Một số đặc điểm sinh học của virus dịch tả lợn nhược độc chủng C được thích nghi trên tế bào PK15 tại Công ty HanVet

Bài viết tiến hành nghiên cứu nhằm xác định các đặc tính sinh học của virus DTL nhược độc chủng C được thích nghi trên tế bào PK15 tại công ty Hanvet. Mời các bạn cùng tham khảo!

KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VIRUS DỊCH TẢ LN NHƯC ĐỘC CHỦNG C ĐƯC THÍCH NGHI TRÊN TẾ BÀO PK15 TẠI CÔNG TY HANVET Trần Văn Khánh, Nguyễn Thanh Ba, Nguyễn Thu Trang, Nguyễn Văn Tâm, Nguyễn Văn Phúc, Nguyễn Thị Bích, Nguyễn Hữu Vũ Cơng ty Cổ phần Dược Vật tư thú y (Hanvet) TÓM TẮT Virus nhược độc dịch tả lợn, chủng C thích nghi tế bào PK15 cơng ty Hanvet Sau thích nghi, virus kiểm tra đặc tính sinh học giống Kết kiểm tra cho thấy chủng virus đạt tiêu chuẩn nhận dạng, khiết Đường cong sinh trưởng virus tế bào ổn định, hiệu giá virus cao đạt 106,5 TCID50/ml 72 sau gây nhiễm Chủng virus thích nghi tế bào giữ đặc tính gây sốt thỏ, liều gây nhiễm tối thiểu thỏ 10-5/ml Virus an toàn tiêm cho lợn với liều 106,5 TCID50/lợn Gây miễn dịch cho lợn chủng virus dịch tả lợn thích nghi tế bào với liều miễn dịch 101, 102, 103 104 TCID50, lợn có đáp ứng miễn dịch tốt bảo vệ hoàn toàn thử thách với 103 MLD50 virus dịch tả lợn cường độc Từ khóa: virus nhược độc, dịch tả lợn, đặc tính sinh học, đáp ứng miễn dịch Characteristics of attenuated classical swine fever virus - C strain adapted on PK15 cell line at Hanvet company Tran Van Khanh, Nguyen Thanh Ba, Nguyen Thu Trang, Nguyen Van Tam, Nguyen Van Phuc, Nguyen Thi Bich, Nguyen Huu Vu Classical swine fever virus, C strain was adapted on PK15 cell line at Hanvet Company The biological characteristics of cell-adapted virus showed that its identity and purity met the required standards The growth kinetic of virus was very stable, the highest viral titer was 106.5 TCID50/ml at 72h post-infection The cell-adapted virus retained the ability to induce fever in the experimental rabbits; the minimum infective dose in the experimental rabbits was 10-5/ml The pigs were safe when inoculation with dose of 106.5 TCID50/pig The inoculated pigs with 101; 102; 103 and 104 TCID50 of cell-adapted virus induced good immune response and they were completely protected when challenging with 103 MLD50 virulent CSFV Keywords: attenuated virus, classical swine fever, biological characteristics, immune response I ĐẶT VẤN ĐỀ - Chất lượng thỏ dùng cho sản xuất khó kiểm soát Vacxin dịch tả lợn (DTL) vacxin quan trọng việc phòng bệnh cho đàn lợn Vacxin phòng bệnh DTL cho lợn sản xuất hai phương thức sản xuất vacxin từ hạch lách thỏ sản xuất vacxin tế bào - Có thể gây phản ứng mẫn Tại Hanvet, chúng tơi có quy trình sản xuất vacxin DTL qua thỏ sản phẩm phân phối thị trường Tuy nhiên, việc sản xuất vacxin DTL thỏ gặp nhiều khó khăn do: - Vacxin có chứa nhiều protein ngoại lai - Dễ tạp nhiễm vi sinh vật có nguồn gốc từ thỏ - Khó mở rộng quy mô sản xuất - Hàm lượng virus không cao Vacxin sản xuất tế bào công nghệ với nhiều ưu điểm như: - Vacxin đảm bảo độ tinh khiết - Các nguyên liệu đầu vào q trình sản xuất dễ kiểm sốt - Q trình sản xuất cần diện tích mặt sản xuất vacxin thỏ 15 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 - Giảm tiêu tốn nhân lực trình sản xuất 2.1 Đối tượng nghiên cứu - Dễ dàng nâng cao quy mô sản xuất Đối tượng nghiên cứu Virus DTL nhược độc qua thỏ chủng C thích nghi tế bào PK15, hiệu giá virus đạt 106.5 TCID50/ml - Hiệu sản xuất cao, giá thành hạ - Chất lượng vacxin kiểm soát dễ dàng Vì vậy, việc chuyển sang nghiên cứu sản xuất vacxin tế bào điều tất yếu Từ thực tiễn, chúng tơi tiến hành thích nghi virus DTL nhược độc chủng C nhiều loại tế bào khác nhau: tế bào PK15, tế bào tinh hoàn lợn (ST cell line) tế bào tinh hoàn bê (BT cell line) để tạo chủng virus dùng cho sản xuất vacxin tế bào Kết tạo chủng virus DTL thích nghi tế bào PK15 2.2 Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành theo nội dung sau: Nhận dạng virus thông qua xác định có mặt gen E2 Kiểm tra khiết Tính cảm nhiễm chủng virus thỏ Tính cảm nhiễm virus tế bào Tính an tồn virus lợn Tính sinh miễn dịch virus lợn Nghiên cứu nhằm xác định đặc tính sinh học virus DTL nhược độc chủng C thích nghi tế bào PK15 công ty Hanvet 2.3 Vật liệu phương pháp nghiên cứu II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Cặp mồi nhận dạng gen E2 virus DTL sử dụng nghiên cứu (Yan Li & cs, 2007): 2.3.1 Vật liệu nghiên cứu Tên mồi Trình tự mồi CFSVF AACATGGATGGTGTAACTGGT CFSVR TTCTCTATAGTGTTGGTCATTCC Lợn khỏe mạnh tháng tuổi, có huyết âm tính với kháng thể DTL sử dụng nghiên cứu Thỏ mẫn cảm khỏe mạnh, khối lượng 1,8 – 2,2kg, có thân nhiệt bình thường ngày liên tiếp, lợn lai hướng nạc hai tháng tuổi, chưa tiêm phịng vacxin DTL có huyết âm tính với virus DTL xét nghiệm ELISA sử dụng nghiên cứu Sản phẩm (bp) 343 Kỹ thuật RT-PCR sử dụng để nhận dạng virus DTL theo hướng dẫn Yan Li & cs (2007) Kiểm tra khiết tiến hành theo TCVN 8684:2011 Tính mẫn cảm thỏ virus DTL đánh giá thông qua phản ứng thân nhiệt thỏ tiêm virus DTL theo hướng dẫn TCVN 8685-8:2011 Tế bào dòng PK15 (ATCC-CCL33) nuôi cấy giữ giống Công ty Hanvet loại mơi trường hóa chất cho ni cấy tế bào MEM, PBS(-)… sử dụng nghiên cứu Kỹ thuật Fluorescent Antibody Test (FAT) sử dụng để xác định hiệu giá virus DTL tế bào, thực theo hướng dẫn OIE Terrestrial Manual 2014, chapter 2.8.3 Virus DTL cường độc phân lập thực địa giữ giống cơng ty Hanvet có liều MLD đạt 105/ml Kỹ thuật ELISA với kit hãng IDEXX kỹ thuật trung hòa virus NPLA (Neutralising Peroxidase Linked Assay) theo hướng dẫn TCVN 5273:2010 áp dụng 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 16 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 Số liệu xử lý theo phương pháp thống kê sinh học, sử dụng phần mềm Minitab16 M 2.3.3 Bố trí thí nghiệm Để xác định tính cảm nhiễm virus thỏ, hỗn dịch virus DTL pha loãng theo số 10, dịch virus độ pha loãng 10-2 - 10-6 tiêm cho thỏ, độ pha loãng tiêm cho thỏ, 1ml/con theo đường tĩnh mạch tai Sau tiêm 24 giờ, tiến hành đo thân nhiệt thỏ lần đến 120 27 chai T-flask 75cm2 tế bào PK15 lớp gây nhiễm virus với liều gây nhiễm MOI = 0,01 Sau gây nhiễm virus, thời điểm 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108 giờ, thu chai tế bào nhiễh theo TCVN 8685-8:2011 “+” thỏ sốt nhẹ theo TCVN 8685-8:2011 “+/-” thỏ nghi ngờ theo TCVN 8685-8:2011 “-” thỏ không sốt Kết thu cho thấy virus DTL chủng C sau thích nghi tế bào PK15 có tính cảm nhiễm tốt gây nhiễm thỏ, khả gây nhiễm thỏ virus DTL chủng C thích nghi tế bào đạt 105 RID/ml (Rabbit Infected Dose) Kết nghiên cứu tương đồng với kết nghiên cứu tác giả Chris Morrissy, Trần Xuân Hạnh & cs (2010) nghiên cứu phát triển vacxin dịch tả heo mới, cấy chuyển virus DTL chủng C tế bào PK15A 12 lần; Chao Tong & cs (2017) tiếp truyền liên tục virus DTL chủng C tế bào PK15 40 lần; Ferrari (1992) nghiên cứu thích nghi virus DTL chủng C tế bào MPK sau 20 đời cấy chuyển, virus DTL chủng C giữ độc lực thỏ thích nghi tế bào Tuy nhiên, dòng tế bào sử dụng nghiên cứu có khác Thực tế, kết nghiên cứu khác với kết Nguyễn Tiến Dũng cs (2005) nghiên cứu thích nghi virus DTL chủng C tế bào CPK, sau 73 đời cấy chuyển, độc lực thỏ virus khơng cịn ổn định virus gốc 3.4 Tính cảm nhiễm virus tế bào Để xác định đường cong sinh trưởng virus DTL nhược độc, tiến hành thí nghiệm mơ tả mục 2.3.3 Kết thu sau: Hình Đường cong sinh trưởng virus DTL nhược độc 18 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 Qua đồ thị sinh trưởng, phát triển giống virus DTL nhược độc cho thấy: Sau gây nhiễm 24 giờ, virus bắt đầu trình nhân lên, hàm lượng virus tăng dần theo thời gian nhiễm đạt cao 106.57 TCID50/ml thời điểm 72 sau gây nhiễm Sau thời điểm 84 giờ, hiệu giá virus giảm nhanh chóng Đến thời điểm 108 sau gây nhiễm, hiệu giá virus 10 4.73 TCID50/ml nghiên cứu Chao Tong & cs, hiệu giá virus đạt cao thời điểm 96 sau gây nhiễm tác giả không theo dõi tiếp giai đoạn sau Sự khác biệt liều nhân nhiễm virus (MOI) hai nghiên cứu có khác Chao Tong & cs sử dụng liều nhân nhiễm MOI = 0.001, nghiên cứu sử dụng MOI = 0.01 Có khác biệt động thái sinh trưởng virus DTL tế bào nghiên cứu với nghiên cứu Chao Tong & cs Trong Tính an tồn virus DTL nhược độc đánh gia thơng qua thí nghiệm mơ tả mục 2.3.3 Kết chúng tơi thu sau: 3.5 Tính an toàn virus lợn Bảng Biểu lâm sàng lợn sau tiêm virus DTL nhược độc Chỉ tiêu theo dõi Số lợn có phản ứng liều tiêm Đối chứng 105TCID50 106TCID50 106,5TCID50 Phản ứng mẫn, sốc phản vệ 0/5 0/5 0/5 0/5 Phản ứng vị trí tiêm 0/5 0/5 0/5 0/5 Giảm ăn, bỏ ăn 0/5 0/5 0/5 0/5 Ủ rũ, mệt mỏi 0/5 0/5 0/5 0/5 Tiêu chảy 0/5 0/5 0/5 0/5 Các phản ứng khác 0/5 0/5 0/5 0/5 Như vậy, không phát phản ứng bất lợi xảy thể lợn tất lợn thử nghiệm Cùng với theo dõi lâm sàng, tiến hành theo dõi thân nhiệt lợn thí nghiệm lần/ngày vào sáng chiều, kết thu thể qua hình Hình Thân nhiệt lợn tiêm virus DTL nhược độc với liều khác 19 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 Qua đồ thị thân nhiệt lợn thí nghiệm cho thấy, tất lợn thử nghiệm có thân nhiệt bình thường, dao động khoảng 39,2 – 39,60C, khơng có tượng sốt suốt q trình theo dõi Nói cách khác, virus DTL nhược độc không gây sốt cho lợn tiêm Để đánh giá tồn diện tính an tồn virus DTL nhược độc, tiến hành theo dõi tăng trọng lợn q trình thí nghiệm để so sánh với lợn đối chứng Kết thể qua bảng Bảng Tăng trọng lợn tiêm virus DTL nhược độc liều khác Khối lượng lợn (kg) Nhóm TN Ngày Ngày 14 Tỷ lệ tăng trọng (%) 105 TCID50 21,9 ± 0,2 28,72 ± 0,11 31,14 106 TCID50 23,71 ± 0,19 30,37 ± 0,25 28,10 10 22,87 ± 0,12 30,23 ± 0,17 32,18 22,69 ± 0,18 29,87 ± 0,15 31,64 6,5 TCID50 Đối chứng (không tiêm) Từ bảng số liệu theo dõi tăng trọng lợn, sử dụng thuật toán thống kê phân tích phương sai nhân tố cho thấy, khơng có khác biệt có ý nghĩa khả tăng trọng nhóm lợn thí nghiệm Từ kết kiểm tra an toàn giống virus DTL nhược độc cho thấy virus DTL nhược độc an toàn cho lợn tiêm với liều 106.5 TCID50 Kết hồn tồn dễ hiểu chủng virus dùng để thích nghi tế bào virus DTL chủng C, chủng virus an toàn, chứng minh qua nửa kỷ (Qui Hua – Ji & cs, 2006) 3.6 Tính sinh miễn dịch virus lợn 3.6.1 Đáp ứng miễn dịch dịch thể Biến động kháng thể huyết lợn xác định ELISA Sau miễn dịch cho lợn theo bố trí mơ tả mục 2.3.3, tiến hành lấy máu, chắt huyết lợn thời điểm khác thực phản ứng ELISA Kết thu thể bảng Bảng Biến động kháng thể của lợn tiêm virus DTL nhược độc xác định bằng ELISA Liều tiêm % blocking/ngày lấy máu D0 D7 D14 D21 D28 D35 101TCID50 11,580 23,580 39,580 53,080 62,280 67,060 102TCID50 19,780 29,520 45,380 57,000 71,800 78,340 103TCID50 29,920 42,180 53,560 61,600 69,740 78,980 10 TCID50 19,000 33,360 55,000 69,980 73,720 78,880 Đối chứng (không tiêm) 20,220 15,120 15,880 8,800 9,360 8,080 Kết quả nghiên cứu cho thấy, ở các liều tiêm 10 , 10 , 10 , 10 , lợn có đáp ứng miễn dịch tốt Sau tiêm virus DTL nhược độc 14 ngày, lợn bắt đầu có kháng thể máu Hàm lượng 20 kháng thể tăng dần và đạt hàm lượng cao nhất tại thời điểm 35 ngày sau miễn dịch Có sự khác biệt đáp ứng miễn dịch của lợn được tiêm với các liều virus khác Ở liều KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 miễn dịch 101 TCID50/ml, lợn có đáp ứng miễn dịch yếu hơn, sự xuất hiện kháng thể muộn và hàm lượng kháng thể máu cũng thấp so với liều tiêm khác Trong đó lợn được tiêm miễn dịch ở các liều 102, 103, 104 TCID50, có đáp ứng miễn dịch cao tương dương Tại thời điểm 35 ngày sau miễn dịch, kháng thể máu lợn miễn dịch 101 có giá trị Blocking đạt 67,1%, đó ở các liều miễn dịch 102; 103; 104 TCID50 có giá trị Blocking trung bình lần lượt là: 78,4%, 79,0% 78,9% Cả liều miễn dịch thử nghiệm chưa có dấu hiệu giảm hàm lượng kháng thể sau 35 ngày miễn dịch Trong lô đối chứng không tiêm, hàm lượng kháng thể âm tính suốt quá trình theo dõi Kết tương đồng với kết Chris Morrissy, Trần Xuân Hạnh (2010) xác định hiệu lực vacxin DTL chủng C thích nghi tế bào PK15A; Sara Munoz-Gonzalez & cs (2015) nghiên cứu hiệu vacxin nhược độc đề kháng với virus DTL cường độc lợn Biến động kháng thể lợn tiêm virus DTL nhược độc thể qua hình Hình Biến động kháng thể lợn tiêm virus DTL tế bào, xác định ELISA Biến động kháng thể trung hòa với việc xác định kháng thể lợn ELISA, chúng tơi cịn xác định hiệu giá kháng thể lợn phản ứng trung hòa tế bào Kết thể qua bảng Bảng Hiệu giá kháng thể trung hòa lợn tiêm virus DTL nhược độc Liều tiêm Hiệu giá kháng thể trung hòa/ngày lấy máu (Log2) D0 D7 D14 D21 D28 D35 10 TCID50 3.4 5.2 6.4 6.8 10 TCID50 2.5 4.2 5.8 7.8 103 TCID50 2.8 6.2 7.8 9.2 10 TCID50 2.8 5.2 6.8 9.4 Đối chứng (không tiêm) 0 0 0 Qua kết theo dõi biến động kháng thể trung hịa máu lợn thí nghiệm cho thấy: Nhóm lợn tiêm virus DTL nhược độc có hàm lượng kháng thể trung hịa máu tăng dần theo thời gian, đạt cao sau 35 ngày miễn dịch chưa có dấu hiệu giảm Ở liều miễn dịch 101 cho hàm lượng kháng thể trung hòa máu lợn thấp nhất, liều miễn dịch 103, 21 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 104 có hàm lượng kháng thể trung hịa cao tương đối giống Trong đó, lơ đối chứng hiệu giá kháng thể giảm dần gần sau 21 ngày theo dõi Hình cho ta thấy rõ biến động hàm lượng kháng thể trung hịa máu lợn thí nghiệm Hình Biến động kháng thể trung hòa lợn sau tiêm virus DTL tế bào Có khác biệt có ý nghĩa đáp ứng miễn dịch dịch thể miễn dịch cho lợn với liều 101 TCID50 so với liều miễn dịch cịn lại (P