Nghiên cứu sản xuất chitin phân tử lượng thấp có hoạt tính sinh học và bước đầu thử nghiệm trong bảo quản cá ngừ chù (auxis thazard) nguyên liệu (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG TRẦN VĂN VƯƠNG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHITIN PHÂN TỬ LƯỢNG THẤP CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ BƯỚC ĐẦU THỬ NGHIỆM TRONG BẢO QUẢN CÁ NGỪ CHÙ (AUXIS THAZARD) NGUYÊN LIỆU TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Công nghệ Chế biến Thủy sản Mã số: 9540105 Khánh Hịa - 2020 Cơng trình hồn thành Trường Đại học Nha Trang Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS VŨ NGỌC BỘI Trường Đại Học Nha Trang PGS.TS NGUYỄN ANH TUẤN Trường Đại Học Nha Trang Phản biện 1: PGS.TS NGÔ ĐẠI NGHIỆP Trường đại học KHTN TP HCM Phản biện 2: PGS.TS NGUYỄN VĂN MINH Trường đại học Nha Trang Phản biện 3: GS.TS NGUYỄN THỊ HIỀN Trường đại học Bách Khoa Hà Nội Luận án bảo vệ Hội đồng đánh giá luận án Trường Đại học Nha Trang vào hồi giờ, ngày tháng năm 2020 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia - Thư viện Trường Đại học Nha Trang TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Đề tài luận án: Nghiên cứu sản xuất chitin phân tử lượng thấp có hoạt tính sinh học bước đầu thử nghiệm bảo quản cá ngừ chù (Auxis thazard) nguyên liệu Chuyên ngành: Công nghệ Chế biến Thủy sản Mã số: 9540105 Nghiên cứu sinh: Trần Văn Vương Khóa: 2011 Người hướng dẫn: PGS.TS Vũ Ngọc Bội PGS.TS Nguyễn Anh Tuấn Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Nha Trang Nội dung: Cung cấp dẫn liệu khoa học hiệu phân cắt chitin huyền phù dung dịch axít HCl 10% thành oligochitin phân đoạn A (1÷3 kDa) chiếu xạ γ (nguồn Co-60) so sánh hiệu phân cắt với axít HCl chitinase Cung cấp dẫn liệu tối ưu hóa cơng đoạn sản xuất oligochitin phân đoạn A chiếu xạ γ (nguồn Co-60) chitin huyền phù dung dịch axít HCl 10% Kết nghiên cứu giúp bổ sung thêm liệu, nhằm nâng cao hiệu sản xuất thu hồi oligochitin phân đoạn A Cung cấp dẫn liệu hoạt tính chống oxy hóa kháng khuẩn oligochitin phân đoạn A nhóm vi khuẩn gây thối TPC, Pseudomonas spp Shewanella putrefaciens; nhóm vi khuẩn gây bệnh Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus Salmonella typhimurium Cung cấp dẫn liệu thông số chứng minh oligochitin phân đoạn A sản xuất chiếu xạ γ (nguồn Co-60) phân cắt chitin huyền phù dung dịch axít HCl 10% an tồn khơng gây độc cho chuột thí nghiệm Đề xuất 01 quy trình bảo quản cá ngừ chù nguyên liệu oligochitin phân đoạn A với thông số kỹ thuật cụ thể Người hướng dẫn PGS.TS Vũ Ngọc Bội PGS.TS Nguyễn Anh Tuấn Nghiên cứu sinh Trần Văn Vương MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Nguyên liệu thủy sản, có cá ngừ chù sau đánh bắt thường hư hỏng nhanh Vì ngư dân sở thu mua, chế biến có xu hướng sử dụng chất bảo quản độc hại Xu cải tiến công nghệ chế biến bảo quản thủy sản theo hướng sử dụng chất hữu có hoạt tính sinh học cao không độc hại Do "Nghiên cứu sản xuất chitin phân tử lượng thấp (dạng oligochitin) có hoạt tính sinh học bước đầu thử nghiệm bảo quản cá ngừ chù (Auxis thazard) nguyên liệu” hướng nghiên cứu có ý nghĩa thực tiễn Mục tiêu luận án - Lựa chọn tác nhân phân cắt chitin thành oligochitin phù hợp - Xác định thông số tối ưu cho công đoạn phân cắt chitin thành oligochitin - Sản xuất oligochitin có hoạt tính sinh học (kháng khuẩn chống oxy hóa) - Đánh giá hiệu sử dụng oligochitin bảo quản cá ngừ chù (Auxis thazard) nguyên liệu Đối tượng phạm vi nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu Chitin sản xuất từ đầu vỏ tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) theo quy trình đề tài KC07.02/11-15 cá ngừ chù (Auxis thazard) nguyên liệu đánh bắt Khánh Hòa 3.2 Phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu lựa chọn tác nhân phân cắt chitin thành oligochitin - Nghiên cứu tối ưu hóa cơng đoạn phân cắt chitin thành oligochitin tác nhân chọn - Đánh giá số tính chất oligochitin sản xuất - Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa kháng khuẩn oligochitin - Đánh giá độc tính oligochitin thu nhận - Thử nghiệm sử dụng oligochitin bảo quản cá ngừ chù nguyên liệu Phương pháp nghiên cứu Sử dụng phương pháp đại nghiên cứu phân cắt chitin thành oligochitin Đặc trưng tính chất, đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, hoạt tính chống oxy hóa độc tính oligochitin thu nhận Kết cấu luận án Luận án gồm 148 trang nội dung, 134 tài liệu tham khảo 32 trang phụ lục Nội dung luận án trình bày chương, với 30 bảng biểu, 64 hình ảnh, đồ thị sơ đồ nghiên cứu CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CHITIN VÀ OLIGOCHITIN Chitin polysaccharide có cấu trúc đa phân tử, mạch thẳng, đồng trùng hợp từ hai tiểu đơn vị 2-amino-2 deoxy-D glucopyranose (GlcN) 2-acetamido-2deoxy-D-glucopyranose (GlcNAc) thông qua liên kết β-1-4-glucoside Chitin xem dẫn xuất cellulose mà nhóm hydroxyl C2 thay nhóm acetamide (-NH-CO-CH3) Dựa vào trọng lượng phân tử trung bình (Mw), chitin có Mw ≤ 100 kDa xem chitin có phân tử lượng thấp Cịn oligochitin hay chitin oligosaccharide oligosaccharide có trọng lượng phân tử ≤ 10 kDa có từ hai đến hàng chục gốc monosaccharide liên kết với liên kết β-1,4-glucoside Oligochitin có khả kết tinh tan nước hầu hết loại dung mơi có nhiều hoạt tính sinh học kháng nấm, hoạt tính kháng vi khuẩn, kháng khối u, bướu, tăng cường hiệu miễn dịch, bảo vệ chống lại nhiễm trùng oxy hóa 1.2 PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT CHITIN VÀ OLIGOCHITIN Ở Việt Nam giới, phương pháp sản xuất chitin dẫn xuất từ nguồn phế liệu thủy sản chủ yếu sử dụng phương pháp hóa học để sản xuất quy mô công nghiệp Kỹ thuật sản xuất chitin theo phương pháp hóa học quy mơ cơng nghiệp có nhiều công đoạn nghiêm ngặt thường thải lượng lớn chất hóa học gây nhiễm mơi trường Sử dụng phương pháp sinh học sản xuất chitin để khắc phục nhược điểm gây nhiễm mơi trường phương pháp hóa học sản xuất chitin chitosan số nhà nghiên cứu đề cập 1.3 ỨNG DỤNG OLIGOCHITIN Oligochitin polymer tự nhiên, an toàn sản phẩm thu phân cắt chitin Oligochitin dễ tan nước có đầy đủ tính chất chitin, có phân tử lượng thấp nên oligochitin linh động có hoạt tính sinh học mạnh chitin, thể khả chống oxy hóa, hoạt tính kháng khuẩn nên có tiềm ứng dụng nhiều lĩnh vực đặc biệt lĩnh vực chế biến bảo quản thực phẩm Ngoài theo số nghiên cứu gần đây, hoạt tính kháng khuẩn chống oxy hóa cao oligochitin cịn có số đặc tính sinh học chống phát triển tế bào ung thư nên có sử dụng để làm thực phẩm chức năng, kích thích hệ miễn dịch chống nhiễm bệnh vật nuôi kháng nấm thực vật nên ứng dụng lĩnh vực trồng trọt Hiện nghiên cứu ứng dụng oligochitin lĩnh vực bảo quản thực phẩm, đặc biệt bảo quản nguyên liệu thủy sản quy mơ cơng nghiệp cịn nghiên cứu thời gian gần CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 2.1.1 Chitin Chitin sản xuất Trung tâm thí nghiệm thực hành - trường Đại học Nha Trang theo quy trình đề tài KC07.02/11-15 từ nguyên liệu đầu vỏ tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei), lô 50 kg Sau đó, tiếp tục tinh theo phương pháp giới thiệu Nguyễn Công Minh cs sấy khô kỹ thuật sấy lạnh, xay nhỏ tới kích thước ≤ 1mm 2.1.2 Enzyme Chitinase (EC 3.2.1.14), loại endochitinase tinh khiết dạng bột, nguồn gốc từ Streptomyces griseus (C6137-25UN), pHop 6,0, top 370C, hoạt độ ≥ 0,2 units/mg theo công bố, xuất xứ Sigma–Aldrich Mỹ bảo quản sử dụng theo hướng dẫn nhà sản xuất Hemicellulase (EC 232.799.9) nguồn gốc từ Aspergillus niger, dạng bột màu trắng pHop 4,5, top 400C, hoạt độ 3,0 units/mg, xuất xứ Sigma-Aldrich Mỹ bảo quản sử dụng theo hướng dẫn nhà sản xuất Cellulase (EC 232.734.4) nguồn gốc từ Aspergillus niger, dạng bột màu trắng pHop 5,0, top 370C, hoạt độ 3,0 units/mg, xuất xứ Sigma-Aldrich Mỹ bảo quản sử dụng theo hướng dẫn nhà sản xuất 2.1.3 Hóa chất Hóa chất sử dụng nghiên cứu, phân tích loại dùng cho thí nghiệm có xuất xứ Merck Đức Trung Quốc Các loại hóa chất bảo quản theo yêu cầu nhà sản xuất ghi bao bì Các loại hóa chất sử dụng HCl, H3PO4, HNO3, NaOH, Methanol, Ethanol, Aceton 2.1.4 Chủng vi sinh vật thử nghiệm + Nhóm vi khuẩn gây thối: Tổng số vi sinh vật hiếu khí (TPC), Shewanella putrefaciens Pseudomonas spp Được phân lập cá ngừ chù nguyên liệu gây thối điều kiện tương tự mẫu cá ngừ chù bảo quản + Nhóm vi khuẩn gây bệnh: Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus Sử dụng chủng gốc lưu phân viện Thú y Miền Trung Nha Trang 2.1.5 Cá ngừ chù nguyên liệu Cá ngừ chù nguyên liệu (Auxis thazard) loại tươi, thu mua từ tàu cá, đánh bắt vùng biển Khánh Hòa, chiều dài 40±5 cm, trọng lượng 1000±50 gr/con Phù hợp với TCVN 2646-78: Cá biển ướp nước đá yêu cầu kỹ thuật 2.1.6 Nước đá Nước đá sản xuất phịng thí nghiệm, nước làm đá đảm bảo chất lượng theo QCVN 02:2009/BYT: Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia chất lượng nước sinh hoạt 2.1.7 Chuột thí nghiệm Sử dụng chuột lang (Cavia porcellus) làm chuột thí nghiệm đánh giá độc chất học Chuột sử dụng có khối lượng trung bình 300-350 g/con, số lượng 80 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát Để hoàn thành nội dung nghiên cứu, luận án tiến hành bước thí nghiệm trình bày Hình 2.1 Chitin rắn, kích thước ≤ 1mm Chitin huyền phù Chitin dung dịch Phân cắt chiếu xạ γ (nguồn 60Co) Xử lý huyền phù Đánh giá hiệu phân cắt chitin dựa vào độ giảm phân tử lượng trung bình (Mv) Lựa chọn chitin dạng phù hợp Phân cắt axít: HCl 36% H3PO4 85% Phân cắt enzyme: Chitinase HNO3 70% Cellulase Hemicellulase Đánh giá hiệu phân cắt thông qua xác định hàm lượng GlcNAc tạo thành Đánh giá hiệu phân cắt thông qua xác định hàm lượng GlcNAc tạo thành Lựa chọn loại axít phù hợp, Phân cắt chitin thành oligochitin Lựa chọn loại enzyme phù hợp, phân cắt chitin thành oligochitin phân cắt chitin thành oligochitin chiếu xạ γ (nguồn 60Co) Đánh giá hiệu phân cắt chitin thành oligochitin thông qua đánh giá: lượng oligochitin thu hồi, hoạt tính kháng khuẩn chống oxy hóa, chi phí sản xuất Lựa chọn tác nhân phân cắt chitin thành oligochitin phù hợp Tối ưu hóa cơng đoạn sản xuất oligochitin tác nhân lựa chọn Sản xuất thu nhận oligochitin từ quy trình tối ưu Đánh giá oligochitin thu nhận Cụ thể: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn chống oxy hóa Đánh giá độc tính Đặc trưng tính chất Thử nghiệm bảo quản cá ngừ chù nguyên liệu nước đá lạnh Đánh giá chất lượng cảm quan Đánh giá số tiêu hóa học Đánh giá số tiêu vi sinh vật Đề xuất quy trình bảo quản cá ngừ chù nguyên liệu oligochitin nước đá lạnh Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng qt 2.2.2 Phương pháp sử dụng phân tích 2.2.2.1 Xác định tính chất chitin • Xác định độ ẩm phương pháp sấy tới khối lượng không đổi, theo AOAC (1990) • Xác định độ deacetyl chitin, oligochitin dựa vào đo độ hấp phụ quang học sau phân cắt mẫu với H3PO4 theo phương pháp giới thiệu Hein cs (2008) • Xác định phân tử lượng trung bình độ nhớt, nhớt kế Ubbelohde theo phương pháp Einbu cs (2004) • Xác định hàm lượng tro tổng phương pháp nung, theo AOAC (1990) • Xác định hàm lượng protein hòa tan, theo phương pháp theo phương pháp microbiuret (Hein cộng sự, 2004) • Đánh giá màu sắc phương pháp cảm quan 2.2.2.2 Xác định hoạt độ enzyme • Xác hoạt độ chitinase phương pháp Miller, thông qua phản ứng axít 3,5-dinitrosalicylic với N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) tạo thành từ q trình phân cắt chitin • Xác định hoạt độ cellulase, hemicellulas phương pháp Miller, thông qua phản ứng D-glucose tạo thành từ q trình phân cắt CMC với axít 3,5dinitrosalicylic 2.2.2.3 Đánh giá khả phân cắt chitin Đánh giá khả phân cắt chitin thông qua xác định lượng đường khử Nacetyl-D-glucosamine (GlcNAc) tạo thành (mg/g chitin), dựa vào phản ứng N-acetylD-glucosamine (GlcNAc) với axít 3,5-dinitrosalicylic (DNS) 2.2.2.4 Thu nhận oligochitin phân đoạn A B đánh giá hiệu suất thu hồi • Sử dụng màng lọc theo phương pháp Yeon & Kim (2000) có chút hiệu chỉnh • Sử dụng hóa chất theo phương pháp E Muraki cs (1993) có chút hiệu chỉnh • Đánh giá hiệu suất thu hồi oligochitin = Khối lượng oligochitin thu hồi (gr)/Khối lượng mẫu chitin ban đầu (gr)*100 (%) 2.2.2.5 Đánh giá chất lượng cá ngừ chù nguyên liệu • Lấy mẫu, bảo quản mẫu, theo TCVN 6507:2005, TCVN 6404: 2008, TCVN 5287:2008 • Đánh giá chất lượng cảm quan, theo No.103/76 OJ No.L20 EEC (28-01-1976) • Xác định pH, theo TCVN 4835-2002 • Xác định hàm lượng tổng nitơ bazơ bay (TVB-N), theo TCVN 9215:2012 • Xác định hàm lượng nitơ ammoniac (NH3), theo TCVN 3706-90 • Xác định định lượng hàm lượng malonaldehyde (MAD) TBARS • Xác định hàm lượng histamin phương pháp HPLC, theo AOAC Số 977.13 • Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí (TPC), theo tiêu chuẩn ISO 6887-1 (9/1999) có chút hiệu chỉnh • Xác định vi khuẩn sinh H2S (Shewanella putrefaciens) theo phương pháp Gram L (1992) có chút hiệu chỉnh • Xác định Pseudomonas spp theo phương pháp Gram L (1992) có chút hiệu chỉnh • Xác định Clostridium perfringens, theo tiêu chuẩn ISO 7251 (7/2005) • Xác định Staphylococcus aureus, theo tiêu chuẩn ISO 6888-1 (1/2004) • Xác định Salmonella typhimurium, theo tiêu chuẩn ISO 6579 (2/2006) • Tham chiếu chất lượng cảm quan số tiêu hóa học theo TCVN 2646-78 • Tham chiếu giới hạn vi sinh vật gây bệnh theo QĐ 46/2007/BYT 2.3 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÍ SỐ LIỆU Sử dụng phân tích ANOVA kết hợp với Tukey Test để so sánh giá trị trung bình mẫu nghiên cứu Sử dụng phần mềm DX 8.0.3, Microsoft Office Excel 2013 để thiết kế thí nghiệm, phân tích tối ưu xử lý thống kê CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 SẢN XUẤT VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CHITIN Bảng 3.1 Kết đánh giá số tiêu chất lượng chitin thu nhận Đặc tính Chitin STT Tên tiêu sản phẩm AxioGen [28] Màu sắc Trắng ngà Ngà vàng Độ ẩm (%) 8±0,21