Công trình này nghiên cứu hình thái, giải phẫu lá, khả năng kháng khuẩn và gây độc tế bào ung thư của loài Tầm gửi năm nhị ký sinh trên cây Mít (Artocarpus heterophyllus Lamk.), Xoài (Mangifera indica L.), Dâu tằm (Morus alba L.), Sao đen (Hopea odorata Roxb.) và Tràm Liễu (Callistemon citrinus Skeels.) trồng ở thành phố Hồ Chí Minh (TP HCM) qua điều chế cao nước và cao khô. Mời các bạn cùng tham khảo để biết thêm nội dung chi tiết.
Năm học 2010 – 2011 NGHIÊN CỨU HÌNH THÁI GIẢI PHẪU LÁ, KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG UNG THƯ CỦA LOÀI TẦM GỬI NĂM NHỊ (DENDROPHTHOE PENTANDRA (L.) MIQ.) KÝ SINH TRÊN MỘT SỐ CÂY TRỒNG Ở THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Phạm Xuân Bằng (SV năm 4, Khoa Sinh học) GVHD: TS Phạm Văn Ngọt ThS Nguyễn Hoàng Hạt Mở đầu Loài Tầm gửi năm nhị (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) (TGNN) gọi Mộc ký ngũ hùng thuộc họ Tầm gửi (Loranthaceae) ký sinh nhiều loài trồng hoang dại Trong dân gian người ta thường dùng TGNN phối hợp với chè nấu nước uống trị ho Ở Ấn Độ người ta dùng giã đắp trị chỗ đau loét Khả kháng khuẩn loài bước đầu cho thấy cao ethyl acetate điều chế từ TGNN ký sinh Xồi (Mangifera indica) có hoạt tính kháng khuẩn đối vớí Staphylococcus aureus ATCC 29213, Staphylococcus aureus đề kháng methycilin (MRSA) ATCC 43300 Bacillus subtilis PY 79 nồng độ 1024 µg/ml Cơng trình nghiên cứu hình thái, giải phẫu lá, khả kháng khuẩn gây độc tế bào ung thư loài TGNN ký sinh Mít (Artocarpus heterophyllus Lamk.), Xồi (Mangifera indica L.), Dâu tằm (Morus alba L.), Sao đen (Hopea odorata Roxb.) Tràm Liễu (Callistemon citrinus Skeels.) trồng thành phố Hồ Chí Minh (TP HCM) qua điều chế cao nước cao khô Phương pháp nghiên cứu 2.1 Phương pháp thu mẫu Mẫu TGNN thu hái từ lồi Mít, Xồi, Dâu tằm, Sao đen, Tràm liễu vào tháng 10 đến 11-2010 trồng quận Thủ Đức TP HCM Mẫu TGNN bảo quản với giấy báo ẩm, sau cho vào túi nilon đem phịng thí nghiệm Ứng với lồi chủ, thu hái 30 cành TGNN ký sinh 10 chủ 2.2 Phương pháp nghiên cứu hình thái, giải phẫu Chọn 30 bánh tẻ TGNN (từ 30 cành) cho lồi chủ để mơ tả dạng lá, kích thước màu sắc Sau giải phẫu lá, cắt thành lát mỏng dao lam, nhuộm kép với phẩm nhuộm dung dịch carmin - phèn chua xanh methylen để khảo sát vi phẫu phịng thí nghiệm Thực vật Trường Đại học Sư phạm TP HCM A B Hình Vị trí đo kích thước (A) cắt giải phẫu (B) 11 Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH 2.3 Phương pháp điều chế mẫu thử hoạt tính Rửa mẫu TGNN, tách lấy cành; cành cắt thành đoạn - cm, đem thái nhỏ làm Tạo 15 mẫu TGNN ứng với lồi chủ Mẫu TGNN tươi sấy khơ tủ sấy nhiệt độ 80oC Lấy 100g mẫu khơ (50g cành khơ 50g khơ) hịa với 500ml nước cất đem đun ấm điện cịn khoảng 50ml (khoảng 70 phút) Sau chế nước sắc vào cốc đong Để thử hoạt tính kháng khuẩn dùng ln mẫu thử dạng cao nước: pha 50ml nước sắc TGNN vào 50 ml nước cất vô trùng Để thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư tiếp tục đặt cốc đong chứa cao nước vào nồi đun cách thủy mẫu thử cô cạn thành cao khô Ghi ký hiệu mẫu thử sau: Bảng Ký hiệu mẫu cao Tầm gửi năm nhị Tầm gửi năm nhị Cao nước Cao khơ Ký sinh Mít TMcw TMcd Ký sinh Dâu tằm TDcw TDcd Ký sinh Sao đen TScw TScd Ký sinh Tràm liễu TTLcw TTLcd Ký sinh Xoài TXcw TXcd 2.4 Thử hoạt tính kháng khuẩn cao khơ Chuẩn bị môi trường tăng sinh BHI (Brain Heart Infusion Broth), môi trường làm kháng sinh đồ MHA (Mueller Hinton Agar) mua công ty Nam Khoa chủng Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus Klebsiella pneumoniae; môi trường làm kháng sinh đồ MPA (Malt-Peptone-Agar) chế tạo phòng thí nghiệm Vi sinh - Sinh hóa trường Đại học Sư phạm TP HCM chủng Bacillus subtilis, Escherichia coli Các chủng vi khuẩn thử nghiệm bao gồm Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli , Klebsiella pneumoniae Xác định hoạt tính kháng khuẩn mẫu thử TMcw TXcw, TDcw, TScw, TTLcw, phương pháp đục lỗ thạch Đánh giá độ mạnh hoạt tính: vào đường kính vịng kháng khuẩn sau trừ 0.9cm đường kính vịng đục lỗ nhỏ cao thử 2.5 Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư cao thơ Mẫu thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư TMcd TXcd, TDcd, TScd, TTLcd Phịng thí nghiệm Sinh học phân tử – Bộ môn Di truyền – Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên thực theo phương pháp thử nghiệm SRB (Sulforhodamine B) 12 Năm học 2010 – 2011 Các mẫu thử hòa tan DMSO, pha lỗng đến nồng độ 1.000µg/ml mơi trường ni cấy lọc vơ khuẩn màng lọc 0,22 µm Dòng tế bào tiến hành thử nghiệm dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa Mẫu thử đối chứng Camptothecine 0,01 µg/ml - chất hóa học có khả gây độc tế bào ung thư nồng độ thấp 2.6 Phương pháp xử lí số liệu Dùng toán thống kê phần mềm Excel 2010 Statgraphics Centurion XVI để xử lý số liệu thu Kết nghiên cứu 3.1 Hình thái - TGNN ký sinh Mít có kiểu lá: + Kiểu 1: phiến hình bầu dục, chiều dài gấp chiều rộng 1,5 – lần, đầu đáy tù (phụ lục hình 1A) + Kiểu 2: phiến hình trứng, chiều dài gấp chiều rộng 1,5 – lần, đầu tù, đáy trịn (phụ lục hình 1B) - TGNN ký sinh Dâu tằm có kiểu lá: + Kiểu 1: phiến hình bầu dục, chiều dài gấp chiều rộng 1,5 – lần, đầu nhọn, đáy tù (phụ lục hình 2A) + Kiều 2: phiến trịn, có chiều rộng gần chiều dài, đầu đáy trịn (hình phụ lục hình 2B) + Kiểu 3: phiến hình trứng, chiều dài gấp chiều rộng 1,5 – lần, đầu tù, đáy trịn (phụ lục hình 2C) Thường gặp kiểu hình bầu dục kiểu hình trứng Lá TGNN ký sinh Dâu tằm có màu lục đậm - TGNN ký sinh Xoài có kiểu lá: + Kiểu 1: phiến hình bầu dục có chiều dài gấp chiều rộng 1,5 – lần, đầu nhọn đáy tù (phụ lục hình 3A) + Kiểu 2: phiến hình trứng có chiều dài gấp chiều rộng 1,5 – lần, đầu tù, gốc lõm bên (phụ lục hình 3B) Ở lồi TGNN ký sinh Xồi có chủ yếu kiểu (lá bầu dục) Về màu sắc hai kiểu có màu lục lợt - TGNN ký sinh Sao đen có kiểu lá: + Kiểu 1: phiến hình bầu dục có chiều dài gấp chiều rộng 1,5 – lần, đầu nhọn đáy tù (phụ lục hình 4A) + Kiểu 2: phiến hình mũi mác có chiều dài gấp chiều rộng 1,5 – lần, đầu nhọn đáy tù, mép có thùy nhỏ, hình mũi mác(hình 4B) + Kiểu 3: phiến hình tim có chiều dài gấp chiều rộng 1,5 – lần, đầu tù lõm lại hình tim đáy tù (phụ lục hình 4C) Về màu sắc lá: có màu lục đậm - TGNN ký sinh Tràm liễu có kiểu lá: 13 Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH + Kiểu 1: phiến hình bầu dục có chiều dài gấp chiều rộng 1,5 – lần, đầu nhọn đáy tù (phụ lục hình 5A) + Kiểu 2: phiến hình trứng có chiều dài gấp chiều rộng 1,5 – lần, đầu tù, gốc lõm bên (phụ lục hình 5B) Ở lồi TGNN có chủ yếu kiểu (lá bầu dục) Về màu sắc hai kiểu có màu lục lợt Nhận xét: Lồi TGNN ký sinh lồi chủ có nhiều dạng khác nhau, kiểu hình bầu dục thường gặp Lá TGNN ký sinh chủ Mít, Dâu tằm Sao đen có màu lục đậm; cịn ký sinh Xồi Tràm liễu có màu lục lợt 3.2 Kích thước Kích thước TGNN (kiểu bầu dục) trình bày bảng Qua số liệu bảng Cho thấy TGNN ký sinh loài chủ khác nhau, điều kiện khí hậu giống nhau, có sai khác có ý nghĩa kích thước Lá TGNN ký sinh Xồi có kích thước lớn nhất, cịn TGNN ký sinh chủ Dâu tằm nhỏ Bảng Các số kích thước TGNN ký sinh chủ Chỉ số Chiều dài trung Chiều rộng Chiều dài cuống Cây chủ bình (cm) trung bình (cm) trung bình (cm) Mít 11,80 ± 1,24 5,48 ± 0,68 0,68 ± 0,11 Dâu tằm 11,18 ± 1,36 7,00 ± 1,05 0,57 ± 0,11 Xoài 14,70 ± 1,85 5,84 ± 0,33 1,02 ± 0,04 Sao đen 12,35 ± 2,00 5,24 ± 0,97 0,94 ± 0,15 Tràm liễu 11,77 ± 1,22 4,96 ± 0,75 0,84 ± 0,16 3.3 Giải phẫu TGNN Cấu tạo TGNN ký sinh loài chủ thể hình 7, 8, 9, 10 11 Biểu bì với cuticul Biểu bì với cuticul Hạ bì Hạ bì Lục mơ Mơ dầy Bó dẫn gân Hình Cấu tạo giải phẫu TGNN ký sinh Mít (x 100) 14 Năm học 2010 – 2011 Hình Cấu tạo giải phẫu TGNN ký sinh Dâu tằm (x 100) Hình Cấu tạo giải phẫu TGNN ký sinh Xồi (x 100) Hình Cấu tạo giải phẫu TGNN ký sinh Sao đen (x 100) Hình Cấu tạo giải phẫu TGNN ký sinh Tràm liễu (x 100) Độ dày lớp mơ TGNN trình bày bảng Bảng Độ dày (µm) lớp mơ TGNN ký sinh loài chủ Cấu tạo Độ dày mô TGNN ký sinh chủ 15 Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH Loại mô tầng cuticul Tầng cutiul Số lớp tế bào Biểu bì - Hạ bì 2-3 Lục mơ 5-6 Hạ bì 2-3 Biểu bì Tầng cutiul - Độ dầy Mít Dâu tằm Xồi 4,27 ± 0,32 11,77 ± 0,72 34,21 ± 2,45 394,20 ± 22,59 35,42 ± 2,06 11,55 ± 0,89 3,78 ± 0,33 495,16 ± 23,20 4,70 ± 0,26 13,60 ± 1,12 38,17 ± 3,05 533,30 ± 25,73 33,77 ± 8,18 13,02 ± 0,94 4,20 ± 0,29 640,80 ± 28,35 4,40 ± 0,28 14,20 ± 1,99 34,63 ± 3,88 383,80 ± 31,90 32,30 ± 2,92 12,74 ±1,44 3,83 ± 0,51 485,78 ± 39,01 Sao đen 4,40 ± 0,35 15,97 ± 1,84 35,64 ± 2,78 422,92 ± 13,71 12,14 ± 1,51 29,30 ± 4,06 3,78 ± 0,37 524,14 ± 15,50 Tràm liễu 2,90 ± 0,36 12,70 ± 1,04 33,10 ± 2,91 340,50 ± 11,04 33,22 ± 3,05 12,69 ± 1,10 2,30 ± 0,28 437,37 ± 12,50 Nhận xét: - Về đại thể TGNN ký sinh loài chủ khác có cấu tạo giống nhau, có sai khác độ dầy mơ - Lá TGNN có tầng cuticul mặt mặt dầy, 3,78 µm Lá TGNN ký sinh Tràm liễu có tầng cuticul mỏng - Có - lớp hạ bì - lớp hạ bì Sự có mặt tầng cuticul dầy hạ bì chứng tỏ lồi TGNN lồi ưa sáng - Lục mơ khơng phân hóa, có độ dày lớn so với mô khác Sự sai khác độ dày độ dày lục mô Lá TGNN ký sinh Dâu tằm có độ dày lớn nhất, cịn TGNN ký sinh Tràm liễu có độ dày mỏng 3.4 Hoạt tính kháng khuẩn Các cao thử TMcw, TXcw, TScw, TTLcw, cho hoạt tính kháng khuẩn chủng vi khuẩn thử nghiệm Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus Cao thử TDcw khơng có khả chủng vi khuẩn Tất cao thử TMcw, TXcw, TScw, TTLcw, TDcw khơng có hoạt tính kháng Escherichia coli, Klebsiella pneumonia Hoạt tính kháng chủng vi khuẩn cao thử thể qua bảng Bảng Kết hoạt tính kháng khuẩn cao thử (n = 3) Đường kính vịng kháng (cm) Tên cao Bacillus Escherich Staphylococ Pseudomona Klebsiella subtilis ia coli cus aureus s aeruginosa pneumonia TMcw 0.8 ± 0,76 1,4 ± 0,064 1,2 ± 0,076 TXcw 0.8 ± 0,03 1,8 ± 0,076 0,8 ± 0,05 16 Năm học 2010 – 2011 TDcw TScw TTLcw 0.35 ± 0,05 0.8 ± 0,058 0,5 ± 0,06 - 0,5 ± 0,086 1,9 ± 0,058 1,3 ± 0,08 TMcw 1,1 ± 0,104 1,1 ±0,1 - TXcw TDcw TScw TTLcw Hình Kết hoạt tính kháng Bacillus subtilis cao thử (26/12/2010 ) (Toàn mẫu thử cho hoạt tính kháng B subillis Hoạt tính mẫu thử mức yếu) TXcw TMcw TDcw TScw TTLcw Hình Kết hoạt tính kháng Staphylococcus aureus cao thử (26/12/2011) 17 Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH (Toàn mẫu thử cho hoạt tính kháng Staphylococus aureus Hoạt tính kháng khuẩn cao thử mức trung bình) TXcw TMcw TDcw TScw TTLcw Hình Kết hoạt tính kháng Pseudomonas aeruginosa cao thử (25/01/2011) (Cao TDcw hoạt tính kháng Pseudomomas aeruginosa Tồn cao thử cịn lại cho hoạt tính kháng Pseudomomas aeruginosa Hoạt tính kháng khuẩn cao thử mức yếu) 3.5 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư Hoạt tính gây độc tế bào ung thư cao thử TMcd, TDcd, TScd TTLcd, TXcd thể qua bảng sau: Bảng Kết thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư Tỷ lệ % gây độc tế bào Mẫu Lần Lần Lần Trung bình 91,57 92,12 93,29 92,33 ± 0,880 TMcd 94,41 94,09 94,49 94,33 ± 0,208 TDcd 94,21 95,75 94,94 94,97 ± 0,772 TScd 11,08 13,99 14,34 13,14 ± 1,791 TTLcd 80,89 83,11 83,92 82,64 ± 1,564 TXcd Camptothecine 63,94 58,92 61,43 61,43 ± 2,506 0.01 µg/ml Sau 48 cảm ứng nồng độ 1000µg/ml, tất mẫu thử nghiệm có khả gây độc tế bào ung thư cổ tử cung HeLa cao, trừ mẫu TTLcd 18 Năm học 2010 – 2011 TMcd TDcd TXcd TScd TTLcd Camptothecine 0.01ppm Hình 10 Kết hoạt tính gây độc tế bào ung thư sau 48 cảm ứng cao thử (10/03/2011 ) Kết luận kiến nghị 4.1 Kết luận - Lá TGNN có nhiều dạng, dạng thường gặp có hình bầu dục Lá TGNN ký sinh Xồi có kích thước lớn nhất, TGNN ký sinh Dâu tằm có kích thước nhỏ - Lá TGNN ký sinh lồi chủ khác có cấu tạo giống nhau, chúng có sai khác độ dầy lục mô Lá TGNN ký sinh Dâu tằm có độ dày lớn TGNN ký sinh Tràm liễu có độ dày nhỏ - Cao nước li trích từ lồi TGNN ký sinh Mít, Xồi, Sao đen, Tràm liễu có hoạt tính kháng chủng vi khuẩn Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus - Cao khơ li trích từ lồi TGNN ký sinh Mít, Xồi, Sao đen, Dâu tằm có hoạt tính gây độc dịng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa nồng độ 1.000µg/ml 4.2 Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn chủng vi khuẩn khác, xác định nồng độ ức chế tối thiểu mẫu thử hoạt tính - Tiếp tục nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào ung thư cao thử dòng tê bào ung thư khác dòng tế bào ung thư phổi, dòng tế bào ung thư vú… 19 Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH TÀI LIỆU THAM KHẢO Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, Nxb Y học, tr.762 Phạm Hoàng Hộ (2003 ), Cây cỏ Việt Nam – II, Nxb Trẻ, tr.134 Trần Cơng Khánh (1981), Thực tập Hình thái giải phẫu thực vật, Nxb Đại học Trung học chuyên nghiệp Hà Nội, tr.22, 28, 32 -3 4 Phạm Văn Ngọt, Nguyễn Hoàng Hạt, Quách Văn Toàn Em, Hoàng Văn Tới (2010), Nghiên cứu khả kháng khuẩn loài Mộc ký ngũ hùng (Dendrophthoe pentadra (L.) Miq.) thuộc họ Tầm gửi (Loranthaceae), Tạp chí khoa học, Trường Đại học Sư Phạm Tp Hồ Chí Minh, tr 67-71 Trần Thanh Thủy (1999), Hướng dẫn thực hành Vi sinh vật học, Nxb Giáo dục, tr 168 – 170 PHỤ LỤC B A Hình Các kiểu TGNN ký sinh Mít A B C Hình Các kiểu TGNN ký sinh Dâu tằm 20 Năm học 2010 – 2011 A B Hình Các kiểu TGNN ký sinh Xồi A B C Hình Các kiểu TGNN ký sinh Sao đen A B Hình Các kiểu TGNN ký sinh Tràm liễu 21 ... 14 Năm học 2010 – 2011 Hình Cấu tạo giải phẫu TGNN ký sinh Dâu tằm (x 100) Hình Cấu tạo giải phẫu TGNN ký sinh Xoài (x 100) Hình Cấu tạo giải phẫu TGNN ký sinh Sao đen (x 100) Hình Cấu tạo giải. .. chứa cao nước vào nồi đun cách thủy mẫu thử cô cạn thành cao khô Ghi ký hiệu mẫu thử sau: Bảng Ký hiệu mẫu cao Tầm gửi năm nhị Tầm gửi năm nhị Cao nước Cao khô Ký sinh Mít TMcw TMcd Ký sinh Dâu tằm... Văn Tới (2010), Nghiên cứu khả kháng khuẩn loài Mộc ký ngũ hùng (Dendrophthoe pentadra (L.) Miq.) thuộc họ Tầm gửi (Loranthaceae), Tạp chí khoa học, Trường Đại học Sư Phạm Tp Hồ Chí Minh, tr