Các phương pháp chỉnh tương phản trong kính hiển vi

Nội dung Tổng quan kính hiển vi Carl Zeiss Kính hiển vi quang học (Light Microscopes) Kính hiển vi tia X (X-ray Microscopes) Kính hiển vi điện tử (Electron Microscopes) Hiển vi quang học (Light Microscopy) Hiển vi quang học đại cương o Các phận kính hiển vi o Ba thơng số hiển vi quang học o Phân loại kính hiển vi quang học Kính hiển vi phức hợp (Compound Microscopes) o o o o Các loại kính hiển vi phức hợp Carl Zeiss Hai hệ dẫn quang kính hiển vi phức hợp Các phương pháp chỉnh tương phản kính hiển vi phức hợp Chụp, xử lí phân tích hình ảnh hiển vi Kính hiển vi soi (Stereo Microscopes) Hiển vi tia X (X-ray Microscopy) Hiển vi điện tử (Electron Microscopy) Các phương pháp chỉnh tương phản Trường sáng (Brightfield) - Kỹ thuật chỉnh tương phản truyền thống, thường để quan sát mẫu nhuộm sinh học, mẫu vật liệu tự nhiên Ứng dụng hai hệ: thấu quang phản quang H&E staining of gastric mucosa - brightfield Thin section of bone - brightfield Các phương pháp chỉnh tương phản Trường tối (Darkfield) - Quan sát cấu trúc nhỏ, mức giới hạn độ phân giải kính - Ứng dụng hai hệ: thấu quang phản quang - Ánh sáng chiếu trực tiếp bị chặn Diatom - Chỉ ánh sáng tán xạ, khúc xạ phép qua - N.A vật kính phải nhỏ N.A tụ quang Brightfield - Đường dẫn quang phải sạch! Dark field Các phương pháp chỉnh tương phản Phân cực (Polarization) - Quan sát cấu trúc có tính lưỡng chiết quang (vd: tinh thể…) - Ứng dụng hai hệ: thấu quang phản quang Polarizer (Analyzer) Brightfield Pol - Mọi tia sáng qua kính phân cực thứ (Polarizer 1) có hướng Specimen Interaction - Kính phân cực (Polarizer 2) triệt tiêu ánh sáng có hướng trùng với hướng tia sáng qua Polarizer Polarizer - Chỉ tia sáng bị đổi hướng qua mẫu vật cảm biến ghi lại Các phương pháp chỉnh tương phản Phản pha (Phase Contrast) • Dr Frits Zernike, The Netherlands 1934 development, 1953 Nobel Prize • Carl Zeiss, the first one produces commercial Phase Contrast microscope • Quan sát tế bào sống tế bào khơng nhuộm • Cấu trúc mẫu (tế bào) có số chiết quang cao môi trường giảm tốc độ qua ảnh sáng làm nhiễu xạ • Cấu trúc dày Typical phase shift in living cells: l/4 lệch pha rõ • Mắt thường khơng thấy lệch pha • Ứng dụng hệ thấu quang Các phương pháp chỉnh tương phản Phản pha (Phase Contrast) Transmitted Light Contrasting Methods - Light exhibits properties of waves - Light Interference, the addition (superposition) of two waves that results in a new wave pattern wave1 + wave2 180 degree phase shift degree phase shift Các phương pháp chỉnh tương phản Phản pha (Phase Contrast) condenser specimen Phase Stop objective Phase Ring tube lens Diffracted light Retarded light Các phương pháp chỉnh tương phản Phản pha (Phase Contrast) - Biến đặc tính lệch pha ánh sáng thành đặc tính khác biệt mật độ quang - Áp dụng quan sát mẫu mô mỏng, hay tế bào có cấu trúc mảnh, mẫu khơng cần nhuộm Brightfield Phase Contrast - Multi-well plate - Flask - Petri dish Các phương pháp chỉnh tương phản Phản pha: hiệu chuẩn phase stop phase ring Phase Stop microscopy.fsu.edu Alignment (remove one of eyepieces) Ph1 Ph2 Ph3 Phase Ring wikipedia.com microscopy.fsu.edu Các phương pháp chỉnh tương phản Giao thoa biệt hóa (Differential Interference Contrast - DIC) • Tia sáng tách thành chùm sáng hẹp với dao động điều hịa • Hai chùm sáng qua mẫu vật độc lập • Ánh sáng hội tụ so sánh: – Nếu hai chùm sáng qua vùng mẫu có số chiết quang tương tự khơng tạo tương phản – Nếu hai chùm sáng qua vùng mẫu có số chiết quang khác tạo tương phản có thay đổi mật độ quang thơng qua giao thoa • Ứng dụng hai hệ: thấu quang phản quang Các phương pháp chỉnh tương phản Giao thoa biệt hóa (Differential Interference Contrast - DIC) condenser Polarizer & DIC Prism specimen objective DIC Prism tube lens Analyzer Các phương pháp chỉnh tương phản Giao thoa biệt hóa (Differential Interference Contrast - DIC) - Biến đặc tính khác biệt số chiết quang thành khác biệt mật độ quang - Mẫu vật: dày, không nhuộm Brightfield DIC Các phương pháp chỉnh tương phản Giao thoa biệt hóa (Differential Interference Contrast - DIC) Mouse kidney Analyzer DIC Prism Objective Objective Specimen DIC Prism Condenser Polarizer Các phương pháp chỉnh tương phản Giao thoa biệt hóa Plastic (PlasDIC) • Kính đảo ngược • Phối hợp tốt với phản pha • Quan sát tế bào nuôi/đặt đĩa nhựa PlasDIC - Slider Các phương pháp chỉnh tương phản Hiển vi huỳnh quang (Fluorescence Microscopy) Page 79 Huỳnh quang: trình hồi phục xạ Trạng thái kích động singlet Trạng thái kích động triplet Biến đổi nội Giao hệ NĂNG LƯỢNG Hồi phục dao động Hấp thu lượng HUỲNH QUANG Biến đổi nội năng, LÂN QUANG ngoại Hồi phục dao động Trạng thái nghỉ Page 80 Đặc tính chất nhuộm huỳnh quang (Fluorescence dyes) • Ánh sáng kích thích: bước sóng (λ) ngắn hơn, lượng cao • Ánh sáng phát xạ: bước sóng (λ) dài hơn, lượng thấp Page 81 Kích thích ghi huỳnh quang Page 82 Hiển vi huỳnh quang Nguồn sáng (illumination) Đèn thủy ngân (50W 200W) Page 83 Hiển vi huỳnh quang Bộ phin lọc (filter set) Bộ phin lọc (cho dải sáng huỳnh quang riêng biệt) Page 84 10 Hiển vi huỳnh quang Bộ phin lọc (filter set) Kính tách sắc Phin lọc ánh sáng kích thích Phin lọc ánh sáng phát xạ Page 85 Hiển vi huỳnh quang Bộ phin lọc (filter set) Mẫu huỳnh quang Vật kính Đèn hồ quang Màn chập Màn chập Cảm biến hình ảnh Page 86 11 Hiển vi huỳnh quang Bộ phin lọc (filter set) Phân loại kính lọc ánh sáng Cảm biến Nguồn sáng Emission filter Mẫu vật Kích thích Mẫu vật Ghi ảnh huỳnh quang Excitation filter Page 87 Hiển vi huỳnh quang Bộ phin lọc (filter set) Các phin lọc ánh sáng Bộ phin lọc số 01: DAPI Bộ phin lọc số 09: GFP / FITC Bộ phin lọc số 15: Rhodamine / DsRed Page 88 12 Hiển vi huỳnh quang Đường dẫn quang Thiết kế trên-xuống (upright) Thiết kế dưới-lên (inverted) Mẫu huỳnh quang Cảm biến ảnh Vật kính Màn chập Đèn chiếu sáng Đèn chiếu sáng Màn chập Màn chập Màn chập Vật kính Mẫu huỳnh quang Cảm biến ảnh Page 89 Hiển vi huỳnh quang Nhuộm DAPI & Alexa Fluor 488 Tiêu mô não chuột Tế bào dương tính GFAP (Alexa 488) Nhân tế bào (DAPI) Vật kính: Plan-Apochromat 20x/0.75 Page 90 13 Hiển vi huỳnh quang Nhuộm DAPI & Cy3 Tiêu mô ruột non chuột Phản pha + huỳnh quang Tương phản DIC + huỳnh quang Vật kính: EC Plan-Neofluar 20x/0.6 Ph Vật kính: EC Plan-Neofluar 40x/0.75 Tế bào (Cy3) Nhân tế bào (DAPI) Page 91 Hiển vi huỳnh quang Huỳnh quang tiêu sắc (apochromatic) HBO Kính thu sáng Hiệu chỉnh tiêu sắc phức Kính tách ánh sáng Mặt phẳng mẫu vật Điểm hạn chế ảnh huỳnh quang đa kênh Ưu điểm ảnh huỳnh quang đa kênh tiêu sắc phức Page 92 14 Các phương pháp nhuộm huỳnh quang Nguyên lý Nhuộm gì? Huỳnh quang miễn dịch: sử dụng kháng thể gắn chất phát huỳnh quang Các protein tế bào, glycoprotein cấu trúc polysaccharide bề mặt tế bào Nhập bào huỳnh quang: thể phát huỳnh quang đưa bào nhờ chế vận chuyển tế bào Endosomes, lysosomes, phagosomes Chất phát huỳnh quang phụ thuộc tính chất lý hóa mơi trường tế bào bào quan Màng tế bào (DiI), DNA, lưới nội chất , hệ lưới Golgi, ti thể Chất phát huỳnh quang phụ thuộc điện áp môi trường Ti thể (Mitotracker red) Chất phát huỳnh quang đặc hiêu ion Ca2+-imaging (Fura-2, Fluo-4, Calcium green), pH imaging (SNARF-1, BCECF) Gắn protein phát huỳnh quang (fluorescent protein tagging) eGFP, eCFP, eYFP, DsRed mCherry gắn vào protein cần nghiên cứu Page 93 Các phương pháp nhuộm huỳnh quang Page 94 15 Các kít nhuộm huỳnh quang Nghiên cứu hình thái tế bào, sợi actin vi ống loại tế bào khác Adapted from Poster Presentation: "Simultaneous, Quantitative Monitoring of Cytoskeleton Rearrangement and Morphology Changes in Cells Using High Content Analysis " by Suk J Hong, Richik N Ghosh Page 95 Một số ứng dụng kính hiển vi khoa học nơng nghiệp (Open discussion) • • • • Lai tạo Chọn giống trồng Công nghệ sinh học nông nghiệp Thú ý Chăn ni Bảo vệ thực vật • (Video & Photo presentation) Page 96 16 We make it visible h.pham@zeiss.com.sg Một số kính hiển vi Carl Zeiss http://www.zeiss.com.sg 17 Các kiểu kính hiển vi soi Kính soi thường Stemi DV4 Stemi 2000 Độ phóng đại 2,4x 64x Độ phóng đại 1,95x 250x Các kiểu kính hiển vi soi Kính soi dùng nghiên cứu SteREO Discovery.V20 Độ phóng đại 2.3x SteREO Lumar.V12 1312,5x Độ phóng đại 6,4x 375x 18 ... shift Các phương pháp chỉnh tương phản Phản pha (Phase Contrast) condenser specimen Phase Stop objective Phase Ring tube lens Diffracted light Retarded light Các phương pháp chỉnh tương phản Phản... phương pháp chỉnh tương phản Giao thoa biệt hóa Plastic (PlasDIC) • Kính đảo ngược • Phối hợp tốt với phản pha • Quan sát tế bào ni/đặt đĩa nhựa PlasDIC - Slider Các phương pháp chỉnh tương phản Hiển. .. Các phương pháp chỉnh tương phản Giao thoa biệt hóa (Differential Interference Contrast - DIC) condenser Polarizer & DIC Prism specimen objective DIC Prism tube lens Analyzer Các phương pháp chỉnh