Nghiên cứu vai trò của Allicin từ tỏi trong quá trình điều hòa một số đáp ứng viêm trong bệnh nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng thông qua thụ thể Dectin-1.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI BÁO CÁO TỔNG KẾT KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI KH&CN CẤP ĐẠI HỌC QUỐC GIA Tên đề tài: Nghiên cứu vai trò Allicin từ tỏi q trình điều hịa số đáp ứng viêm bệnh nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng thông qua thụ thể Dectin-1 Mã số đề tài: QG 12.13 Chủ nhiệm đề tài: Trịnh Tất Cường PHẦN I THÔNG TIN CHUNG 1.1 Tên đề tài: Nghiên cứu vai trị Allicin từ tỏi q trình điều hòa số đáp ứng viêm bệnh nhiễm trùng nặng chống nhiễm trùng thơng qua thụ thể Dectin1 1.2 Mã số: QG 12.13 1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực đề tài TT Chức danh, học vị, họ tên Đơn vị công tác Vai trò thực đề tài TS Trịnh Tất Cường ĐHKHTN Chủ trì đề tài Ths Trần Thì Thùy Anh ĐHKHTN Thành viên Cn Hồng Hải Yến ĐHKHTN Thư ký 1.4 Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên 1.5 Thời gian thực hiện: 1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng 10 năm 2012 đến tháng 10 năm 2014 1.5.2 Gia hạn (nếu có): không 1.5.3 Thực thực tế: từ tháng 10 năm 2012 đến tháng 10 năm 2014 1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): Khơng có thay đổi so với thuyết minh ban đầu 1.7 Tổng kinh phí phê duyệt đề tài: 170 triệu đồng PHẦN II TỔNG QUAN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Viết theo cấu trúc báo khoa học tổng quan từ 6-15 trang (báo cáo đăng tạp chí khoa học ĐHQGHN sau đề tài nghiệm thu), nội dung gồm phần: Đặt vấn đề Các nghiên cứu gần công bố allicin: Có khả chống viêm nhiễm, tăng cường khả thực bào, tăng cường khả tế bào giết tự nhiên, ức chế phát triển vi sinh vật gây bệnh phát triển tế bào ung thư [12] Rất nhiều công bố khoa học công ty giới sản xuất Allicin từ việc tạo trình xúc tác Allinin với enzym allinase có sẵn tỏi [12, 13] Dựa vào tín hiệu thụ thể Dectin-1, số hợp chất tách chiết từ thực vật chứng minh có khả điều hịa đáp ứng viêm điều trị hiệu chuột bị nhiễm khuẩn nặng choáng nhiễm trùng Chẳng hạn, chất tách chiết từ nhân sâm Hàn Quốc Rb1, Rb2, Rc, hợp chất K (C-K) cơng bố có khả điều hịa tín hiệu viêm cytokine, q trình phosphoryl hóa MAPK (mitogen activated protein kinase), loại phản ứng ơxy hóa (ROS) thơng qua tín hiệu thụ thể Dectin-1 [4, 11] Tuy nhiên, chất có nguồn gốc từ nhân sâm nên đắt Do vậy, việc tìm kiếm chất có hoạt tính chống viêm vấn đề cấp bách để thay số thuốc sử dụng nay, góp phần làm giảm bớt tỷ lệ tử vong giá thành điều trị bệnh nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng Hơn nữa, kể giới nước chưa có nghiên cứu sâu vào đánh giá vai trò Allicin đường tín hiệu thụ thể Dectin-1 q trình điều hịa phản ứng viêm mức vật chủ Đặc biệt, Việt Nam quốc gia có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm, lượng dân số vào loại cao giới nên khả mắc bệnh nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng viêm (inflammation) cao Cho đến nay, nhiễm trùng nặng chống nhiễm trùng nguyên nhân ca tử vong bệnh nhân cần chăm sóc đặc biệt (ICU) [2, 5, 6, 7, 10] Trong đó, Việt nam có sẵn nguồn tài nguyên vô đa dạng thực vật mà khả ứng dụng vào lĩnh vực dược phong phú [1] Do vậy, việc tìm kiếm phương pháp tá dược có tiềm vấn đề cần thiết cấp bách để điều trị hiệu trình viêm hệ thống hỗ trợ cải thiện khả điều trị bệnh nhân bị nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng Xuất phát từ sở khoa học thực tiễn tiến hành nghiên cứu đề tài Mục tiêu - Có quy trình sản xuất Allicin từ tỏi - Xác định chức điều hịa q trình đáp ứng viêm Allicin từ tỏi - Đánh giá hiệu Allicin trình điều trị chuột bị nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng Phương pháp nghiên cứu 3.1 Tách chiết macrophage từ tủy xương chuột [4, 11] Tế bào đại thực bào (BMDM) tách từ xương đùi chuột Sau đó, BMDM phân chia từ đến ngày môi trường DMEM bổ sung với 10% môi trường điều kiện nuôi tế bào L929 (được xem yếu tố kích thích M-CSF (macrophagespecific colony stimulating factor)), 10% FBS, 1mM sodium pyruvate, 50U/ml penicillin, 50 U/ml penicillin, 50 μg/ml streptomycin, and 5×10−5M 2-mercaptoethanol 3.2 Đánh giá độc tố Allicin tới khả sống BMDM kít CCK-8 Khả sống tế bào đánh giá sử dụng Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo Laboratories, Kumammoto, Japan) 105 BMDMs ủ với Allicin trước 48 nồng độ 10, 20, 30 (µg/ml) Sau trình này, 10µl dung dịch CCK-8 đưa vào macrophage ủ với Allicin nồng độ khác Giá trị hấp thụ 450 nm mẫu tính tỉ lệ phần trăm so với mẫu không sử lý với Allicin (xem 100% tế bào sống) 3.3 Sản xuất Allicin từ tỏi [14] Sản xuất tinh thể deoxyalliin - L-cysteine allyl bromide tạo phản ứng để tạo L-deoxyalliin ban đầu: + L-cysteine hòa tan ethanol tuyệt đối + Bổ sung thêm sodium hydroxide tạo môi trường bazơ + Bổ sung allyl bromide từ từ tới kết tủa vào môi trường lạnh + Để yên môi trường phòng + Trung hòa phản ứng tới pH 5,5 nơi lạnh để tạo tinh thể L-deoxyalliin - Tinh tinh thể L-deoxyalliin: + Hòa tan L-deoxyalliin thô acetic acid (1%) + Bổ sung thêm ethanol tuyệt thể tích gấp 15 lần + Bay cồn thiết bị bay chân không thu tinh thể L-deoxyalliin tinh Sản xuất alliin - Deoxyalliin bổ sung thêm nước khuấy - Bổ sung hydrogen peroxide vào dung dịch dạng nhỏ giọt - Bổ sung thêm methanol, khuấy - Bổ sung hydrogen peroxide giọt khuấy nhiệt độ thích hợp Sản xuất Allicin - Tìm điều kiện thích hợp (hàm lượng Alliin bổ sung, nhiệt độ, thời gian, pH) cho phản ứng Alliin Allinaze để tạo hàm lượng Allicin nhiều nhất: + Đối với tìm điều kiện thích hợp cho hàm lượng Alliin: - Lấy gram Alliin hòa tan 20 ml nước cất Sau bổ sung thêm 1, 2, 4, 6, 8, 10 gram tỏi tươi (tỏi lý sơn) nghiền nát - Ủ hỗn hợp bổ sung Alliin phần 4ºC 20 phút - Tiếp tục lấy mẫu để phân tích hàm lượng Allicin tạo thành phương pháp HPLC + Đối với tìm điều kiện thích hợp cho thời gian: - Lấy gram Alliin hòa tan 20 ml nước cất Sau bổ sung thêm gram tỏi tươi (tỏi lý sơn) nghiền nát - Ủ hỗn hợp bổ sung Alliin phần 4ºC khoảng thời gian 20, 40, 60, 90, 120 phút - Tiếp tục lấy mẫu để phân tích hàm lượng Allicin tạo thành phương pháp HPLC + Đối với tìm điều kiện thích hợp cho nhiệt độ: - Lấy gram Alliin hòa tan 200 ml nước cất Sau bổ sung thêm gram tỏi nghiền nát - Ủ hỗn hợp bổ sung Alliin 4, 8, 10, 18, 25ºC 20 phút - Tiếp tục lấy mẫu để phân tích hàm lượng Allicin tạo thành phương pháp HPLC + Đối với tìm điều kiện thích hợp cho pH: - Lấy gram Alliin hòa tan 200 ml nước cất Sau bổ sung thêm 1gram tỏi tươi (tỏi lý sơn) nghiền nát - Ủ hỗn hợp bổ sung Alliin 4ºC điều chỉnh pH= 4, 5, 6, 7, 60 phút - Tiếp tục lấy mẫu để phân tích hàm lượng Allicin tạo thành phương pháp HPLC - Phân tích Allicin tạo thành phương pháp HPLC +Từ diện tích píc mẫu Allicin sản xuất đường chuẩn Allicin xác định hàm lượng Allicin theo công thức: % w/w allicin = C x FV x D x 100% W(1000µg/mg) Ở đây: C hàm lượng Allicin có mẫu đem phân tích (µg/mL), suy dựa vào đường chuẩn Allicin FV thể tích cuối mẫu đem phân tích (mL) D độ phã lỗng mẫu đem phân tích có W khối lượng mẫu (mg) 3.4 Tinh Allicin sau tạo thành - Hỗn hợp alliin tỏi tươi nghiền nát sau ủ điều kiện thích hợp bổ sung thêm diethyl ether Sau tách lớp thu phần dịch tiến hành đông khô thu Allicin tinh khiết 3.5 Phân tích hàm lượng Allicin HPLC (của hãng simadzu) [14] - 1ml mẫu dịch mg bột Allicin sau đơng khơ hịa tan 1ml methanol Sau dung dịch phá bọt bể siêu âm - Đưa đệm methanol lên cột C18 đảo pha - Đưa dịch lên cột tốc độ 1,2 ml/phút - Sau sử dụng pha động gồm acetonitrile: đệm phosphate (0,01N, pH=2,5): 85:15 - Đo bước song UV 372 nm 3.6 Đánh giá khả sản xuất cytokine ELISA Kit (BD Bioscience) a Đưa vào giếng 100  l Capture antibody pha dung dịch đệm Coating buffer theo tỉ lệ 1/250 Ủ qua đêm 40C b Rửa lại lần dung dịch rửa với 200  l/giếng c Thêm 200  l/giếng dung dịch Assay Ủ 1h nhiệt độ phòng d Rửa lại lần dung dịch rửa e Bổ sung mẫu chuẩn có chứa kháng ngun thể tích 100  l/giếng Ủ 2h nhiệt độ phòng f Rửa lại lần dung dịch rửa g Thêm 100  l/giếng dung dịch Worrking detector gồm: Dung dịch Assay +Detection antibody + Sav - HRP.Ủ 1h nhiệt độ phòng h Tiến hành rửa đĩa lần dung dịch rửa i Tiếp tục bổ sung 100  l dung dịch develop vào giếng Ủ đĩa 30 phút bóng tối j Cuối cùng, thêm vào giếng 50  l dung dịch stop để dừng phản ứng Đọc máy đọc ELISA Biorad, sử dụng bước song 540nm 3.7 Phân tích hiệu ức chế đường tín hiêụ MAPK (p38) trình phoshoryl hóa p47 phox Allicin gây viêm zymosan sử du ̣ng ky ̃ thuâ ̣t western blot BMDM sử lý với Laminarin galactan 60 phút trước ủ với Allicin (30 µg/ml) Dexamethasone (100 nM) 45 phút Sau tế bào đươ ̣c xử lý với zymosan (100 µg/ml) Dịch chiết tế bào thu sau phá tế bào chạy điện di gel 12% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) chuyển lên màng PVDF (GE Healthcare) Màng ủ với kháng thể thứ phosphor-p38, p38 tổng số, ser435, p45 phox (Invitrogen) tổng số Sau đó, màng ủ với kháng thể thứ hai kháng kháng thể IgG (GE Healthcare) Liên kết kháng thể phát chất làm tăng phát quang hóa 3.8 Xây dưṇ g mô hin ̀ h in vivo gây bệnh nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng chuô ̣t sử du ̣ng zymosan [4] 3.8.1 Gây nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng chuột tiêm Zymosan Chuột có độ tuổi từ 8-10 tuần (khoảng 18-22 gram) gây nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng bằ ng cách tiêm da bụng với zymosan 2mg/kg Khả sống chuột tính cách tiếng 40 đầu tiếp tục tính cách 10 80 tiếp sau 3.8.2 Đánh giá hiệu chống viêm Allicin sử dụng chuột bị nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng phân tích khả sống sót chuột Chuột có độ tuổi từ 8-10 tuần (khoảng 18-22 gram) tiêm với liều lượng khác Allicin (20mg/kg, 30mg/kg) Sau đó, tiêm zymosan chuột tiêm không tiêm với Allicin 3.8.3 Đánh giá hiệu ức chế sản xuất cytokine tiền viêm (TNF-α, IL-6) huyết chuột Chuột tiêm với nồng độ khác Allicin (20mg/kg, 30mg/kg) Sau đó, chuột tiêm khơng với Allicin tiêm với Zymosan Tiếp sau, lấy huyết xác định TNF-α, IL-6 kít ELISA 3.8.4 So sánh hiệu kháng viêm chất nghiên cứu chấ t đố i chứ ng Dexamethasone điều trị chuột bị nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng Chuột có độ tuổi từ 8-10 tuần (khoảng 18-22 gram) chia thành nhóm khác và thực gây nhiễm trùng nặng choáng khuẩn Chuột tiêm với Allicin (30mg/kg) Dexamethasone (2mg/kg) [9] Sau đó, tiêm với zymosan (2mg/kg) Khả sống chuột tính cách tiếng 40 đầu tiếp tục tính cách 10 80 tiếp sau 3.8 Phân tích thống kê Đối với phân tích thống kê, số liệu lấy từ kết độc lập , thể ý nghĩa ± SD phân tích student’s t-test với điều chỉnh Bonferroni ANOVA nhiều phép so sánh Sự khác sẽ ý nghĩa P< 0.05 Tổng kết kết nghiên cứu 4.1 Phương pháp sản xuất Allicin sử dụng tỏi Việt Nam 4.1.1 Allicin tạo từ tỏi tươi Để xác định thời gian thích hợp, gram tỏi tươi nghiền nát ủ nhiệt độ 4ºC thời điểm khác Kết phân tích hàm lượng Allicin tạo thành HPLC bảng cho thấy với thời gian ủ khác lượng Allicin tạo thành thấp tương đương với 1,8% Bảng 1: Hàm lượng Allicin tạo thành phụ thuộc vào thời gian Thời gian (phút) Hàm lượng Allicin tạo thành (%) 20 40 60 90 120 0,2 0,6 0,1 1,8 1,8 4.1.2 Allicin tạo từ tỏi tươi phụ thuộc vào alliin bổ sung Để xác định lượng alliin thích hợp, gram Alliin bổ sung vào tỏi tươi nghiền nát trọng lượng khác giống phần phương pháp Kết phân tích hàm lượng Allicin tạo thành dịch phương pháp HPLC bảng cho thấy lượng Allicin tạo thành cao so với không bổ sung alliin tương đương với 7,4% Bảng 2: Hàm lượng Allicin tạo thành phụ thuộc alliin Trọng lượng tỏi tươi (gram) Hàm lượng Allicin tạo thành (%) 10 7,4 7,2 7,4 7,3 7,4 4.1.3 Phản ứng Alliin Allinaze tạo thành Allicin phụ thuộc vào thời gian Để xác định phản ứng Alliin Allinaze phụ thuộc vào thời gian, gram Alliin bổ sung vào tỏi tươi nghiên nát phần phương pháp Kết phân tích hàm lượng Allicin bảng cho thấy lượng Allicin tạo thành phản ứng phụ thuộc vào thời gian để phản ứng xảy hoàn toàn Thời gian để phản ứng xảy cho hàm lượng Allicin cao sau 90 phút với lượng Allicin tạo thành tương đương với 6,1% Bảng 3: Hàm lượng Allicin tạo thành phụ thuộc vào thời gian Thời gian (phút) Hàm lượng Allicin tạo thành (%) 20 40 60 90 120 5,9 6,2 6,5 6,3 4.1.4 Phản ứng Alliin Allinaze tạo thành Allicin phụ thuộc vào nhiệt độ Để xác định phản ứng Alliin Allinaze phụ thuộc vào nhiệt độ, gram Alliin bổ sung vào tỏi tươi nghiền nát phần phương pháp Kết phân tích hàm lượng Allicin tạo thành bảng cho thấy lượng Allicin tạo thành phản ứng phụ thuộc vào nhiệt độ để phản ứng xảy hoàn toàn Nhiệt độ để phản ứng xảy cho hàm lượng Allicin cao 18ºC sau 20 phút với lượng Allicin tạo thành tương đương 6,8% Bảng 4: Hàm lượng Allicin tạo thành phụ thuộc vào nhiệt độ Nhiệt độ (ºC) Hàm lượng Allicin tạo thành (%) 10 18 25 6,1 5,9 6,8 6,5 4.1.5 Phản ứng Alliin Allinaze tạo thành Allicin phụ thuộc vào pH Để xác định phản ứng Alliin Allinaze phụ thuộc vào pH, gram Alliin bổ sung vào gram tỏi tươi nghiền nát phần phương pháp Kết phân tích hàm lượng Allicin dịch bảng cho thấy lượng Allicin tạo thành phản ứng phụ thuộc vào pH để phản ứng xảy hoàn toàn pH để phản ứng xảy cho hàm lượng Allicin cao với lượng Allicin tạo thành tương đương 7% pH Hàm lượng Allicin tạo thành (%) Bảng 5: Allicin tạo thành pH 5,9 6,5 6,3 5,4 Hàm lượng phụ thuộc vào Sau tìm điều kiện thích hợp dựa vào bảng 1, 2, 3, 4, bổ sung thêm gram Alliin gram tỏi tươi (tỉ lệ 1:2) điều kiện pH= 5, nhiệt độ 18ºC thời gian cho phản ứng xảy 90 phút cho kết Allicin nhiều đạt 7,9% Kết thu thấp so với patent công bố khoảng 8,3% [14] 4.2 Sơ đồ sản xuất Allicin Sản xuất tinh thể deoxyalliin Bổ sung thêm dịch tỏi tươi, pH= 5, nhiệt độ 18ºC Sản xuất Alliin Dịch Allicin (thời gian ủ 90 phút) Làm ethyl ether Đông khô Kiểm tra bột thu HPLC Bột Allicin Hình 1: Sơ đồ sản xuất Allicin từ tỏi tươi 4.3 Đánh giá khả tinh Allicin sau sản xuất Allicin sau sản xuất theo quy trình đánh giá độ tinh phương pháp HPLC giống phần phương pháp Allicin chuẩn hãng Sigma chạy kiểm tra thiết bị HPLC (hãng simadzu, cột C18 đảo pha) với bước sóng 372 nm (hình 2) Sau đó, Allicin sản xuất phân tích cho kết sắc ký đồ hình mAU 100 372nm,4nm (1.00) mAU 100U 372nm,4nm (1.00) 75 75 50 50 25 25 0 0.0 2.5 5.0 10.0 7.5 12.5 15.0 17.5 0.0 Hình 2: Sắc ký đồ Allicin chuẩn (Sigma) 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 Hình 3: Sắc ký đồ Allicin sản xuất Từ kết sắc ký đồ hình hình cho thấy Allicin sản xuất có pick giống với pick Allicin hãng Sigma cho gần pick Điều khẳng định sản phẩm Allicin thu có độ tinh cao Để đánh giá độ tinh Allicin tạo thành, từ Allicin hãng Sigma sử dụng để tạo đường chuẩn tuyến tính tương ứng nồng độ khác 10, 20, 30, 40, 50 µg/ml (hình 4) Dựa vào diện tích pick nồng độ khác Allicin chuẩn xây dựng đường chuẩn Allicin hình mAU 1(#1) Ch1 372nm 2(#1) Ch1 372nm 3(#1) Ch1 372nm 100 4(#1) Ch1 372nm 5(#1) Ch1 372nm Conc.(x10) 5.0 4.0 75 3.0 50 2.0 25 1.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 18.0 19.0 0.0 20.0 Hình 4: Diện tích pic tương ứng 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 6000000 7000000 8000000 9000000 10000000 11000000 12000000 Area Hình 5: Đường chuẩn Allicin Từ cơng thức phần phương pháp tính bột Allicin thu 92,8% 4.4 Khả sống tế bào không bị ảnh hưởng Allicin Để khẳng định Allicin có gây độc tế bào BMDM hay khơng, BMDM chia vào giếng khác đĩa nuôi tế bào 96 giếng với mật độ 1x105 Sau đó, BMDM ủ với 10 μl kit đếm tế bào Kết này, cho thấy Allicin khả gây độc với BMDM nồng độ đánh giá (hình 5) ĐC 10 20 30  g/ml Hình 6: Allicin khơng gây độc tế bào BMDMs BMDMs nuôi với mật độ 1×105 tế bào/ giếng Sau 3-4 ngày, tế bào xử lý với Allicin nồng độ 10, 20, 30 μg/ml Các tế bào sống đo kit đếm tế bào Dữ liệu sai số ba thí nghiệm độc lập 4.5.Allicin ức chế trình sinh cytokine tiền viêm BMDM kích thích zymosan Để đánh giá hiệu Allicin trình ức chế viêm, BMDM ủ với nồng độ khác Allicin 45 phút nồng độ 5, 10, 20, 30, 40 µg/ml ủ tiếp với zymosan sau 18 Từ hình cho thấy Allicin ức chế trình sản xuất cytokine tiền viêm TNF-α, IL-6 không với IL-10 Với nồng độ 30 µg/ml Allicin ức chế sinh cytokine cho hiệu tốt TNF-α ? Nồng độ cytokine (pg/ml) IL-6 IL-10 IL- Hình 7: Allicin ức chế trình sinh cytokine tiền viêm BMDM kích thích zymosan 1x 105 BMDMs từ chuột ủ với Allicin nồng độ khác 45phút trước ủ với zymosan 100 µg/ml Dịch sau tế bào ủ với zymosan 18h đánh giá trình sản xuất cytokine ELISA kit (BD Bioscience) Dịch thu sau 18h đánh giá phân tích ELISA Các kết biểu sai số thí nghiệm độc lập DC-: đối chứng âm, DC+: đối chứng dương (với zymosan) 4.6 Alicin điều hịa q trình sinh cytokine tiền viêm thơng qua thụ thể Dectin-1 Allicin điều tra xem có khả ức chế trình sản xuất cytokine zymosan kích thích Đối với mục đích này, BMDMs ủ với nồng độ tăng dần laminarin, chất ức chế hoạt động thụ thể Dectin-1 [4], polysaccharide 10 galactan nồng độ khác Tiếp theo, tế bào ủ với Allicin (hình 8A), Dexamethasone (hình 8B) trước ủ với zymosan Tế bào ủ với laminarin xuất trình sinh cytokine ngược lại với tế bào khơng xử lý với laminarin hình 8A Trái lại, tế bào xử lý với polysaccharide galactan cho kết giống tế bào xử lý với Allicin Giống kết hình 8A, kết hình 8B cho kết tương tự (điều công bố theo [4]) Từ kết gợi ý thụ thể Dectin-1 có vai trị q trình Allicin truyền tín hiệu ức chế zymosan kích thích sinh cytokine tiền viêm BMDMs Nồng độ cytokines (ng/ml) Nồng độ cytokines (ng/ml) TNF- 4800 3600 A TNF- 4800 B 3600 2400 2400 1200 1200 0 IL-6 8000 6000 6000 4000 4000 2000 2000 IL-6 8000 IL-12p40 800 600 600 400 400 200 200 IL-12p40 800 M SC SC M SC lam ALLICIN Zym gal SC lam gal Dex Zym Hình 8: Allicin Dexamethasone điều hịa q trì nh đáp ứng viêm kích thích zymosan thông qua thụ thể dectin-1 BMDMs ủ ban đầu với chất đối vận với thụ thể Dectin nồng độ Laminarin (0,1, 0,25, 0,5mg/ml), polysacaride galactan (0,1,0,25,0,5mg/ml) với dung môi đối chứng (0,1%DMSO) 60 phút trước xử lý Allicin (30 µg/ml) (ở hình A) Dex (Dexamethasone, 100 nM) (ở hình B) 45 phút Dịch tế bào lấy sau ủ với zymosan đánh giá nồng độ cytokine phương pháp ELISA Kết thí nghiệm thí nghiệm độc lập M: mơi trường; Sc: khơng có Allicin; Lam: Laminarin; gal: galactan; Dex: dexamethasone; Zym: zymosan 4.7 Khả ức chế Allicin q trình phospho hóa MAPK BMDM kích thích zymonsan thơng qua thụ thể Dectin-1 BMDM tiền xử lý với Allicin Sau tế bào đươ ̣c xử lý cùn g với zymosan Dịch chiết phá vỡ tế bào chạy điện di gel 12% SDS-PAGE chuyển lên 11 màng PVDF Từ hình 9A, cho thấy trình phospho hóa biểu mạnh sau 30 phút p38 ERK1/2 Do vậy, tế bào BMDMs sau tiền xử lý với laminarin Galactan 60 phút Sau đó, ủ với Allicin Dexamthesone, tiếp tục ủ với zymosan 30 phút, thu tế bào tiến hành phân tích western blot Kết thu hình 9A 9B, cho thấy Allicin giống Dexamethasone ức chế trình phospho hóa p38 ERK1/2 thơng qua thụ thể Dectin-1 A B Zym Zym 15 30 60 Allicin 120 240 480 (min ) M SC SC lam Dexa gal SC lam gal P-ERK1/2 P-ERK1/2 ERK1/2 ERK1/2 p-p38 p-p38 p38 p38 Hình 9: Allicin ức chế hoạt động p38, pERK kích thích zymosan A 1x 105 BMDMs ủ với zymosan thời gian định; B Tế bào tiền sử lý với laminarin (0.25 mg/ml) với galactan (0.25 mg/ml) dung dịch DMSO (0,1%) làm đối chứng 60 phút trước ủ với Allicin (30 µg/ml) Dexa (100 nM) 45 phút Sau tế bào kích thích với zymosan (100 µg/ml) 30 phút Tế bào sau phá đệm ủ đá trước phân tích Western bot để phân tích p38 ERK1/2 Kết thí nghiệm thí nghiệm độc lập M; môi trường, SC; lam; laminarin; gal; galactan; Dexa; Dexamethasone, zym; zymosan 4.8 Khả ức chế Allicin q trình oxy hóa BMDM kích thích zymosan thông qua thụ thể Dectin-1 Để đánh giá khả trình ức chế Allicin phosphoryl hóa p47phox kích thích zymosan tế bào BMDM phân tích phần phương pháp Kết hình 10A xuất trình phosphoryl hóa Ser 345 khoảng thời gian từ 15-30 phút sau tế bào kích thích zymosan Sau tế bào BMDM ủ với laminarin galactan trước ủ với Allicin Dexa ủ với zymosan 15 phút Kết hình 10B Allicin ức chế trình phosphoryl hóa Ser 345 tế bào ủ với zymosan Tuy nhiên, trình bị phá vỡ tế bào tiền xử lý laminarin không với galactan Những kết Allicin có khả tham gia vào q trình điều hịa hoạt động phosphoryl hóa p47phox thơng qua thụ thể Dectin-1 A Zym 15 B Allicin Zym 30 60 120 (min) M SC SC Lam Gal Zym Dex M SC SC Lam Gal p-ser345 p-ser345 p47phox p47phox Hình 10: Allicin ức chế q trình phosphoryl hóa p47phox thông qua thụ thể Dectin-1 BMDM kích thích zymosan (100 µg/ml) theo thời gian định (A) Tế bào tiền xử lý với laminarin (0.25 mg/ml) polysaccharide galactan (0.25 mg/ml) 60 phút trước ủ với Allicin (30µg/ml) Dexa (100nM) 45 (B) Sau tế bào ủ với zymozan (100 µg/ml) 15 12 Sau tế bào xử lý phân tích Western blot với anti–phospho-Ser345–p47phox Ab (p-Ser345) anti-p47phox Ab (p47phox) M, mơi trường; SC, dung mơi kiểm sốt (DMSO); Lam, laminarin; Gal, polysaccaride galactan; Dex, Dexamethasone Kết lặp lại lần độc lập 4.9 Đánh giá khả điều trị Allicin chuột bị nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng Để đánh giá khả điều trị Allicin cho chuột bị nhiễm trùng nặng choáng nhiễm trùng, chuột tiêm không với Allicin (20, 30 mg/kg) trước 24 Sau đó, lơ chuột tiêm zymosan (2 mg/kg) Hình 11A, 100% chuột chết sau ngày nhận zymosan khoảng 30% chuột sống sót nhận Allicin (30mg/kg, P