xác định được cấu trúc của hợp chất dựa trên cơ sở dữ liệu phổ MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC và các tài liệu tham khảo. Hợp chất 3-O–β–D–ribopyranosyl(1→3)–α-L–rhamnopyranosyl(1→2)-α–L- arabinopyranosyl hederagenin lần đầu tiên phân lập được từ loài Anemone
chapaensis Gagnep, bổ sung, hoàn thiên thêm về các hợp chất từ chi
Anemone.
KIẾN NGHỊ
Do thời gian nghiên cứu còn hạn hẹp, khóa luận chỉ đóng góp một phần nhỏ về phân lập hợp chấ t loài Phong quỳ Sa Pa (Anemone chapaensis Gagnep.) cũng như chi Anemone. Cây phong quỳ Sa Pa hứa hẹn mang lại nhiều tiêm năng trong điều trị bênh, em xin đưa ra một số kiến nghị sau:
- Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học các phân đoạn khác phần dưới mặt đất cây Phong quỳ Sa Pa.
- Nghiên cứu tác dụng sinh học các chất có trong cây.
- Định tính và dấu vân tay sắc ký cho các hợp chất hóa học có trong phân dưới mặt đất cũng như phân trên mặt đất cây Phong Quỳ Sa Pa.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Việt Nam
1. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất bản trẻ, 320. 2. Võ Văn Chi (2003), Từ điển thực vật thông dụng, NXB Khoa học Kỹ thuật
3. Gagnepain F. (1929), "Deux Anémones nouvelles d'Indo-Chine",
Bulletin de la Société Botanique de France. 76(2), tr. 315-316.
4. Gong WZ. (2011), "Chemical constituents and bioactivity of
Anemone cathayensis", Beijing: Minzu University of China.
5. Guan , Ying-Yu, et al. (2015), "Raddeanin A, a triterpenoid saponin isolated from Anemone raddeana, suppresses the angiogenesis and
growth of human colorectal tumor by inhibiting VEGFR2 signaling.",
Phytomedicine. 22.1, tr. 910-913.
6. Hao , Da-Cheng, Xiaojie Gu, and Peigen Xiao. (2017), "Anemone medicinal plants: ethnopharmacology, phytochemistry and biology", Acta
Pharmaceutica Sinica B.
7. Harvard University Herbaria (2008), Flora of North America,
Anemone Genus.
8. Ji C , Cheng G, Tang H, Zhang Y, Hu Y, Zheng M, et al. (2015), "Saponin 6 of Anemone taipaiensis inhibits proliferation and induces apoptosis of U87 MG cells", Chinese Journal of Cellular and Molecular
Immunology 31(484-486).
9. Liao X , Li BG, Wang MK, Ding LS, Pan YJ, Chen YZ. (2001), "The chemical constituents from Anemone rivularis", Chem J Chin Univ. 22, tr. 1338-1341.
10. Liu , Qing, et al. (2015), "Crude triterpenoid saponins from
Anemone flaccida (Di Wu) exert anti-arthritic effects on type II
collagen-induced arthritis in rats", Chinese medicine 10.1, tr. 20. 11. Lu Jincai. et al (2009), "Structure elucidation of two trierpenoid saponins from Anemone raddeana Regel", Fitoterapia. 80, tr. 345-348. 12. Mizutani K. , Ohtani K., Wei J.-X., Kasai R., Tanaka O.
13. Ren , F.Z., Zhang, X.X., Niu, G.Y., Zhang, l., Shan, B.E., and Liu, G.C. (2005), "The research on antitumor constituents of Anemone
raddeana Regel", Zhong Cao Yao. 36, tr. 1775-1778.
14. Ren FZ , Chen SH, Zheng ZH, Zhang XX, Li LH, Dong AH. (2012), "Coumarins of Anemone raddeana Regel and their biological