Bài viết trình bày về nguồn gốc của tổn thương DNA và cơ chế sửa chữa DNA của quá trình sinh tinh từ đó làm rõ hơn vai trò của cơ chế sửa chữa DNA trong suốt quá trình sinh tinh.
TỔNG QUAN LÊ VĂN KHÁNH, LƯU THỊ MINH TÂM SỰ SINH TINH: MỐI LIÊN QUAN QUÁ TRÌNH GÂY TỔN THƯƠNG VÀ QUÁ TRÌNH TỰ SỬA CHỮA TỔN THƯƠNG DNA TRONG VÔ SINH NAM Lê Văn Khánh, Lưu Thị Minh Tâm Bệnh viện Đa khoa Mỹ Đức Từ khóa: Apoptosis; DNA damage; DNA repair mechanisms; male infertility; spermatogenesis Keywords: Apoptosis; DNA damage; DNA repair mechanisms; male infertility; spermatogenesis Tóm tắt Sự sinh tinh chuỗi trình phức tạp tăng sinh biệt hóa kéo dài suốt từ tế bào mầm sinh dục nam trải qua trình nguyên phân, giảm phân sau trình trưởng thành để tạo thành tế bào tinh trùng trưởng thành Có nhiều yếu tố vật lý, hóa học, sinh học có nguồn gốc nội sinh ngoại sinh ảnh hưởng đến trình Mặt khác, chế sửa chữa DNA chế góp phần bảo vệ giúp cho gen tinh trùng có ổn định tồn vẹn Trải qua suốt trình sinh tinh, thời điểm khác tế bào dịng tinh, có nhiều chế sửa chữa DNA xảy sửa chữa cắt bỏ nucleotide, sửa chữa cắt bỏ base, sửa chữa bắt cặp khơng tương thích, sửa chữa đứt gãy DNA mạch đôi sửa chữa sau chép Nội dung tổng quan sau xin trình bày nguồn gốc tổn thương DNA chế sửa chữa DNA q trình sinh tinh từ làm rõ vai trò chế sửa chữa DNA suốt q trình sinh tinh Từ khóa: apoptosis; DNA damage; DNA repair mechanisms; male infertility; spermatogenesis Tập 14, số 04 Tháng 02-2017 Abstract 06 Tác giả liên hệ (Corresponding author): Lê Văn Khánh, email: drlevankhanh@gmail.com Ngày nhận (received): 19/9/2016 Ngày phản biện đánh giá báo (revised): 23/10/2016 Ngày báo chấp nhận đăng (accepted): 30/12/2016 Spermatogenesis is a complex process of proliferation and differentiation during male germ cell development involving mitosis, meiosis and spermiogenesis Endogenous and exogenous physical, chemical and biological sources modify the genome of spermatozoa The genomic integrity and stability of the sperm is protected by DNA repair mechanisms In the male germline cells, DNA repair mechanisms include nucleotide excision repair, base excision repair, DNA mismatch repair, double strand break repair and post-replication repair In this review article, the process of spermatogenesis, origin of DNA damage and DNA repair Đại cương sửa chửa tổn thương sửa chữa cắt bỏ nucleotide (nucleotide excision repair - NER), sửa chữa cắt bỏ base (base excision repair - BER), sửa chữa bắt cặp khơng tương thích (DNA mismatch repair - MMR), sửa chữa đứt gãy DNA mạch đôi (double strand break repair) sửa chữa sau chép Nội dung tổng quan sau xin trình bày khái quát chế gây tổn thương chế giúp chỉnh sửa tổn thương DNA trình sinh tinh Nguồn gốc tổn thương DNA vô sinh nam Tổn thương DNA tinh trùng phân loại dựa vào vị trí nhận diện tổn thương AP (abasic site), biến đổi base, đứt gãy DNA mạch đơn hay mạch đơi cầu nối chéo protein Có giả thuyết nguyên nhân gây tổn thương DNA tinh trùng gốc oxi hóa tự (ROS), q trình đóng gói sợi nhiễm sắc hay trình chết tế bào Gốc oxy hóa tự (ROS) Các gốc có chứa nguyên tử oxy hydrogen peroxide (H2O2), gốc hydroxyl (OH.), nitric oxide (NO), hypochlorous (HOCl) Nguồn gốc gốc nội sinh ngoại sinh Các tác nhân ngoại sinh ví dụ phóng xạ, thuốc lá, ô nhiễm không khí, …Tác nhân nội sinh đến từ hoạt động hô hấp ti thể, từ hệ thống enzyme xanthine oxidase NADPH oxidase (4) Sự diện nồng độ cao gốc tự làm giảm khả di động tinh trùng, ảnh hưởng khả thụ tinh gây tổn thương DNA (11) 20 – 88% người đàn ông giảm khả sinh sản có diện nồng độ ROS cao tinh dịch Tập 14, số 04 Tháng 02-2017 Sự sinh tinh chuỗi trình phức tạp với mục đích tạo tinh trùng trưởng thành có khả thụ tinh với nỗn Chuỗi q trình diễn lịng ống sinh tinh tinh hòa mào tinh (1, 2, 3) Sự toàn vẹn DNA tinh trùng giúp tạo tinh trùng trưởng thành, di động bình thường (4, 5, 6, 7) Quá trình sinh tinh trùng người kéo dài khoảng 70±4 ngày, gồm giai đoạn giai đoạn tinh nguyên bào, giai đoạn tinh bào giai đoạn tinh tử (8) Ở giai đoạn tinh nguyên bào, tinh nguyên bào nằm phần biểu mô ống sinh tinh nguyên phân liên tục để gia tăng số lượng tế bào Tiếp theo đến giai đoạn tinh bào, tinh nguyên bào vào trình giảm phân để tạo thành tinh bào bậc I sau tinh bào bậc II Trong q trình này, có hai q trình quan trọng diễn giảm số lượng NST tái tổ hợp chất liệu di truyền chromatid nhằm làm tăng đa dạng đặc tính di truyền Cuối giai đoạn tinh tử giai đoạn hậu phân bào giai đoạn biệt hóa Ở giai đoạn này, tinh tử trải quá trình quan trọng hình thành thể cực đầu số biến đổi quan trọng màng bào tương, ty thể, nhân tế bào Kết thúc trình biệt hóa, tinh trùng hình thành với hình dạng, cấu trúc đặc thù mức độ biệt hóa cao nhằm đảm bảo thực chức giao tử đực người (9) Gốc oxi hóa tự (Reactive oxygen species ROS), q trình đóng gói sợi nhiễm sắc bất thường chết có chương trình tế bào nguyên nhân gây tổn thương DNA tinh trùng (10) Bên cạnh đó, dịng tế bào mầm nam giới có chế giúp TẠP CHÍ PHỤ SẢN - 14(04), 06 - 10, 2017 mechanisms are examined closely to gain a better understanding of the role of DNA repair mechanisms during spermatogenesis Key words: apoptosis; DNA damage; DNA repair mechanisms; male infertility; spermatogenesis 07 Tập 14, số 04 Tháng 02-2017 TỔNG QUAN LÊ VĂN KHÁNH, LƯU THỊ MINH TÂM 08 Đóng gói sợi nhiễm sắc Ở DNA tinh trùng người 90-95% protein histone thay protamine, loại protein nhỏ giàu arginine Sự protamine hóa sợi nhiễm sắc giúp cho việc nén chặt vật chất di truyền cần thiết cho di động giúp bảo vệ gen khỏi q trình oxi hóa hay phân tử gây hại đến hệ thống sinh sản nam giới (12) Sự thay protamine diễn suốt q trình sinh tinh Sự acetyl hóa q mức đuôi histone làm nới lỏng cấu trúc sợi nhiễm sắc dễ làm cho DNA bị đứt gãy enzyme topoisomerase giúp cho histone tách thay protein chuyển tiếp (10) DNA topoisomerase gắn cộng hóa trị vào DNA phosphate làm đứt liên kết phosphodieste mạch mạch đơn hay mạch đôi DNA cầu nối phosphodieste hình thành lại cách ngẫu nhiên Một số tác nhân ức chế nối thường đứt gãy ngẫu nhiên sửa chữa Sự chết theo chương trình tế bào Trong suốt trình sinh tinh, chết theo chương trình tế bào (Apoptosis) giúp giới hạn kích thước quần thể tế bào mầm giúp trì tỉ lệ ổn định tế bào mầm tế bào Sertoli (13) Thỉnh thoảng số tế bào mặc định vào trình chết thoát khỏi trở lại tinh dịch xuất tinh Các đường apoptosis Con đường bên tế bào: Các tác nhân oxi hóa gây cân oxi hóa tinh trùng khởi đường chết bên tế bào ti thể nắm vai trị Protein BH3 hoạt hóa Bax Bak protein tiền trình chết tế bào, ức chế Bcl-2 Bcl-X1 Sự hoạt hóa protein tiền chết tế bào dimer hóa chèn vào màng ti thể gây rò rỉ cytochrome C Khi cytochrome C lọt ngồi kích hoạt caspase-9, kết hình thành thác caspase phân cắt nhân (14) Con đường bên tế bào: Liên quan đến hoạt hóa thụ thể Fas gắn với Fas-ligand (FasL) biểu tế bào lympho T FasL gắn vào dẫn đến trimer hóa thụ thể Fas điều chiêu mộ caspase-8 Chu trình chết tế bào kích thích cách song song: phân cắt hoạt hóa capase-3 phân cắt họ protein Bcl-2 liên quan đường ti thể đề cập Có liên quan chất lượng tinh trùng thụ thể Fas, mẫu tinh trùng khỏe mạnh có 10% thụ thể Fas có 50% mẫu tinh trùng OAT (15) Cơ chế sửa chữa DNA Sửa chữa cách cắt bỏ nucleotide Cơ chế sửa chữa cách cắt bỏ nucleotide (NER) hoạt động có tổn thương pyrimidine dimer (chủ yếu base T C nối cộng hóa trị với nhau) bị gây tác nhân tia UV, bắt cặp base sai hay nối chéo bên mạch DNA (16) Đứt gãy DNA kiểm tra phát 30 protein khác chế NER Cơ chế gồm đường phụ GG-NER (global genome NER) TC-NER (transcription coupled NER) Mỗi đường nhận diện sai hỏng khác nhau: GGNER chịu trách nhiệm cho tổn thương DNA TCNER phát tổn thương mạch mã hóa gen phiên mã tích cực Ở đường GG-NER, tổn thương DNA phát protein XPC RAD23B Con đường TC-NER hoạt hóa biến dạng DNA dẫn đến khóa kéo dài phức hợp RNA polymerase II (17) DNA tháo xoắn cho phép gắn protein XPA giúp chép đoạn DNA chứa protein A thành sợi thứ cấp cho việc nhận diện tổn thương Các enzyme phân cắt nucleotide mạch cắt DNA vị trí sai hỏng Cuối vị trí bị cắt lấp đầy, nối lại DNA polymerase DNA ligase Cơ chế NER tìm thấy bệnh tự miễn xeroderma pigmentosum, hội chứng Cockaye bệnh Trichothiodystrophy Những bệnh phân loại dựa dấu hiệu mẫn cảm ánh sáng mặt trời, có nguy cao mắc ung thư da, bất thường thần kinh phát triển giới tính khơng hồn thiện người lớn Những tác nhân nội bào ngoại bào gây loạt sai hỏng DNA suốt trình sinh tinh chế sửa chữa DNA đường NER thật cần thiết Sửa chữa cách cắt bỏ base Tập 14, số 04 Tháng 02-2017 MSH4 MSH5 đóng vai trị quan trọng trình tái tổ hợp giảm phân Có dạng heterodimers đồng đẳng MutS: Dạng MutSa (MSH2/MSH6); Dạng MutSb (MSH2/ MSH3) Sự liên kết MutL với phức hợp MutSDNA hoạt hóa MutH-tác nhân tạo khoảng trống mạch giúp chiêu mộ DNA helicaseII gây đứt liên kết với mạch đôi DNA Bốn protein quan trọng MMR gồm MLH1, MLH2, MSH4 RAD51 liên quan đến vô sinh nam Gen MLH3 mã hóa cho protein sửa chữa DNA tương tác với MLH1 MLH1 MLH3 cần thiết cho trình tái tổ hợp phân chia nơi bắt chéo nhiễm sắc thể tương đồng giai đoạn sợi dày (pachytene) sợi kép (diplotene) Sự vắng mặt thiếu hụt gene có liên quan đến thất bại trình sinh giao tử giảm phân ngừng lại giai đoạn sợi dày làm giảm số lượng vị trí bắt chéo (19) Một thí nghiệm Mukherjee cộng (2010) làm đoạn gene MLH1 dẫn đến ổn định gen gây vô sinh chuột đực Một nghiên cứu khác kiểu hình gene MLH1 PMS2 liên quan đến vơ sinh nam giới đứt gãy DNA tinh trùng (20) Sửa chữa đứt gãy DNA mạch đơi Có nhiều nhân tố gây đứt gãy DNA mạch đôi bao gồm ROS, thất bại trình chép sửa chữa DNA, trình tái tổ hợp, giảm phân hay tác nhân hóa học tác nhân phóng xạ ion hóa Đứt gãy mạch đơi DNA khơng thể sửa chữa dẫn đến q trình chuyển vị, dung hợp DNA chết tế bào Tái tổ hợp tương đồng chế kết nối đầu có tính chất không tương đồng (Non-homologous end-joining – NHEJ) sửa chữa đứt gãy DNA mạch đôi Tái tổ hợp tương đồng Cơ chế sửa sai thông qua tái tổ hợp tương đồng chế giải phóng sai sót có tác dụng chủ yếu suốt giai đoạn pha S kì pha G2 Trong trình này, đứt gãy DNA mạch đơi bảo vệ khỏi hoạt động phân cắt enzyme exonuclease cách gắn vào mạch phức hợp protein Rad51 đồng đẳng protein RecA E Coli Đột biến Ataxia telangiectasia (ATM) phức hợp MRE11-RAD50-NBS1 hoạt hóa đứt gãy mạch đôi DNA tạo đầu 3’-DNA TẠP CHÍ PHỤ SẢN - 14(04), 06 - 10, 2017 Con đường nhận diện phân loại có tổn thương base 8-hydroxy 2’oxoguanine (8OHdG) bắt cặp với adenine cysteine suốt trình chép DNA dẫn đến đột biến chuyển hoán G:C thành T:A sau dịch mã Enzyme DNA glycosylases phát biến đổi base phân cắt cầu nối N-glycosidic base hư hỏng để tạo thành gốc đường deoxyribose Việc phân cắt dẫn đến base khung đường-phosphate DNA vị trí nhận diện apurinic hay apyrimidinic (AP site) vị trí phân cắt apurinic/ apyrimidinic endonuclease (AP endonuclease) Kết hình thành khoảng trống mạch sau nối lại DNA ligase III DNA ligase I tùy theo đoạn cắt chứa base sai hỏng ngắn hay dài (18) 8-hydroxy 2’oxoguanine (8OHdG) base sinh q trình cân oxi hóa DNA tinh trùng 8-oxoguanine glycosylase (OOG1) cắt 8OHdG tạo vị trí AP tinh trùng Sau đó, AP endonuclease chọn khung sườn phosphate DNA để chèn vào nucleotide không bị biến đổi tế bào sinh dưỡng tế bào nỗn Ở tinh trùng khơng có enzyme apyrimidinic endonuclease 1, vị trí AP tạo DNA OOG1 sửa chữa pha S lần nguyên phân hợp tử (13) Sửa chữa bắt cặp khơng tương thích Bắt cặp khơng tương thích bao gồm G-T A-C Sửa chữa bắt cặp khơng tương thích (MRM) giúp tăng xác q trình chép DNA lên khoảng 100 lần ngăn chặn không ổn định gen Ở động vật có vú, MMR liên quan đến chế chép DNA giúp dễ dàng phân biệt mạch nhanh đoạn Okazaki có điểm kết thúc 5’ tự mạch chậm thông qua việc gắn kháng nguyên proliferating cell nuclear (PCNA) (vai trò giàn giáo để gắn protein liên quan đến chép DNA, sửa chữa DNA) MutS có đồng đẳng MSH1-6 MutL có đồng đẳng MLH1-MLH3, PMS1 PMS2 hình thành nên dạng heterodimers (19) cho thấy bất ổn định gen phát MLH1 hay MSH2 bệnh nhân vô tinh không bế tắc 09 TỔNG QUAN LÊ VĂN KHÁNH, LƯU THỊ MINH TÂM mạch đơn cách cắt bỏ đoạn cuối DNA bị đứt gãy thông qua tương tác với protein gắn có tận gốc carboxyl Đuôi DNA mạch đơn bao protein A để tránh phá vỡ cấu trúc thứ cấp, tái tạo protein A thay trình tự tương đồng RAD51 nhiễm sắc thể chị em RAD51C tương tác với BRCA2 hình thành phức hợp đơi tương đồng Nghiên cứu biến đổi tái tổ hợp tương đồng có liên quan đến vơ sinh Đàn ơng mắc phải Ataxia telangiectasia có tượng vô tinh (azoospermia) teo tuyến sinh dục thất bại trình hình thành tinh bào giai đoạn sợi mảnh (leptotene) đến sợi kết hợp (zygotene) Đột biến vùng MRE11 khóa giai đoạn tái tổ hợp giảm phân Kết nối đầu cuối có tính chất khơng tương đồng Cấu trúc dị dimer Ku70 Ku80 nhận diện, gắn vào đứt gãy mạch đôi DNA chiêu mộ protein kinase Khi Ku70 Ku80 gắn vào chiêu mộ phức hợp MRE11 Phức hợp MRE11 gây loại bỏ điểm cuối khơng có khả nối DNA chế chuyển vị bên thông qua chép DNA polymerase trình nối để tạo thành điểm kết thúc phù hợp Tập 14, số 04 Tháng 02-2017 Tài liệu tham khảo 10 Chocu, S., Calvel, P., Rolland, A.D., Pineau, C Spermato- genesis in mammals: proteomic insights Syst Biol Reprod Med 2012; 58, 179–190 Nussbaum, R., McInnes, R.R., Willard, H.F., Hamosh, A Thomp- son & Thompson Genetics in Medicine, seventh ed Saunders; 2007 Xiao, X., Mruk, D.D., Cheng, C.Y Intercellular adhesion mol- ecules (ICAMs) and spermatogenesis Hum Reprod Update; 2013; 19, 167– 186 Ménézo, Y., Dale, B., Cohen, M DNA damage and repair in human oocytes and embryos: a review Zygote; 2010; 18, 357–365 de Rooij, D.G., Russell, L.D All you wanted to know about spermatogonia but were afraid to ask J Androl 2000; 21, 776–798 Mahmoud, H Concise review: spermatogenesis in an artifi- cial threedimensional system Stem Cells; 2012; 30, 2355–2360 Simhadri, S., Peterson, S., Patel, D., Huo, Y., Cai, H., Bowman- Colin, C., Miller, S., Ludwig, T., Ganesan, S., Bhaumik, M., Bunting, S., Jasin, M., Xia, B Male fertility defect associated with disrupted BRCA1-PALB2 interaction in mice J Biol Chem 2014; 289, 24617– 24629 Mortimer, D Sperm physiology In: Mortimer D, ed Practical labotary andrology Oxford University Press; 1994; 13 – 39 Lê Hồng Thụy Khả, Hồ Mạnh Tường, Sự sinh tinh Trong: Hồ Mạnh Tường – Đặng Quang Vinh – Vương Thị Ngọc Lan chủ biên Thụ tinh ống nghiệm, Nhà xuất giáo dục Việt Nam; 2011; 41-48 10 Gunes, S., Al-Sadaan, M., Agarwal, A Spermatogenesis, DNA damage and DNA repair mechanisms in male infertility RBM online; 2015; 31, 309 – 319 11 Sharma, R., Masaki, J., Agarwal, A.Sperm DNA fragmentation Kết luận Sinh tinh trùng trình phức tạp bao gồm nguyên phân, giảm phân, biệt hóa trưởng thành nhằm tạo tế bào tinh trùng đảm bảo chức di truyền Trong q trình đó, nhiều ngun nhân từ môi trường nguyên nhân mặt di truyền gây nên bất thường từ gây vô sinh nam Với thành tựu lãnh vực di truyền, ngày có nhiều nguyên nhân, chế gây nên bất thường trình sinh tinh trùng làm rõ Ngoại trừ việc phải có chế để chống chọi với tác động từ mơi trường bên ngồi, tế bào sinh tinh đồng thời phải có chế để phục hồi tổn thương DNA để trì khả sinh sản Tuy nhiều điểm chưa làm sáng tỏ mối liên quan bất thường trình tự sửa chữa tổn thương DNA tinh trùng vô sinh nam chứng minh Do đó, cần nhiều nghiên cứu để chứng minh, làm rõ hữu ích gene, protein đặc biệt trình tự sửa chữa DNA nhằm phát triển kỹ thuật hỗ trợ cho trình analysis using the TUNEL assay Methods Mol Biol 2013; 927, 121– 136 12 Torregrosa, N., Dominguez-Fandos, D., Camejo, M.I., Shirley, C.R., Meistrich, M.L., Ballesca, J.L., Oliva, R Protamine precursors, protamine 1/protamine ratio, DNA integrity and other sperm parameters in infertile patients Hum Reprod 2006; 21, 2084-2089 13 Aitken, R.J., Baker, M.A Oxidative stress, spermatozoa and leukocytic infiltration: relationships forged by the opposing forces of microbial invasion and the search for perfection J Reprod Immunol 2013; 100, 11–19 14 Kumar, V., Abbas, A.K., Aster, J.C Robbins Basic Pathology, ninth ed Saunders; 2012 15 Sakkas, D., Mariethoz, E., St John, J.C Abnormal sperm parameters in humans are indicative of an abortive apoptotic mechanism linked to the Fas-mediated pathway Exp Cell Res 1999b; 251, 350–355 16 Lyama, T., Wilson, D.M., 3rd DNA repair mechanisms in dividing and non-dividing cells DNA Repair (Amst); 2013; 12, 620–636 17 Fousteri, M., Mullenders, L.H., Transcription-coupled nucleotide excision repair in mammalian cells: molecular mechanisms and biological effects Cell Res 2008; 18, 73–84 18 Said, T.M., Paasch, U., Glander, H.J., Agarwal, A Role of caspases in male infertility Hum Reprod Update; 2004; 10, 39–51 19 Gordon, F.K.E., Lamb, D.J DNA repair genes and genomic instability in severe male factor infertility In: Carrell, D.T (Ed.), The Genetics of Male Infertility Humana Press 2006 20 Mukherjee, S., Ridgeway, A.D., Lamb, D.J DNA mismatch repair and infertility Curr Opin Urol 2010; 20, 525–532 ... MMR), sửa chữa đứt gãy DNA mạch đôi (double strand break repair) sửa chữa sau chép Nội dung tổng quan sau xin trình bày khái quát chế gây tổn thương chế giúp chỉnh sửa tổn thương DNA trình sinh. .. tỏ mối liên quan bất thường trình tự sửa chữa tổn thương DNA tinh trùng vơ sinh nam chứng minh Do đó, cần nhiều nghiên cứu để chứng minh, làm rõ hữu ích gene, protein đặc biệt trình tự sửa chữa. .. gen gây vô sinh chuột đực Một nghiên cứu khác kiểu hình gene MLH1 PMS2 liên quan đến vô sinh nam giới đứt gãy DNA tinh trùng (20) Sửa chữa đứt gãy DNA mạch đơi Có nhiều nhân tố gây đứt gãy DNA