Bài viết được thực hiện dựa trên những kết quả thực nghiệm đối với một số loài cá kích thước nhỏ, trình bày quy trình nhuộm và những điều cần lưu ý trong quá trình tiến hành nhằm đạt được những mẫu vật vừa có tính thẩm mỹ vừa đạt được tính khoa học.
Vietnam Journal of Marine Science and Technology; Vol 19, No 4A; 2019: 115–122 DOI: https://doi.org/10.15625/1859-3097/19/4A/14594 https://www.vjs.ac.vn/index.php/jmst Some methods to stain cartilage and bone of vertebrates and application on small fish in museum of oceanography Nguyen Thi My Ngan*, Bui Quang Nghi, Nguyen Kha Phu, Hoang Xuan Ben Institute of Oceanography, VAST, Vietnam * E-mail: myngan.ion@gmail.com Received: 30 July 2019; Accepted: October 2019 ©2019 Vietnam Academy of Science and Technology (VAST) Abstract In a natural scientific museum as Museum of Oceanography, a specimen should be not only awesome but also scientific in order to attract visitors and introduce knowledge to them One of the methods satisfying those requirements is “Method of staining cartilages and bones for small vertebrates” This method was applied to handle small fish: Anchovies (Encrasicholina devisi (Whitley, 1940)), amphiprions (Amphiprion ocellaris (Cuvier 1830)) and ponyfish (Leiognathus sp.), which is highly efficient, not only used in studying fish bones and cartilages but also attractive to visitors This paper also gives details on experiences during handling process of this method Keywords: Staining of cartilage and bone, Amphiprion ocellaris, vertebrates Citation: Nguyen Thi My Ngan, Bui Quang Nghi, Nguyen Kha Phu, Hoang Xuan Ben, 2019 Some methods to stain cartilage and bone of vertebrates and application on small fish in museum of oceanography Vietnam Journal of Marine Science and Technology, 19(4A), 115–122 115 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Biển, Tập 19, Số 4A; 2019: 115–122 DOI: https://doi.org/10.15625/1859-3097/19/4A/14594 https://www.vjs.ac.vn/index.php/jmst Một số phƣơng pháp nhuộm màu động vật có xƣơng sống kết thực nghiệm số loài cá kích thƣớc nhỏ Nguyễn Thị Mỹ Ngân*, Bùi Quang Nghị, Nguyễn Khả Phú, Hoàng Xuân Bền n d n c, n àn lâm K oa E-mail: myngan.ion@gmail.com * c Côn n t Nam, t Nam Nhận bài: 30-7-2019; Chấp nhận đăng: 6-10-2019 Tóm tắt Đối với bảo tàng khoa học tự nhiên, hình thức trưng bày mẫu vật ngồi tính chất thẩm mỹ thu hút ý, tính khoa học ln lưu tâm nhằm giúp người xem tiếp cận kiến thức khoa học Một phương pháp đáp ứng nhu cầu “Nhuộm màu xương sụn mẫu sinh vật có xương sống” Phương pháp ứng dụng lồi cá có kích thước nhỏ (cá lầm tròn nhẳng Spratelloides gracilis (Temminck & Schlegel, 1846), cá khoang cổ - Amphiprion ocellaris (Cuvier 1830) cá liệt - Leiognathhus sp.) cho hiệu cao, vừa dùng nghiên cứu xương, sụn lồi cá đồng thời đạt tính thẩm mỹ, thu hút người xem Bài báo đề cập đến số kinh nghiệm trình xử lý mẫu theo phương pháp Từ khóa: Nhuộm màu sụn xương, cá khoang cổ Nemo, động vật có sương sống GIỚI THIỆU Đối với bảo tàng khoa học tự nhiên, việc tìm hiểu, ứng dụng làm chủ phương pháp chế tác mẫu mang tính khoa học đồng thời đủ tính thẩm mỹ để thu hút cơng chúng việc làm cần thiết Vì vậy, bảo tàng ln khơng ngừng tìm hiểu phương pháp mới, áp dụng vào việc chế tác mẫu vật nhằm tạo sản phẩm khoa học độc đáo, thỏa mãn nhu cầu ngày cao du khách tham quan Một phương pháp đáp ứng hai yêu cầu chế tác mẫu cách làm nhuộm màu hai lần áp dụng cho động vật có xương sống TỔNG QUAN CÁC PHƢƠNG PHÁP NHUỘM MÀU SỤN VÀ XƢƠNG ĐỘNG VẬT CÓ XƢƠNG SỐNG Mặc dù sử dụng lần thí nghiệm nhuộm xương chất chiết xuất từ thiên thảo từ kỷ 18 [1], phương 116 pháp nhuộm màu xương, sụn làm mô khác biết đến nghiên cứu Taylor (1967) [2] - thực động vật có xương sống kích thước nhỏ Sau đó, phương pháp nhuộm màu làm xương sụn phát triển Dingerkus & Uhler, 1977 [3]; Potthoff (1984) [4]; Kawamura & Hosoya (1991) [5], phương pháp sử dụng phổ biến nghiên cứu động vật có xương sống, góp phần làm sáng tỏ phả hệ loài cá [6], nghiên cứu cấu trúc, hình thành xương sụn giai đoạn phát triển ấu trùng cá [7–11]; áp dụng cho mẫu lưu trữ bảo tàng bào thai động vật có xương sống cỡ nhỏ [12] Phương pháp phát triển nhuộm enzym dây thần kinh (phương pháp nhuộm lần) [13]) nhờ đó, nghiên cứu thực xương, sụn hệ thần kinh cá Một số p Tùy vào nhu cầu mục đích nghiên cứu, phương pháp nhuộm màu làm 2–3 lần áp dụng Đối với mẫu vật bảo tàng, phương pháp nhuộm màu hai lần có lẽ phương pháp thích hợp đáp ứng yêu cầu thẩm mỹ bên cạnh mục đích nghiên cứu Phương pháp tổng hợp Taylor & Dyke (1985) [14], tác giả khảo sát qui trình nhuộm màu làm thời điểm đó, áp dụng nhiều lồi cá kích thước từ 10–175 mm, chí lưỡng cư, thú xương chim Tác giả đề xuất qui trình nhuộm lần gồm 12 bước dành cho ấu trùng cá Căn qui trình này, Potthoff (1984) [4] đưa qui trình bước sau kinh nghiệm từ thực tế xử lý nhiều mẫu cá kích thước từ mm đến 500 mm Qui trình tiếp tục hồn thiện gồm bước Helland (1988) [15] 10 bước Ambruster (1989) [1] Cho đến nay, qui trình sử dụng rộng rãi nhiều nghiên cứu xương ấu trùng cá Dù cải tiến, bổ sung nhiều tác giả chi tiết bước thực hiện, qui trình nhuộm màu làm xương lần giữ nguyên tắc sau: Mẫu cố định nhuộm sụn Alcian blue (C56H68Cl4CuN16S4), sau “làm trong” mô trypsin, tiếp tục nhuộm xương thuốc nhuộm Alizarin red S (C₁₄H7NaO7S), tẩy thuốc nhuộm dung dịch borax trypsin nước cất dùng kali hydroxit 1%, cuối bảo quản mẫu glycerin Qui trình áp dụng mẫu cá, lưỡng cư, động vật có xương sống nhỏ Đối với cá, kích thước mẫu lên đến 500 mm, áp dụng cho mẫu tươi mẫu lưu trữ hàng chục năm trước [14], thích hợp với mẫu lưu trữ bảo tàng Thực tế, qui trình thực mẫu vật cá, bào thai bảo tàng [12, 14] Trong nghiên cứu ấu trùng cá, phương pháp áp dụng phổ biến thể nhược điểm: Mơi trường axit q trình nhuộm sụn lại gây khử khoáng xương bước nhuộm xương Để khắc phục điều này, Walker & Kimmel (2006) [14] phát triển phương pháp dùng clorua magie (MgCl2) thay cho axit, nhờ đó, khơng gây tổn hại đến xương ấu trùng, phương pháp n p áp n uộm màu độn vật có ưu điểm mẫu sau nhuộm dùng nghiên cứu kiểu gen phương pháp PCR Như nêu trên, phương pháp nhuộm màu lần phù hợp với nhu cầu đa dạng hóa mẫu vật trưng bày đồng thời phục vụ mục đích nghiên cứu Bảo tàng Hải dương học Tuy nhiên, để đáp ứng thị hiếu công chúng, mẫu vật cần trọng chọn lựa nhằm đạt tính thẩm mỹ cao sau chế tác Trong đó, phương pháp nhuộm màu hai lần liên quan đến cấu tạo xương sụn động vật, đặc điểm khác biệt nhóm cá, có nhóm cá xương tia vây cứng, thân dẹp cá liệt, cá giị, có nhóm cá trịn, tia vây ngắn cá cơm Ngoài ra, nhóm cá cịn khác diện lớp vẩy bên Tất đặc điểm cấu tạo ảnh hưởng đến chất lượng cảm quan thẩm mỹ mẫu vật Điều chưa đề cập nghiên cứu có, nhu cầu trưng bày khơng trọng thí nghiệm khoa học trước Bài báo thực dựa kết thực nghiệm số lồi cá kích thước nhỏ, trình bày quy trình nhuộm điều cần lưu ý trình tiến hành nhằm đạt mẫu vật vừa có tính thẩm mỹ vừa đạt tính khoa học VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Mẫu vật Ngày 7/6/2018, tiến hành thu mẫu: Cá lầm tròn nhẳng - Spratelloides gracilis (Temminck & Schlegel, 1846), cá khoang cổ - Amphiprion ocellaris (Cuvier 1830), cá liệt Leiognathhus sp.,… Cá chọn làm mẫu tươi cịn sống, chiều dài tồn thân khơng q cm: Cá liệt: Đại diện cho nhóm cá khơng có vẩy, thân mỏng dẹp, tia vây cứng, tạo hình đẹp; số lượng mẫu, chiều dài từ 5,5– 6,5 cm Cá lầm trịn nhẳng: Đại diện cho nhóm cá thân tròn, dài, vẩy mỏng, tia vây nhỏ; số lượng mẫu, chiều dài từ 6–6,7 cm Cá khoang cổ Nemo: Đại diện cho nhóm cá nhiều vẩy; số lượng mẫu, chiều dài từ 4– 4,4 cm 117 N uyễn T ị Mỹ N ân nnk Hóa chất Formalin (H2CO), cồn ethanol (C2H5OH), a xít acetic (CH3COOH), thuốc nhuộm sụn Alcial Blue 8X, thuốc nhuộm xương Alizarin Red S, sodium borate, oxy già (H2O2), kali hidroxit (KOH), nước cất, men trypsin Dụng cụ Lọ thủy tinh 25 đến 500 ml, cốc đong 50 ml 500 ml, bình thủy tinh pha hóa chất, đũa khuấy, ống nghiệm lọ thủy tinh đựng mẫu, giấy nhôm, lọ thủy tinh đựng mẫu Nhuộm màu mẫu vật Tiến hành xử lý mẫu theo qui trình bước Helland (1988) [15]: B1 Làm chết cá: Đối với cá khoang cổ, cho vào nước formol, tăng dần nồng độ cá chết hồn tồn, định hình mẫu, căng vây B2 Cố định mẫu Formalin 4% có dung dịch đệm Phosphat: Tỉ lệ formalin/cá: 10/1; Thời gian cố định mẫu: ngày B3 Nhuộm sụn: Vớt mẫu từ dung dịch cố định, rửa kỹ nước ngọt, ngâm vào dung dịch ethanol 50% ngày, tiếp tục ngâm ethanol 95% ngày, sau tiến hành nhuộm sụn thuốc nhuộm Alcian blue 8X Dung dịch nhuộm gồm 35 ml Ethanol 95% +15 mil axit axetic +10 mg Alcian Blue 8X Nhuộm sụn 22 h B4 Trung hòa mẫu nhuộm Sodium borate bão hòa ngày B5 Tẩy trắng 15 ml 3% oxy già 85 ml 1% kali hydroxit Thời gian tẩy h B6 Làm dung dịch pha theo tỉ lệ 35 ml Sodium borax bão hòa + 65 ml nước cất + bột trypsin Sau ngày, mẫu đạt độ khoảng 70% B7 Nhuộm xương Alizarin Red S pha Kali hydroxit 1% theo tỉ lệ 100 ml kali hydroxit mg Alizarin Red S Thời gian nhuộm vòng ngày B8 Tẩy chất nhuộm dung dịch pha theo tỉ lệ 35 ml sodium borax bão hòa +65 ml nước cất Thời gian tẩy: ngày B9 Bảo quản dung dịch glycerin kali hydroxit theo tỉ lệ 30% glycerin + 70% kali hydroxit 1% 10 ngày, tiếp tục với dung dịch theo tỉ lệ 60% glycerin + 40% kali hydroxit 1% 10 ngày, cuối giữ mẫu lâu dài 100% glycerin Đánh giá hiệu việc ứng dụng phƣơng pháp nhuộm màu làm Đánh giá hiệu việc ứng dụng kỹ thuật nhuộm màu làm sinh vật việc chế tác mẫu cách phát phiếu khảo sát ý kiến nhận xét mẫu thực KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM TRÊN MỘT SỐ LOÀI CÁ KÍCH THƢỚC NHỎ Nhuộm màu mẫu vật Kết trình nhuộm màu làm mẫu vật theo qui trình Helland (1988) [6] cho sản phẩm với bước cụ thể sau: B n Các bước thực phương pháp nhuộm màu làm mẫu vật Nội dung Cá liệt Cá lầm tròn nhẳng Cá khoang cổ Mẫu cá Cá tươi Cá tươi Cá còntừ sống, làm chết cá formol từ từ formol Cá sống, làm chết cá từ Xử lý mẫu ban đầu Hình Mẫu cá liệt cố định, thước Hình Mẫu cá lầm trịn nhẳng cố Hình Mẫu cá khoang cổ Hình 1: Mẫu1 cá cm 3: Mẫu cá 11khoang Hình 2:định, Mẫuthước cá lầm cố cố định, thƣớc cm định, thước cm cm liệt cố định, thƣớc cmtrịn nhẳngHình cổ cố định, thước cm Cá cố định hồn tồn, vây xòe ra, căng cứng 118 Một số p n p áp n uộm màu độn vật Nhuộm sụn Hình Mẫu cá liệt nhuộm sụn Hình Mẫu cá lầm trịn nhẳng Hình Mẫu cá khoang cổ nhuộm sụn nhuộm sụn Bắt màu xanh thấy rõ vùng viền mắt đầu vây Trung hòa tẩy trắng Hình Các mẫu trung hòa tẩy trắng Trước sau tẩy trắng, màu xanh mẫu cá thay đổi không đáng kể, phần trong, thấy xương sống cá liệt Làm Sau ngày, phần trong, riêng ruột cá giữ màu đục Sau ngày, cá hoàn toàn kể phần ruột Nhuộm xương Sau ngày ngâm dung dịch nhuộm, cá bắt màu hồng đậm tia vây, xương sống, tồn thân cá suốt Tẩy chất nhuộm Không tẩy Sau ngày, cá Xương, tia vây vẩy bắt màu tím hồng, mắt cá vàng, cá chưa Giữ dung dịch kali hydroxit ngày trước tiến hành bảo quản Dung dịch 1: B o qu n bằn kali hydroxit 1% lycer n t eo tỉ l 70/30 Bảo quản Cá trong, xương cá bắt màu tím hồng rõ nét, tất mẫu có bọt khí bụng, màu xanh sụn cịn lại ít, cịn lại viền mảnh quanh mắt Cá suốt, xương vá tia vây có màu tím hồng, màu xanh sụn viền mắt, gốc vây hậu mơn, gốc vây ngực Cá chưa hồn tồn, khơng màu xanh sụn, Xương, tia vây vẩy màu hồng nhạt Dung dịch 2: B o qu n bằn kali hydroxit 1% lycer n t eo tỉ l 60/40 Cá suốt, xương hồng tím, màu xanh sụn thấy viền mắt gốc mang Hình Mẫu cá liệt xử lý xong Hình Mẫu cá lầm trịn nhẳng xử lý xong Cá tương đối trong, xương vẩy lại màu hồng tím, gốc mang màu xanh Hình 10 Mẫu cá khoang cổ xử lý xong 119 N uyễn T ị Mỹ N ân nnk Dung dịch 3: B o qu n tron lycer n Mẫu vật hoàn thiện Hình 11 Mẫu vật hồn thiện Đánh giá hiệu việc ứng dụng kỹ thuật nhuộm màu xử lý chế tác mẫu Hình 14 Biểu đồ kết khảo sát lý ưa thích mẫu vật Kết khảo sát ý kiến 53 khách tham quan (25 nam 28 nữ) độ tuổi từ 18 đến 58 thể hình 12–14 Hình 12 Biểu đồ kết khảo sát mức độ THẢO LUẬN Hình 12 Biểu đồ kết ưavềthích mẫukhảo vật sát mức độ ưa thích mẫu vật Về qui trình xử lý mẫu vật Đối với mẫu động vật có xương sống, qui trình thực theo Helland (1988) [15] xem hướng dẫn chi tiết nhất, áp dụng cho kích thước mẫu 10–80 mm, 80–200 mm lớn 200 mm Đây dẫn quan trọng liên quan đến thời gian xử lý mẫu với chất tẩy mạnh kali hydroxit oxy già, thời gian xử lý cần thay đổi vài dẫn đến tình trạng mẫu bị phân rã không chưa đủ độ mềm Mặc dù vậy, hướng dẫn qui trình có số nội dung Hình 13 Biểu đồ kết quả khảo sát mức định lượng cách tương đối độ ưa thích mẫu vật 120 Một số p “không tẩy lâu” “ngâm mẫu có đến độ đạt 60%” Đối với người lần áp dụng, khó chắn mẫu đủ độ tẩy trắng độ hay chưa, vậy, qui trình cần thực nhiều lần để rút kinh nghiệm cụ thể cho lần xử lý mẫu sau Sự khác biệt nhóm mẫu trình xử lý Cá thí nghiệm chọn thuộc nhóm có đặc điểm khác biệt như: Cá lầm trịn nhẳng thân trịn, dài, khơng có vẩy; cá liệt thân dẹp, mỏng, da trơn láng; cá khoang cổ thân dẹp, mỏng, có vẩy, viền vây trịn rõ nét Thực tế trình thực khơng có khác biệt lớn nhóm mẫu Ở cá khoang cổ, thời gian xử lý số giai đoạn dài so với mẫu lại như: Mẫu bắt màu chậm nhuộm sụn, trình làm mẫu lâu kết cảm quan cho thấy cá Có thể cấu tạo xương thịt cá khoang cổ cứng, hai nhóm cịn lại nên thời gian đáp ứng với loại hóa chất chậm hơn, điều để kết luận, cần kiểm chứng Tuy nhiên, có điều chắn loại mẫu cần thời gian xử lý khác Vì vậy, dù có qui trình hướng dẫn cụ thể, bước thực cần theo dõi cách thận trọng, đảm bảo chất lượng mẫu qua giai đoạn xử lý Một số lƣu ý xử lý mẫu vật Ở giai đoạn xử lý ban đầu, mẫu có dày, nên lạng bớt bên phần thân trái để hóa chất thấm nhanh trình làm rút ngắn lại, điều đề cập dẫn Helland (1988) [15] kiểm chứng qua trình thực Ở giai đoạn tẩy trắng oxy già kali hydroxit, cần theo dõi sát hóa chất sử dụng có tác dụng tẩy mạnh, để thời gian, làm hỏng mẫu nổ mắt chí rã tồn thân cá Q trình thực tốt sau hồn tất, số mẫu nhỏ đạt đủ độ trong, bỏ qua bước xử lý Ở giai đoạn làm trong, mẫu nhỏ, men trypsin không cần dùng đến, với mẫu lớn, thiết phải bổ sung vào nhằm thúc đẩy trình phân giải chất đạm, làm cho mẫu nhanh n p áp n uộm màu độn vật Đối với mẫu trưng bày, sau hồn tất qui trình, mẫu vật chưa hoàn toàn hẳn mà nhờ hiệu ứng thị giác đặt mẫu glycerin cho hình ảnh suốt mẫu thực, vậy, chất lượng glycerin lọ thủy tinh đóng góp vai trị quan trọng tính thẩm mỹ mẫu Mẫu vật trải qua hai lần nhuộm sụn màu xanh nhuộm xương màu hồng tím thực tế loại cá, màu xanh không đáng kể, nhóm cá xương, phần sụn khơng cịn nhiều thể đủ để tạo ấn tượng màu xanh Từ thực tế trên, tiến hành xử lý mẫu nên cân nhắc có hay khơng thực bước nhuộm sụn nhóm cá xương, bỏ qua giai đoạn giảm thời gian chi phí hóa chất Lời cảm ơn: Tập thể tác giả xin chân thành cảm ơn Viện Hải dương học hỗ trợ kinh phí để thực đề tài này, xin cảm ơn đồng nghiệp có đóng góp ý kiến chân thành trình thực đề tài hoàn thiện báo TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Pramod, K L., and Vaswani, V R., 2011 Museum preservation of skeleton of fetus & small vertebrates Recent Research in Science and Technology, 3(2), 54–58 [2] Armbruster, J W 1989 Clearing and staining method (http://www.aquamedia.org/FileLibrary/27/Diagnostics%20-‐%20Staining.pdf) [3] Dingerkus, G., and Uhler, L D., 1977 Enzyme clearing of alcian blue stained whole small vertebrates for demonstration of cartilage Stain Technology, 52(4), 229–232 [4] Bensimon-Brito, A., Cardeira, J., Dionísio, G., Huysseune, A., Cancela, M L., and Witten, P E., 2016 Revisiting in vivo staining with alizarin red S-a valuable approach to analyse zebrafish skeletal mineralization during development and regeneration BMC Developmental Biology, 16(1), 1–10 121 N uyễn T ị Mỹ N ân nnk [5] Lewis, L M., Lall, S P., and Witten, P E., 2004 Morphological descriptions of the early stages of spine and vertebral development in hatchery-reared larval and juvenile Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus) Aquaculture, 241(1–4), 47–59 doi: 10.1016/j.aquaculture.2004 08.018 [6] Gavaia, P J., Sarasquete, C., and Cancela, M L., 2000 Detection of mineralized structures in early stages of development of marine Teleostei using a modified alcian blue-alizarin red double staining technique for bone and cartilage Biotechnic & Histochemistry, 75(2), 79–84 [7] Taylor, W R., 1967 Outline of a method of claring tissues with pancreatic enzymes and staining bones of small vertebrates Turtox News, 45, 308–309 [8] Potthoff, T., 1984 Clearing and staining techniques In: Moser, H G (Ed.), Ontog-eny and Systematics of Fishes Special Publication-American Society of Ichthyolo-gists and Herpetologists, Vol Allen Press, Lawrence, KS, USA, pp 35–37 [9] Kawamura, K., and Hosoya, K., 1991 A modified double staining technique for making a transparent fish-skeletal specimen Bulletin of National Research Institute of Aquaculture (Japan), 20, 11–18 [10] Fjelldal, P G., Totland, G K., Hansen, T., Kryvi, H., Wang, X., Søndergaard, J L., and Grotmol, S., 2013 Regional changes in vertebra morphology during ontogeny reflect the life history of A tlantic cod (G 122 [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] adus morhua L.) Journal of Anatomy, 222(6), 615–624 Song, J., and Parenti, L R., 1995 Clearing and staining whole fish specimens for simultaneous demonstration of bone, cartilage, and nerves Copeia, 114–118 Rosa-Molinar, E., Proskocil, B J., Ettel, M., and Fritzsch, B., 1999 Whole-mount procedures for simultaneous visualization of nerves, neurons, cartilage and bone Brain Research Protocols, 4(2), 115–123 Taylor, W R., 1985 Revised procedures for staining and clearing small fishes and other vertebrates for bone and cartilage study Cybium, 9, 107–119 Walker, M B., and Kimmel, C B., 2007 A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae Biotechnic & Histochemistry, 82(1), 23–28 Helland, I S., 1988 On the structure of partial least squares regression Communications in statistics -Simulation and Computation, 17(2), 581–607 Johnson, G D., and Anderson Jr, W D., 1993 Proceedings of the Symposium on Phylogeny of Percomorpha, June 15-17, 1990, held in Charleston, South Carolina at the 70th Annual Meeting of the American Society of Ichthyologists and Herpetologists Summer, A., 2013 On the clarity of animals: the art and science of clearing and staining http://www.southernfriedscience.com/on-the-clarity-of-animals-theart-and-science-of-clearing-and-staining Truy cập ngày 12/9/2018 ... mẫu cách làm nhuộm màu hai lần áp dụng cho động vật có xương sống TỔNG QUAN CÁC PHƢƠNG PHÁP NHUỘM MÀU SỤN VÀ XƢƠNG ĐỘNG VẬT CÓ XƢƠNG SỐNG Mặc dù sử dụng lần thí nghiệm nhuộm xương chất chiết xuất... từ kỷ 18 [1], phương 116 pháp nhuộm màu xương, sụn làm mô khác biết đến nghiên cứu Taylor (1967) [2] - thực động vật có xương sống kích thước nhỏ Sau đó, phương pháp nhuộm màu làm xương sụn phát... bào thai động vật có xương sống cỡ nhỏ [12] Phương pháp phát triển nhuộm enzym dây thần kinh (phương pháp nhuộm lần) [13]) nhờ đó, nghiên cứu thực xương, sụn hệ thần kinh cá Một số p Tùy vào nhu