chiết xuất, phân lập và thử độc tính tế bào của một số hợp chất từ phần trên mặt đất cây bù ốc leo (dregea volubilis (l f ) benth ex hook f ), họ thiên lý asclepiadaceae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BỘ Y TẾ VŨ THỊ DIỆP CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ THỬ ĐỘC TÍNH TẾ BÀO CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ PHẦN TRÊN MẶT ĐẤT CÂY BÙ ỐC LEO (Dregea volubilis (L.f.) Benth ex Hook.f.), HỌ THIÊN LÝ - ASCLEPIADACEAE LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BỘ Y TẾ VŨ THỊ DIỆP CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ THỬ ĐỘC TÍNH TẾ BÀO CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ PHẦN TRÊN MẶT ĐẤT CÂY BÙ ỐC LEO (Dregea volubilis (L.f.) Benth ex Hook.f.), HỌ THIÊN LÝ - ASCLEPIADACEAE LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LIỆU – DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 8720206 Nơi thực đề tài : Trường Đại học Dược Hà Nội Viện Dược liệu Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Đỗ Thị Hà PGS TS Nguyễn Hoàng Tuấn HÀ NỘI, 2020 LỜI CẢM ƠN Trong q trình nghiên cứu hồn thành luận văn này, nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ thầy cô, nhà khoa học Trường Đại học Dược Hà Nội Viện Dược liệu, đồng nghiệp, gia đình bạn bè Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Đỗ Thị Hà PGS TS Nguyễn Hoàng Tuấn, người thầy dành thời gian, tâm huyết hướng dẫn, giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình học tập nghiên cứu khoa học Tôi xin chân thành cảm ơn anh chị đồng nghiệp Khoa Hóa Thực vật – Viện Dược liệu, thầy cô anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược liệu, Thực vật, Dược học cổ truyền – Trường Đại học Dược Hà Nội giúp đỡ đóng góp ý kiến cho tơi q trình học tập thực nghiên cứu Nhân dịp này, xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học, Thư viện Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thành luận văn Nghiên cứu phần kết đề tài “Nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư điều hòa miễn dịch số thuốc Việt Nam”, tài trợ kinh phí từ nhiệm vụ khoa học công nghệ theo Nghị định thư Việt Nam với Hàn Quốc Lời sau cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình bạn bè ln chia sẻ, ủng hộ tơi suốt q trình học tập vừa qua Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2020 Học viên Vũ Thị Diệp MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC BẢNG DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN 1: TỔNG QUAN .2 1.1 Tổng quan chi Dregea E Meyer 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật .2 1.1.3 Phân bố .2 1.1.4 Thành phần hóa học 1.1.5 Tác dụng sinh học .3 1.2 Tổng quan bù ốc leo 1.2.1 Danh pháp 1.2.2 Đặc điểm thực vật .3 1.2.2 Sinh thái phân bố 1.2.3 Thành phần hóa học 1.2.4 Tác dụng sinh học .9 1.2.5 Tính vị, cơng cơng dụng .13 PHẦN 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 14 2.1.1 Nguyên liệu .14 2.1.2 Hóa chất, dung mơi 14 2.1.3 Máy móc, thiết bị dụng cụ 15 2.2 Phương pháp nghiên cứu 16 2.2.1 Phương pháp chuẩn bị cao chiết .17 2.2.2 Phương pháp phân lập hợp chất .17 2.2.3 Phương pháp đánh giá tác dụng kháng ung thư in vitro 17 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 18 PHẦN 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ .19 3.1 Kết chiết xuất cao chiết ethanol 90% cao chiết phân đoạn từ phần mặt đất bù ốc leo 19 3.2 Kết sàng lọc hoạt tính độc tế bào ung thư HepG2 MKN-7 in vitro cao chiết phân đoạn từ phần mặt đất bù ốc leo 20 3.3 Phân lập hợp chất từ phân đoạn có hoạt tính phần mặt đất bù ốc leo 21 3.4 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập 23 3.4.1 Hợp chất DV1 23 3.4.2 Hợp chất DV2 26 3.4.3 Hợp chất DV3 30 PHẦN 4: BÀN LUẬN 45 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1 Hình ảnh lồi Dregea volubilis (L f) Benth & Hook [1] Hình Các hợp chất polyoxypregnan glycosid từ bù ốc leo Hình Các hợp chất polyhydoxy pregnan từ bù ốc leo Hình Các hợp chất flavonoid từ bù ốc leo Hình Các hợp chất pentacyclic triterpenoid từ bù ốc leo Hình Hình ảnh mẫu nghiên cứu 14 Hình 2 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 16 Hình Quy trình chiết xuất cao chiết từ phần mặt đất bù ốc leo 19 Hình Quy trình phân lập hợp chất từ cao chiết DCM 22 Hình 3 Sắc ký đồ hợp chất phân lập cao chiết DCM 23 Hình Cấu trúc hóa học DV1 .25 Hình Cấu trúc hóa học DV2 .30 Hình Tín hiệu proton nhóm methyl methylen DV3 32 Hình Tín hiệu proton nhóm methoxy proton vùng đường DV3 32 Hình Tín hiệu proton olefin anomeric DV3 .33 Hình Phổ 13C-NMR (500 MHz, MeOD) DV3 34 Hình 10 Phổ DEPT DV3 .34 Hình 11 Phổ HSQC (500/125 MHz, MeOD) DV3 .35 Hình 12 Phổ HMBC (500/125 MHz, MeOD) DV3 37 Hình 13 Phổ COSY (500/500 MHz, MeOD) DV3 .38 Hình 14 Phổ NOESY (500/500 MHz, MeOD) DV3 .39 Hình 15 Cấu trúc hóa học DV3 .42 DANH MỤC BẢNG Bảng 1 Thành phần hóa học bù ốc leo Bảng Kết đánh giá độc tính tế bào cao chiết phân đoạn từ phần mặt đất bù ốc leo dòng tế bào HepG2 20 Bảng Kết đánh giá độc tính tế bào cao chiết phân đoạn từ phần mặt đất bù ốc leo dòng tế bào MKN-7 .20 Bảng 3 Dữ liệu phổ NMR DV1 taraxerol 24 Bảng Dữ liệu phổ NMR DV2 Dregeosid Da1 29 Bảng Dữ liệu phổ NMR phần aglycon DV3 dregeosid H .40 Bảng Dữ liệu phổ NMR phần glycosid DV3 dregeosid Da1 41 Bảng Kết đánh giá độc tính tế bào hợp chất phân lập dòng tế bào ung thư HepG2 .43 Bảng Kết đánh giá độc tính tế bào hợp chất phân lập dòng tế bào ung thư MKN-7 43 DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt 13 C-NMR H-NMR Tiếng anh Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Proton magnetic resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân spectroscopy proton BuOH n-Butanol CC Column chromatography CDCl3 Cloroform-d1 Correlation spectroscopy H- 1H COSY Tiếng việt COX-2 Cyclooxygenase-2 DCM Dichlomethane DEPT Distortionless enhancement by carbon 13 Sắc ký cột Phổ tương quan 1H- 1H polarization transfer Môi trường nuôi cấy tế bào DMSO Dulbecco's modified Eagle’s medium Dimethyl sulfoxide EAC Ehrlich ascites carcinoma Tế bào ung thư biểu mô DMEM không phân biệt Ehrlich EDTA Ethylendiamin tetraacetic acid EtOAc Ethyl acetate EtOH Ethanol FBS Fetal bovine serum Huyết phơi bị HDL High density lipoprotein Lipoprotein tỷ trọng cao HepG2 Hepatocellular carcinoma Tế bào ung thư gan người HMBC Heteronuclear multiple bond Phổ tương tác dị hạt nhân qua connectivity spectrometry nhiều liên kết High-performance liquid Sắc ký lỏng hiệu cao HPLC chromatography HPLC-MS High-performance liquid Sắc ký lỏng khối phổ chromatography-mass Heteronuclear single quantum coherence Phổ tương tác dị hạt nhân qua IC50 Inhibitory concentration of 50% Nồng độ ức chế 50% IFN-γ Interferon gamma IL Interleukin HSQC liên kết Các cytokin liên quan đến đáp ứng viêm miễn dịch iNOS Nitric-oxide synthase LPS Lipopolysaccharide MeOD Methanol-d4 MKN-7 Human gastric carcinoma Tế bào ung thư dày người MS Mass spectroscopy Phổ khối NMR Nucear magnetic resonance Cộng hưởng từ hạt nhân NF-κB Nuclear factor-κB NO Nitric oxide OD Optical density PGE2 Prostaglandin E2 SOD Superoxid dismutase TLC Thin layer chromatography TLTK TNF-α Mật độ quang học Sắc ký lớp mỏng Tài liệu tham khảo Tumor necrosis factor-α TT Thứ tự tt/tt Thể tích/thể tích WHO World health organization Tổ chức Y tế giới ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư loại bệnh phát triển không bình thường tế bào, khơng tn theo chế kiểm soát phát triển thể Đây bệnh gây tử vong đứng thứ hai sau bệnh lý tim mạch Theo thống kê tổ chức Y tế giới (WHO), đến năm 2018 giới có 18,1 triệu ca phát 9,6 triệu trường hợp tử vong [14], [62] Việt Nam thuộc nhóm nước có tỷ lệ mắc bệnh cao nhiều loại ung thư Năm 2018, Việt Nam có khoảng 164671 ca mắc với 114871 trường hợp tử vong – tương ứng với tỉ lệ tử vong gần 70% Trong đó, tỉ lệ mắc bệnh ung thư gan, ung thư phổi, ung thư dày, ung thư vú, ung thư đại trực tràng cao [33] Do đó, việc nghiên cứu phát triển thuốc chống ung thư, thuốc có nguồn gốc thảo dược hợp chất thiên nhiên mối quan tâm hàng đầu ngành công nghiệp dược phẩm giới Việt Nam Cây bù ốc leo có tên khoa học Dregea volubilis (L.f.) Benth ex Hook.f., thuộc họ Thiên lý – Asclepiadaceae Cây trồng nhiều số khu vực vùng cao, dùng loại rau ăn dùng làm thuốc trị bệnh mụn nhọt, áp xe, cảm mạo, viêm phế quản, ung thư gan, gan nhiễm mỡ, đau dày, [1], [4] Các nghiên cứu cho thấy thành phần hóa học bù ốc leo hợp chất khung pregnan [41], [46], [57] Các cao chiết hợp chất phân lập từ bù ốc leo chứng minh có tác dụng chống ung thư [13], [24], [39], [57], chống oxy hóa dọn gốc tự [12], chống viêm giảm đau [11], [22] Mặc dù bù ốc leo nghiên cứu công bố nhiều giới, nhiên, Việt Nam, nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng sinh học lồi cịn hạn chế Chính vậy, chúng tơi thực đề tài “Chiết xuất, phân lập thử độc tính tế bào số hợp chất từ phần mặt đất bù ốc leo (Dregea volubilis (L f.) Benth & Hook), họ Thiên lý - Asclepiadaceae” với mục tiêu sau: Đánh giá độc tính tế bào số dòng tế bào ung thư cao chiết phân đoạn từ phần mặt đất bù ốc leo Phân lập 3-4 hợp chất từ phân đoạn có độc tính tế bào đánh giá độc tính tế bào hợp chất PHỤ LỤC 4: DỮ LIỆU PHỔ CỦA HỢP CHẤT DV3 Cấu trúc hóa học DV3 (20(R)-pregn-5-en-8,11,12,14,20-pentol 3-O-6deoxy-3-O-methyl-β-ᴅ-allopyranosyl-(1→4)-β-ᴅ-cymaropyranosyl-(1→4)-β-ᴅcymaropyranosid) ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BỘ Y TẾ VŨ THỊ DIỆP CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ THỬ ĐỘC TÍNH TẾ BÀO CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ PHẦN TRÊN MẶT ĐẤT CÂY BÙ ỐC LEO (Dregea volubilis (L. f. ) Benth ex. .. tế bào số hợp chất từ phần mặt đất bù ốc leo (Dregea volubilis (L f. ) Benth & Hook) , họ Thiên lý - Asclepiadaceae? ?? với mục tiêu sau: Đánh giá độc tính tế bào số dòng tế bào ung thư cao chiết phân. .. A01 ( 5), Aa1 ( 6), A11 ( 7), C11 ( 8), Kp1 ( 9), glycosid Ka1 (1 0), H (1 1), Dp1 (1 2), Da1 (1 3), Gp1 (1 4), Ga1 (1 5), drevoluosid O (1 6), P (1 7), Q (1 8) Drevogenin A (1 9), drevogenin B (2 0), Polyhydoxy