luận án tiến sĩ nghiên cứu quá trình tiền xử lý và hệ vi sinh vật phân giải vỏ quả cà phê vối (coffea robusta) để lên men tạo ethanol

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP ĐỖ VIẾT PHƯƠNG NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TIỀN XỬ LÝ VÀ HỆ VI SINH VẬT PHÂN GIẢI VỎ QUẢ CÀ PHÊ VỐI (Coffea robusta) ĐỂ LÊN MEN TẠO ETHANOL LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM 2020 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP ĐỖ VIẾT PHƯƠNG MSNCS: P1114004 NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TIỀN XỬ LÝ VÀ HỆ VI SINH VẬT PHÂN GIẢI VỎ QUẢ CÀ PHÊ VỐI (Coffea robusta) ĐỂ LÊN MEN TẠO ETHANOL LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Mã ngành: 62.54.01.01 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS TS LÊ NGUYỄN ĐOAN DUY TS PHẠM VĂN TẤN 2020 LỜI CẢM ƠN Để có kết ngày hơm nay, ngồi phấn đấu nổ lực thân cịn có hỗ trợ lớn từ q Thầy, Cơ, gia đình, người thân bạn bè Xin ghi nhớ gửi lời cảm ơn chân thành đến tất quý vị Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS TS Lê Nguyễn Đoan Duy, người hướng dẫn TS Phạm Văn Tấn, người hướng dẫn phụ Hai thầy truyền cho nhiều kiến thức, thật nhiều kinh nghiệm đặc biệt có ý kiến đóng góp, trao đổi thật bổ ích, thiết thực luận án tiến sĩ Nó nguồn động lực giúp tơi ln ln cố gắng phấn đấu Một lần tơi muốn nói, tơi biết ơn hai thầy Cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS TS Hồ Quảng Đồ, PGS TS Nguyễn Văn Mười, PGS TS Lý Nguyễn Bình, PGS TS Nguyễn Cơng Hà, PGS TS Trần Thanh Trúc hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt tiến trình học tập Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Cần Thơ, Khoa Sau Đại học, Ban chủ nhiệm Khoa Nông nghiệp, Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Phịng thí nghiệm; Phịng ban, Khoa liên quan tạo điều kiện thuận lợi cho học tập nghiên cứu trường Đặc biệt, xin gửi đến Ban Giám hiệu, Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Trường đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh lời cảm ơn chân thành sâu sắc Nhà trường Viện hỗ trợ kinh phí, điều kiện thời gian cho tơi bốn năm học tập nghiên cứu trường Đại học Cần Thơ Bên cạnh đó, tơi thật cảm động trước tình cảm quan tâm giúp đỡ bạn đồng nghiệp trường, xin cảm ơn bạn nhiều Cuối cùng, xin gửi lịng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân luôn ủng hộ, sát cánh bên Cơng ơn tơi xin khắc sâu lịng NCS Đỗ Viết Phương i TÓM TẮT Nghiên cứu thực nhằm xác định phương pháp tiền xử lý thích hợp đối tượng vỏ cà phê vối (Coffea robusta) Đồng thời, nghiên cứu tập trung thu nhận chế phẩm enzyme cellulase từ nấm mốc phân lập từ cà phê Sau q trình ứng dụng enzyme vào trình thủy phân vỏ cà phê so sánh hiệu thủy phân với enzyme thương mại Bên cạnh đó, việc đưa chế độ khử độc dịch thủy phân, thiết lập thơng số cho q trình lên men tạo ethanol quan tâm nghiên cứu Nội dung nghiên cứu trình khử bớt caffeine polyphenol vỏ cà phê ba phương pháp trích ly khác bao gồm: Trích ly thơng thường, trích ly có hỗ trợ vi sóng trích ly có hỗ trợ siêu âm Tiếp sau thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tác nhân tiền xử lý acid, kiềm, vi sóng vi sinh vật hay kết hợp tác nhân đến mức độ suy giảm hemicellulose lignin Trong nội dung thứ hai, tiến hành phân lập nấm mốc có khả sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nguồn: đất trồng, cà phê, thân cành Sau q trình thu nhận enzyme cellulase từ nấm mốc phân lập tác nhân gây kết tủa khác bao gồm: (NH4)2SO4, NaCl, ethanol acetone Enzyme thu nhận với enzyme thương mại sử dụng để thủy phân vỏ cà phê so sánh hiệu kinh tế vấn đề nội dung Bên cạnh đó, để đảm bảo cho q trình lên men thuận lợi dịch thủy phân cần phải kiểm tra loại bỏ số chất có độc tính nấm men Nội dung cuối khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men khảo sát số phương pháp lên men khác Kết nghiên cứu cho thấy, hiệu suất khử caffeine polyphenol phương pháp trích ly có hỗ trợ vi sóng đạt 92,3% (đối với caffeine) 87,7% (đối với polyphenol) cao so với hai phương pháp lại Tuy nhiên, lý kinh tế tính khả thi nên phương pháp trích ly thơng thường nước nóng lựa chọn cho việc khử caffeine polyphenol Khi so sánh phương pháp tiền xử lý khác cho thấy, tiền xử lý phương pháp kết hợp acid-kiềm-vi sóng đạt hiệu cao loại bỏ 71,4% hemicellulose 79,2% lignin o giữ lại 69,5% cellulose điều kiện xử lý: H 2SO4 2% 140 C o thời gian 45 phút, NaOH (0,2 g/g) 120 C thời gian 20 phút vi sóng mức cơng suất 327 W vòng 20 phút Trong số dòng nấm mốc phân lập chủng Trichoderma asperellum QT5 (phân lập từ quả) có khả sinh tổng hợp cellulase hoạt tính cao đạt 1,17 U/mL (CMCase) sau 48 nuôi cấy môi trường lỏng Sau enzyme cellulase thơ tinh sơ ethanol (tỷ lệ ii enzyme:ethanol 1:3,5) hoạt tính CMCase tăng lên đáng kể (21,72 U/mL) Ngoài ra, ứng dụng enzyme cellulase thu nhận vào trình thủy phân lên men kết cho thấy, đường khử tạo dịch thủy phân enzyme cellulase thu nhận 26,02 g/L thấp so với thủy phân enzyme thương mại Viscozyme (43,26 g/L) hàm lượng ethanol tạo thành thấp 13,8% Đồng thời, nghiên cứu rằng, phương pháp lên men SHF cho hiệu thủy phân cao SSF SHF+SSF không xem xét đến mặt thời gian ngược lại phương pháp lên men SSF cho hiệu thủy phân cao xét khoảng thời gian Từ khóa: Ethanol, sinh khối lignocellulose, Trichoderma asperellum, thu nhận cellulase, tiền xử lý, thủy phân cellulose, vỏ cà phê iii ABSTRACT The aim of the study was to determine the most suitable pretreatment method for coffee pulp (Coffea robusta) In addition, the study also focused on recovery of mold cellulase enzyme from coffee berries After that, this enzyme was used in hydrolysis of the coffee pulp Hydrolysis efficiency of the enzyme was compared with that of commercial enzymes Besides, the condition of hydrolysate detoxification and parameters of the ethanol fermentation process were also studied The first research content was to eliminate caffeine and polyphenols from coffee pulp using three different extraction methods including maceration, microwave-assisted extraction and ultrasound-assisted extraction Then, experiments were to investigate the effects of pretreatment agents such as acid, alkali, microwave and microbiological or a combination of the agents on removing of hemicellulose and lignin In the second research, the isolation of mold which has high biosynthesis capacity to cellulase collected from various sources such as soil, branches, trunks, coffee pods The third research was the recovering process of cellulase enzyme from the mold isolated using various precipitating agents: (NH4)2SO4, NaCl, ethanol and acetone The cellulase enzyme (crude) and commercial enzyme were used to hydrolyze the coffee pulp Then, the economic efficiency in coffee pulp hydrolysis were compared between the two enzymes Besides, to ensure that the fermentation was perfect, the hydrolyzate needs to be tested to remove some substances that were toxic to yeast The final content was to study some main factors affecting the fermentation process as well as to investigate some different fermentation methods The result showed that the eliminating efficiency of caffeine and polyphenols using the microwave-assisted extraction method reached 92.3% and 87.7% for caffeine and polyphenols, respectively These were higher than those of the other methods However, due to economic aspects and feasibility, the maceration was also selected for decaffeine and depolyphenols process When comparing different pretreatment methods, it revealed that the pretreatment in combination of dilute acid, dilute alkali and microwave was the most effective method, By the combination method, 69.5% of cellulose was retained; while 71.4% of hemicellulose and 79.2% of lignin were removed under treatment o conditions as follows: H2SO4 2% at 140 C for 45 minutes, alkali pretreated with o NaOH 0.2 g/g biomass at 120 C for 20 minutes, and microwave at 327 W for 20 minutes Among five strains of molds isolated, Trichoderma asperellum QT5 had the highest activity of cellulase biosynthesis and reached iv to 1.17 U/mL (CMCase) after 48 hours of culture in a basic liquid medium Then, the crude enzyme was purified using ethanol (enzyme:ethanol ratio was 1:3.5), the CMCase activity increased significantly (21.72 U/mL) In addition, when using the recovery cellulase enzyme for the hydrolysis and fermentation processes, the results indicated that the reduction sugar in the hydrolyzate using the recovery cellulase was 26.02 g/L lower than that of the commercial Viscozyme (43.26 g/L) but ethanol content was only 13.8% lower Furthermore, result of the study also showed that the SHF fermentation method was more effective hydrolysis than SSF and SHF + SSF if ignoring the fermentation time By contrast the SSF fermentation method was more effective hydrolysis than the others in the same fermentation time Keywords: Biomass lignocellulose, cellulose hydrolysis, coffee pulp, enzyme recovery, ethanol, pretreatment, Trichoderma asperellum v LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án hoàn thành dựa kết nghiên cứu kết nghiên cứu chưa dùng cho luận án cấp khác Cần Thơ, ngày tháng Người hướng dẫn Người thực Lê Nguyễn Đoan Duy Đỗ Viết Phương vi năm MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii ABSTRACT iv LỜI CAM ĐOAN vi DANH SÁCH BẢNG x DANH SÁCH HÌNH xii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xv Chương 1: GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 1.3.1 Đối tượng nghiên cứu: 1.3.2 Phạm vi nghiên cứu: 1.4 Ý nghĩa luận án 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 1.5 Điểm luận án Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Nguyên liệu cà phê 2.1.1 Giới thiệu vỏ cà phê vối 2.1.2 Một số ứng dụng từ vỏ cà phê 2.1.3 Khả kháng vi sinh vật caffeine polyphenol 10 2.2 Sinh khối lignocellulose (nguyên liệu sản xuất ethanol sinh học) 11 2.2.1 Cấu tạo tính chất cellulose 13 2.2.2 Cấu tạo tính chất hemicellulose 15 2.2.3 Cấu tạo tính chất lignin 18 2.3 Quá trình thủy phân vỏ cà phê 19 2.3.1 Cơ chế phân hủy sinh học cellulose 20 2.3.2 Cơ chế thủy phân hemicellulose 22 2.3.3 Cơ chế phân hủy lignin 26 2.4 Một số phương pháp tiền xử lý sinh khối lignocellulose 27 2.4.1 Tiền xử lý acid 28 2.4.2 Tiền xử lý kiềm 31 vii 2.4.3 Tiền xử lý vi sinh vật 33 2.5 Giới thiệu nấm mốc Aspergillus Trichoderma 36 2.5.1 Giới thiệu Aspergillus niger 36 2.5.2 Giới thiệu Trichoderma .37 2.5.3 Ảnh hưởng thành phần môi trường đến trình sinh tổng hợp enzyme cellulase 38 2.6 Thực trạng sản xuất ethanol giới Việt Nam 42 2.6.1 Tình hình sản xuất ethanol giới 42 2.6.2 Tình hình sản xuất ethanol Việt Nam 44 2.7 Các nghiên cứu nước 46 2.7.1 Một số nghiên cứu tiền xử lý sinh khối lignocellulose .46 2.7.2 Một số nghiên cứu sản xuất ethanol từ sinh khối lignocellulose 48 Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 52 3.1 Phương tiện nghiên cứu 52 3.1.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 52 3.1.2 Nguyên liệu hóa chất 52 3.1.3 Dụng cụ thiết bị 53 3.2 Phương pháp nghiên cứu 54 3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu 54 3.2.2 Các phương pháp phân tích đo đạc .55 3.2.3 Phương pháp thu thập xử lý kết 56 3.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 57 3.3.1 Xác định thành phần hóa học vỏ cà phê vối 58 3.3.2 Nội dung 1: Khảo sát trình tiền xử lý vỏ cà phê 58 3.3.3 Nội dung 2: Thu nhận enzyme cellulase từ nấm mốc 66 3.3.4 Nội dung 3: Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân .70 3.3.5 Nội dung 4: Khảo sát yếu tố ảnh hưởng trình lên men .74 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .78 4.1 Xác định thành phần hóa học vỏ cà phê vối 78 4.2 Ảnh hưởng phương pháp tiền xử lý đến thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose lignin .79 4.2.1 Ảnh hưởng phương pháp trích ly đến hiệu suất khử caffeine polyphenol 79 4.2.2 Tối ưu hóa thơng số q trình khử caffeine polyphenol .82 4.2.3 Ảnh hưởng trình tiền xử lý H2SO4 đến thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose lignin .84 4.2.4 Ảnh hưởng trình tiền xử lý NaOH đến thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose lignin .90 viii PHỤ LỤC C: KẾT QUẢ GỬI MẪU PHÂN TÍCH Kết định danh chủng vi sinh vật phân lập a Aspergillus niger 200 201 b Trichoderma longibrachitaum 202 203 c Trichoderma asperellum 204 205 d Phanerochaete chrysosporium 206 207 Kết phân tích caffeine, ethanol, glucose HPLC 208 PHỤ LỤC D: MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM Hình PL D.1: P chrysosporium ni cấy ngày Hình PL D.2: Nhân giống chủng P chrysosporium 209 Hình PL D.3: Quả cà phê mốc Hình PL D.4: Đất trồng cà phê Hình PL D.5: Thân cành cà phê 210 Hình PL D.6: Vi sinh vật phát triển đất, cành cà phê Hình PL D.7: A niger T asperellum phân lập từ cà phê Hình PL D.8: T longibrachiatum P Chrysosporium phân lập từ cà phê 211 Hình PL D.9: Nguyên liệu ban đầu Hình PL D.10: Nguyên liệu sau tiền xử lý Hình PL D.11: Xác định hàm lượng chất xơ 212 Hình PL D.12: Chuẩn bị mẫu tiền xử lý Hình PL D.13: Tiền xử lý chủng P chrysosporium sau 10, 15 20 ngày Hình PL D.14: Kết tủa enzyme thơ 213 Hình PL D.15: Xây dựng đường chuẩn Hình PL D.16: Nhân giống nấm men Hình PL D.17: Dịch thủy phân Hình PL D.18: Lên men dịch thủy phân 214 ... ĐỖ VI? ??T PHƯƠNG MSNCS: P1114004 NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TIỀN XỬ LÝ VÀ HỆ VI SINH VẬT PHÂN GIẢI VỎ QUẢ CÀ PHÊ VỐI (Coffea robusta) ĐỂ LÊN MEN TẠO ETHANOL LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ... ? ?Nghiên cứu trình tiền xử lý hệ vi sinh vật phân giải vỏ cà phê vối (Coffea robusta) để lên men tạo ethanol? ?? 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Sử dụng tác nhân acid, kiềm, vi sóng... ảnh hưởng đến trình lên men phương pháp lên men dịch thủy phân để tạo ethanol 1.3 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 1.3.1 Đối tượng nghiên cứu: Vỏ cà phê vối (Coffea robusta): Quả cà phê vối tươi thu