Nghiên cứu tổng hợp Azathioprine

Bài viết này trình bày quá trình tổng hợp azathioprine qua 4 giai đoạn, hiệu suất tổng cộng đạt 28,2 %. Azathioprine tồn tại ở dạng tinh thể, màu vàng sáng, điểm nóng chảy 243-245 oC. Cấu trúc sản phẩm được xác định bằng các phương pháp vật lý hiện đại như phổ IR, NMR, MS.

Nghiên cứu khoa học công nghệ NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP AZATHIOPRINE Vũ Ngọc Tốn1*, Nguyễn Minh Trí1, Đỗ Hữu Ân2, Đào Minh Đức2 Tóm tắt: Azathioprine FDA phê duyệt để sử dụng điều trị chứng viêm khớp dạng thấp Nó chấp thuận liệu pháp bổ trợ để ngăn ngừa thải ghép thận Bài báo trình bày trình tổng hợp azathioprine qua giai đoạn, hiệu suất tổng cộng đạt 28,2 % Azathioprine tồn dạng tinh thể, màu vàng sáng, điểm nóng chảy 243-245 oC Cấu trúc sản phẩm xác định phương pháp vật lý đại phổ IR, NMR, MS Từ khóa: Azathioprine; Imidazole; Ức chế miễn dịch; Ghép tạng MỞ ĐẦU Ghép tạng việc di chuyển nội tạng từ người sang người khác từ vị trí sang vị trí khác thể người, nhằm thay nội tạng bị bị hư hỏng Nội tạng mô cấy ghép thể gọi autograft Việc cấy ghép nội tạng mô thực hai cá thể loài gọi allograft [1, 2] Sau ghép tạng, thải ghép nguy hàng đầu khiến ca ghép tạng thất bại [2] Kể từ thuốc ức chế miễn dịch đời, tỷ lệ thành công ca ghép tạng tăng lên đáng kể [4] Thuốc ức chế miễn dịch chia làm nhóm lớn: Thuốc ức chế miễn dịch nhóm bao gồm cyclosporine, tacrolimus, advagraf, glucocorticoid; thuốc ức chế miễn dịch nhóm gồm basiliximab, daclizumab, sirolimus, rapamycine thuốc ức chế miễn dịch nhóm gồm azathioprine, mycophenolate mofetil [1, 4] Azathioprine chất ức chế phân bào làm giảm tăng sinh tế bào T sử dụng ghép tạng Azathioprine hoạt động tế bào vào giai đoạn S chu trình tế bào, có tác dụng phong bế hoạt động acid inosinic [4] Azathioprine tổng hợp lần Hitchings cộng năm 1960 [3], nhiên, phương pháp Hitchings cộng tiến hành giai đoạn sử dụng nguyên liệu đầu 5chloro-1-methyl-4-nitroimidazole tác nhân đắt khơng có sẵn thị trường nước Năm 2009, Yuan-Xiang Fu cộng [6] đưa phương pháp tiến hành phản ứng tổng hợp azathioprine qua giai đoạn với hiệu suất tổng cộng đạt 20 % Trong báo này, sở nghiên cứu tối ưu hóa, azathioprine tổng hợp qua bước với hiệu suất tổng cộng đạt 28,2 % Cấu trúc, độ azathioprine sản phẩm trung gian xác nhận phương pháp vật lý đại IR, NMR, MS, tonc THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất Diethyl oxalate (99,0 %, Fischer) dung dịch methylamine (40 %, Fischer) sử dụng làm nguyên liệu ban đầu Phosphorus pentachloride (98,0 %), phosphoryl chloride (99,0 %), 6-mercaptopurine monohydrate (99,5 %), acid acetic (99,7 %) dimethyl sulfoxide (99,8 %) nhập hãng hóa chất Fischer Tất hóa chất khác sử dụng nghiên cứu có chất lượng đạt tinh khiết phân tích 2.2 Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp phổ hồng ngoại: Phổ IR ghi thiết bị FT-IR Tensor II (Bruker, Đức) dạng ép viên với KBr - Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Phổ 1H NMR 13C NMR đo máy phổ ADVANCE AV500 (Bruker, Đức) dung môi DMSO-d6, chất chuẩn nội Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Đặc san Viện Hóa học - Vật liệu, - 2020 Hóa học Kỹ thuật mơi trường TMS nhiệt độ phòng (300 K) Phổ 1H NMR đo tần số máy 500,13 MHz phổ 13 C NMR đo tần số máy 125,76 MHz - Phương pháp phổ khối lượng: Phổ ESI-MS đo thiết bị LTQ Orbitrap XL (Thermo Scientific, Mỹ), dung môi methanol - Phương pháp sắc ký mỏng: Sắc ký mỏng (TLC) tiến hành silicagel loại 60F254 No 5715 (Merck, Đức), với hệ dung môi n-hexane:ethyl acetate =1:1 (v/v), vết sản phẩm quan sát cách màu với iodine - Thiết bị đo điểm nóng chảy STUART SMP3 (Anh) 2.3 Phương pháp tổng hợp azathioprine - Tổng hợp oxalyl dimethylamine: Trong bình cầu cổ dung tích 500 mL lắp sẵn máy khuấy từ, phễu nhỏ giọt, sinh hàn, nhiệt kế, bổ sung monomethylamine 40 % (62 mL), làm lạnh hỗn hợp -5 oC hỗn hợp đá muối Nhỏ giọt từ từ diethyl oxalate (30 mL) vào hỗn hợp, khuấy trì nhiệt độ 0-5 oC Sau nhỏ giọt xong, khuấy tiếp điều kiện Kết tủa tách lọc, rửa nước đá bão hòa đến trung tính Sấy khơ 80 o/12 thu sản phẩm oxalyl dimethylamine (oxamide) chất rắn, màu trắng, tonc=215-217 oC O O OEt -2EtOH CH3 NH CH3NH2 + H3C NH EtO O O Methylamine Diethyl oxalate Oxalyl dimethylamine - Tổng hợp 5-chloro-1-methylimidazole nitrate: Oxamide (4,389 g) phosphorus pentachloride (16,0 g) chuyển vào bình cầu cổ dung tích 250 mL Bổ sung 15 mL dung môi POCl3 vào hỗn hợp phản ứng Hỗn hợp khuấy cách thủy 60-70 oC Lắp cô quay chân không, cất loại dung môi POCl3 (lưu ý nhiệt độ không 70 o C) Phần cặn sau chưng cất bổ sung thêm 30 mL nước cất, khuấy thu dung dịch Chỉnh pH dung dịch pH 10-12 dung dịch KOH 60-70 % Chiết dung dịch với dichloromethane (3x20 mL) thu dịch lọc Để yên dịch chiết qua đêm bay toàn thu phần cặn Bổ sung 30 mL acetone vào phần cặn, khuấy lọc thu dịch lọc Acid hóa dịch lọc acid nitric đặc đến pH 1-3 sau làm lạnh dung dịch Kết tủa tách lọc, rửa acetone lạnh phễu lọc Buchner Sấy kết tủa 80 oC/12 thu sản phẩm chất rắn, màu trắng, tonc=141-143 oC Cl O H3C NH NH CH3 PCl5, POCl3 O Oxalyl dimethylamine HNO3 H3C N + - NO3 N H 5-Chloro-1-methylimidazole nitrate - Tổng hợp 5-chloro-1-methyl-4-nitroimidazole: 5-chloro-1-methylimidazole nitrate (2,685 g) chuyển vào bình cầu cổ dung tích 250 mL Hỗn hợp gồm mL acid sulfuric đặc 1,7 mL acid acetic băng chuyển vào phễu nhỏ giọt Nhỏ giọt từ từ kết hợp với khuấy cách thủy hỗn hợp phản ứng nhiệt độ không 25 oC Sau kết thúc nhỏ giọt, gia nhiệt hỗn hợp đến giá trị 40, 50, 60, 70, 80 C, với giá trị nhiệt độ trì Khi phản ứng kết thúc, rót tồn hỗn hợp vào cốc 250 mL Thêm 100 g đá vụn vào hỗn hợp thấy xuất kết tủa trắng Lọc, rửa nước lạnh phễu Buchner đến pH trung tính Sấy kết tủa 80 oC/12 thu sản phẩm chất rắn, màu trắng, tonc=148-150 oC 10 V N Toán, , Đ M Đức, “Nghiên cứu tổng hợp Azathioprine.” Nghiên cứu khoa học công nghệ Cl H3C NO2 H2SO4 N N Cl + CH3COOH N N NO3 H H3C 5-Chloro-1-methyl-4-nitroimidazole 5-Chloro-1-methylimidazole nitrate - Tổng hợp azathioprine: Trong bình cầu cổ dung tích 250 mL lắp sẵn máy khuấy từ gia nhiệt, nhiệt kế, sinh hàn hồi lưu, cách ẩm, chuyển 6-mercaptopurine khan (2,3 g), 5chloro-1-methyl-4-nitroimidazole (2,5 g) natri acetate khan (1,25 g) vào bình cầu, thêm 20 mL dung môi DMSO khô Hỗn hợp gia nhiệt cách thủy đến 100 oC trì Để yên hỗn hợp qua đêm nhiệt độ phòng Sau đó, rót từ từ hỗn hợp vào 200 g đá vụn, kết tủa màu vàng tách lọc, rửa với nước lạnh Kết tinh lại hệ dung môi acetone-nước theo tỷ lệ 3:2 Sấy khô 80 oC/12 thu azathioprine chất rắn, màu vàng sáng SH N N NO2 N N Cl NO2 N H Mercaptopurine N CH3COONa, DMSO H3C 5-Chloro-1-methyl-4-nitroimidazole N S N CH3 N N N Azathioprine N H KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết tổng hợp oxalyl dimethylamine Phản ứng tổng hợp oxalyl dimethylamine dựa phản ứng diethyl oxalate với dung dịch monomethylamine Hiệu suất phản ứng phụ thuộc nhiều vào nồng độ dung dịch monomethylamine tỷ lệ mol tác nhân phản ứng Bảng Khảo sát điều kiện tổng hợp oxalyl dimethylamine Hiệu suất Nồng độ Tỷ lệ mol Nhiệt độ Thời gian Lần o (%) amine (%) (amine/oxalate) (C) (giờ) 30 2,0 0-5 51,95 30 2,5 0-5 65,86 33 2,0 0-5 54,52 33 2,5 0-5 70,99 40 2,0 0-5 61,45 40 2,5 0-5 81,87 Sản phẩm oxalyl dimethylamine thu chất rắn, màu trắng IR (cm-1): 3311 cm-1 (νNH), 2943 cm-1 2806 cm-1 (νCH), 1660 cm-1 (νC=O amide), 1531 cm-1 (δNH), 1403 cm-1 (δCH) 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ=7,59 ppm (s, 1H), δ=2,91 ppm (d, 3H, J 5,5 Hz) tonc=215-217 oC, TLC 01 điểm Phổ 1H NMR rõ nét, khơng xuất tín hiệu tạp chất, sản phẩm có độ tinh khiết cao Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Đặc san Viện Hóa học - Vật liệu, - 2020 11 Hóa học Kỹ thuật mơi trường 3.2 Kết tổng hợp 5-chloro-1-methylimidazole nitrate Từ sản phẩm oxalyl dimethylamine thu giai đoạn trước, tiến hành phản ứng đóng vịng tác nhân PCl5 dung mơi POCl3 theo Wallach [5] sau tạo muối với acid nitric Phản ứng tạo muối với acid nitric cần thiết muối tạo thành dạng rắn, màu trắng, dễ dàng phân lập so với sản phẩm chưa tạo muối Nghiên cứu khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp imidazole cho kết bảng Bảng Khảo sát điều kiện tổng hợp 5-chloro-1-methylimidazole nitrate Tỷ lệ mol Nhiệt độ Thời gian Hiệu suất Lần Dung môi chiết o (PCl5/amine) (C) (h) (%) Chloroform 28,34 1 Dichloromethane Chloroform Dichloromethane Chloroform Dichloromethane 60-70 60-70 60-70 60-70 60-70 60-70 32,86 40,94 46,59 41,93 47,11 Kết thu cho thấy, việc chiết imidazole dichloromethane cho hiệu suất cao nhiều so với việc chiết dung môi chloroform tỷ lệ mol PCl5/oxalyl dimethylamine tối ưu Cơ chế đóng vịng imidazole sau: Cl NCH3 CONHCH3 CONHCH3 Cl N CH2 H Cl H Cl NCH3 N CH2 CH3 + N H Cl H N H CH3 Cl N H N H Sản phẩm thu chất rắn, màu trắng IR (cm-1): 3118 cm-1 (ν=CH), 2962, 2922 2852 cm-1 (νCH), 1641(δC=N), 1497 1452 cm-1 (νC=C thơm), 1358 cm-1 (δCH), 807 cm-1 (νCo Cl) Nhiệt độ nóng chảy 141-143 C TLC 01 điểm 3.3 Kết tổng hợp 5-chloro-1-methyl-4-nitroimidazole Tiến hành phản ứng nitro hóa 5-chloro-1-methylimidazole nitrate dung mơi acid acetic, xúc tác acid sunfuric Phản ứng xảy theo chế electrophile (SE) vào nhân thơm Lượng acid sulfuric sử dụng dư khoảng lần so với nguyên liệu imidazole ban đầu cho hiệu suất tối ưu Kéo dài thời gian phản ứng cho thấy hiệu suất phản ứng có xu hướng giảm dần Sản phẩm thu chất rắn, màu trắng Hiệu suất: 85,32 % IR (cm-1): 3117 cm-1 (ν=CH), 1533 (νas NO2), 1510 1477 cm-1 (νC=C thơm), 1384 cm-1 (νs NO2), 827 cm-1 (νC-Cl); 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ=7,97 ppm (s, 1H, H-2), δ=3,69 ppm (s, 3H, CH3); 13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz): δ=141,2 ppm (C-4), 136,3 ppm (C-5), 119,7 ppm (C-2), 32,5 ppm (CH3) tonc= 148-150 oC, TLC 01 điểm Phổ 1H NMR có đường phẳng, khơng xuất tín hiệu tạp chất, khẳng định sản phẩm có độ tinh khiết cao, sử dụng để chuyển hóa giai đoạn cuối 3.4 Kết tổng hợp azathioprine Azathioprine tổng hợp dễ dàng từ phản ứng 5-chloro-1-methyl-4nitroimidazole 6-mercaptopurine khan dung môi DMSO, xúc tác NaHCO3, 12 V N Toán, , Đ M Đức, “Nghiên cứu tổng hợp Azathioprine.” Nghiên cứu khoa học công nghệ CH3COONa K2CO3 khan Nguyên liệu 6-mercaptopurine dạng thương mại tồn dạng hydrate hóa, cần chuyển hóa dạng khan cách sấy khơ nhiệt độ 140 oC khoảng 7-8 giờ, tính tốn độ giảm khối lượng đến khối lượng khơng đổi Bảng Khảo sát ảnh hưởng chất xúc tác tới hiệu suất tổng hợp azathioprine Hiệu suất (%) Xúc tác Thời gian (h) Lần Lần Lần Trung bình NaHCO3 81,55 81,89 81,63 81,69 ± 0,25 CH3COONa 85,83 85,13 85,25 85,40 ± 0,53 K2CO3 78,95 78,46 78,49 78,63 ± 0,39 Kết tinh lại sản phẩm azathioprine số dung môi dung dịch amoniac, hệ dung môi acetone: nước (3:2) methanol để xác định hiệu suất thu hồi Kết cho thấy, hiệu suất thu hồi thu 92 %, 97 % 94 % hệ dung môi Sản phẩm sau kết tinh lại lọc, hút sấy khô tủ sấy 80 oC/12 thu sản phẩm azathioprine dạng vẩy, màu vàng sáng Nhiệt độ nóng chảy 243-245 oC, TCL xuất 01 điểm Công thức cấu tạo đánh số công thức azathioprine: NO2 N 1N S 1' 6' CH3 N 2' 7' 5' N 8' N 4' N 9' 3' H Kết phân tích phổ NMR: - 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ=13,74 ppm (s, 1H, NH), δ=8,58 ppm (s, 1H, H2’), δ=8,54 ppm (s, 1H, H-8’), δ=8,24 ppm (s, 1H, H-2), δ=3,70 ppm (s, 3H, N-CH3); - 13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz): δ=154,7 ppm (C-5’), δ=151,6 ppm (C-2’ C-8’, chồng chập), δ=150,6 ppm (C-4’), δ=149,7 ppm (C-4), δ=144,4 ppm (C-6’), δ=139,4 ppm (C-2), δ=117,2 ppm (C-5), δ=32,9 ppm (N-CH3); - COSY: Không xuất tương tác; - HSQC: 139,4 ppm (C-2) ↔ 8,58 (H-2’), 151,6 ppm (C-8’) ↔ 8,54 ppm (H-8’), 139,4 ppm (C-2) ↔ 8,24 ppm (H-2); - HMBC: 3,70 ppm (CH3) ↔ 149,7 ppm (C-4) 117,2 ppm (C-5); 8,24 ppm (H-2) ↔ 150,6 ppm (C-4’) 117,2 ppm (C-5) Kết phân tích phổ MS: Trên phổ ESI-MS xuất pic ion “giả” phân tử có số khối m/z 278 ([M+H]+) Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Đặc san Viện Hóa học - Vật liệu, - 2020 13 Hóa học Kỹ thuật mơi trường Hình Phổ 1H NMR hợp chất azathioprine Hình Phổ 13C NMR hợp chất azathioprine KẾT LUẬN Bằng việc khảo sát xúc tác khác nhau, tổng hợp thành công hợp chất azathioprine qua giai đoạn với hiệu suất đạt 28,2 % So với cơng bố nhóm tác giả Yuan-Xiang Fu, quy trình tổng hợp azathioprine đưa có hiệu suất cải thiện đáng kể Cấu trúc, độ sản phẩm xác nhận phương pháp vật lý đại IR, NMR, MS tonc TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Athanasiou V T et al (2010), “Historical comparison of autograft, allograft-DBM, xenograft and synthetic grafts in a trabecular bone defect: an experimental study in rabbits”, Med Sci Monit., 16 (1), pp 24-31 [2] Barker C F., Markmann J F (2013), “Historical overview of transplantation”, Cold Spring Harb Perspect Med., (4), pp 1-19 [3] Hitchings G H., Yonkers (1962), Purine derivatives, US patent No 3,056,785 [4] Jean-Paul S (2011), “The history of kidney transplantation: Past, Present and Future (With special references to the Belgian History)”, University of Liege, Belgium, 39 pages 14 V N Toán, , Đ M Đức, “Nghiên cứu tổng hợp Azathioprine.” Nghiên cứu khoa học công nghệ [5] Wallach O., Boehringer A (1877), “Verhalten des Dimethylexamids”, Justus Liebig’s Annalen der Chemie, 184, pp 50-57 [6] Yuan-Xiang Fu et al (2009), “Method for producing azathioprine intermediate and product produced thereby”, CN patent No 101486681B ABSTRACT RESEARCH ON SYNTHESIS OF AZATHIOPRINE Azathioprine is approved by FDA for symptomatic treament of active rheumatoid arthritis It also has approval as adjuncive therapy for the prevent of kidney transplant rejection In this paper, the process of synthesis azathioprine through four steps, yield 28.2 % is introduced Azathioprine exists in yellow crystalline form, melting point 243-245 oC The products structure were determined by modern physical methods such as IR, NMR, MS spectra Keywords: Azathioprine; Imidazole; Immunosuppressive; Allografts Nhận ngày 30 tháng năm 2020 Hoàn thiện ngày 18 tháng năm 2020 Chấp nhận đăng ngày 24 tháng năm 2020 Địa chỉ: 1Viện Công nghệ mới/Viện KH-CN quân sự; Khoa Hóa học/Trường Đại học Khoa học Tự nhiên/Đại học QGHN *Email: vntoanchem@gmail.com Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Đặc san Viện Hóa học - Vật liệu, - 2020 15 ... ? ?Nghiên cứu tổng hợp Azathioprine. ” Nghiên cứu khoa học công nghệ Cl H3C NO2 H2SO4 N N Cl + CH3COOH N N NO3 H H3C 5-Chloro-1-methyl-4-nitroimidazole 5-Chloro-1-methylimidazole nitrate - Tổng hợp. .. Kết tổng hợp azathioprine Azathioprine tổng hợp dễ dàng từ phản ứng 5-chloro-1-methyl-4nitroimidazole 6-mercaptopurine khan dung môi DMSO, xúc tác NaHCO3, 12 V N Toán, , Đ M Đức, ? ?Nghiên cứu tổng. .. khảo sát xúc tác khác nhau, tổng hợp thành công hợp chất azathioprine qua giai đoạn với hiệu suất đạt 28,2 % So với cơng bố nhóm tác giả Yuan-Xiang Fu, quy trình tổng hợp azathioprine đưa có hiệu