Sàng lọc và kiểm tra cây ngô chuyển gen

Sàng lọc và kiểm tra cây ngô chuyển gen

SÀNG LỌC VÀ KIỂM TRA CÂY NGÔ CHUYỂN GEN

TS Phạm Thị Lý Thu

Viện Di truyền nông nghiệp

Lây nhiễm vi khuẩn với phôi và nuôi cộng sinh

Nuôi phục hồi phôi biến nạpChuẩn bị dịch vi khuẩn

QUY TRÌNH TẠO CÂY NGÔ CHUYỂN GEN

Tạo và chọn lọc mô sẹo chuyển genTạo chồi và Chọn lọc chồi chuyển gen

Tái sinh và Chọn lọc cây chuyển gen hoàn chỉnhChuyển

Sàng lọc

0 AS200uM AS

Quá trình Chuyển

Gen đã được thực hiện chưa?

Tạo và chọn lọc mô sẹo chuyển gen

Tác nhân chọn lọc:

kháng sinh / PPT / mannose

Tạo và chọn lọc mô sẹo chuyển gen

NGUYÊN TẮC

• So với các tế bào Eukaryot khác, tế bào thực vật có thêm lớp thành

xenlulose vững chắc ở bên ngoài Do đó, việc tách ADN tổng số từ thực vật gặp phải những phức tạp và khó khăn Có rất nhiều phương pháp tách chiết, tinh sạch ADN khác nhau và cũng thành công trên nhiều đối tượng thực vật Nguyên tắc chung của các phương pháp này là:

• Sử dụng các biện pháp cơ học (nghiền mô trong đá khô, nitơ lỏng, bằng chày cối sứ) để phá vỡ thành tế bào thực vật, giải phóng các thành phần bên trong.

• Sử dụng chất tẩy (CTAB) để phá vỡ màng tế bào, giải phóng ADN.• Sử dụng các hoá chất (phổ biến là EDTA) để bảo vệ ADN khỏi các

nuclease nội bào.

• Sử dụng các hoá chất (chloroform, isoamyl alcohol, phenol, ) để loại protein và các tạp chất ra khỏi dung dịch chứa ADN.

• Thu hồi ADN bằng tủa (trong cồn hay isopropanol) và ly tâm.

PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ

• Tris HCl, 1M pH7,5.

• NaCl 5M.

• Bước 2: Nghiền 0,75 (g) mô lá thực vật bằng Nitơ lỏng (bằng chày thuỷ tinh

hoặc sứ ) cho đến khi thành dạng bột mịn.

• Bước 3: Hoà tan mẫu đang nghiền trong đệm chiết, nghiền thêm một chút

để tạo dạng đồng chất.

• Bước 4: Ủ mẫu ở 650C trong 30 phút (lắc đều, đảo nhẹ 3-5 lần) trong quá

trình ủ.

• Bước 5: Thêm một thể tích dung dịch bao gồm chloroform và isoamyl

alcohol (C:I) theo tỷ lệ 24:1, lắc đều.

• Bước 6: Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút.

• Bước 7: Chuyển pha trên sang ống sạch và thêm một thể tích dung

dịch C:I, lắc đều.

• Bước 8: Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút.

• Bước 9: Chuyển pha trên sang ống sạch Thêm 2/3 thể tích EtOH

100% có bổ sung CH3COONa, 3M (pH = 5,2) hoặc tốt hợp là thêm 2/3 thể tích isopropanol.

• Bước 10: Để mẫu ở -200C từ 3 giờ trở lên và ly tâm 13.000 vòng/phút,

trong 10 phút ở 40C thu tủa.

• Bước 11: Rửa tủa bằng EtOH 80%, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5

phút ở 40C.

• Bước 12: Để khô không khí, hoà tan trong dung dịch TE 0,1X.

• Bước 13: Thêm RNase A để đạt nồng độ cuối cùng là 100mg/ml, ủ

370C trong 1 giờ.

• ADN tích điện âm Trong điện trường sẽ di chuyển về

cực dương.

• Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào kích thước và độ tích điện.

• ADN thường được điện di trên hai loại gel: agarose và acrylamid (gel acrylamid có độ phân giải cao hơn).

ĐIỆN DI ADN

Nồng độ agarose thường dùng phụ thuộc vào kích thước sản phẩm ADN cần phân giải (dao động từ 0,5% - 3%).

0,1 - 32,0

0,2 - 41,5

0,4 - 61,2

0,5 - 70,9

0,8 - 100,7

1 - 200,6

5 - 600,3

Kích thước mảnh ADN (kb)% agarose

Stt

• Chuẩn bị: Agarose dạng bột hoà trong dung dịch điện di

TBE (Tris Borat EDTA) hoặc TAE (Tris Acetat EDTA) Đun nóng, đổ vào khuôn.

Đệm điện di:

• TAE thường gây kiềm hoá cực dương, axit hoá cực âm

sau mỗi lần điện di cần trộn.

• Điện thế và thời gian điện di:

• Là hai yếu tố liên quan lẫn nhau (điện di ở điện thế thấp

thì thời gian dài hơn).

• Tuỳ thuộc chiều dài 2 điện cực để tính hiệu điện thế

Không nên chạy quá 5V/cm (chiều dài 2 điện cực 30cm thì điện thế ≤ 150V)

• Độ phân giải kém khi hiệu điện thế cao.

• Băng ADN < 600bp chạy trong gel 12 – 20cm khoảng 3-4

giờ, điện thế 80 - 100 V là tốt.

Đệm nhuộm ADN (loading buffer)

• Dùng nhuộm mẫu ADN trước khi điện di.

• Thành phần: Bromophenol blue, Xylencyanol FF và glycerol

(hoặc đường saccarose).

• Bromophenol blue, Xylencyanol FF: mầu xanh, tím xẫm.• Giúp tra mẫu ADN vào giếng điện di và theo dõi hướng,

khoảng cách di chuyển của ADN trong gel.

• Các chất mầu di chuyển tương đương đoạn ADN 0,5kb nên có

thể quan sát để dừng điện di ở thời gian thích hợp.

• Glycerol, đường có trọng lượng riêng lớn, chìm trong dung dịch

đệm điện di làm ADN bị dìm và giữ trong giếng cho tới khi điện di.

Điện di gel polyacrylamide

• Gel acrylamide có độ phân giải cao ở nồng độ 5 - 6% có thể

phân tách được mảnh ADN chỉ hơn kém nhau 1 nucleotid Còn gọi là gel phân tích trình tự ADN (Sequencing gel).

• Dùng điện di sản phẩm AFLP, SSR (microsatellite)

Phát hiện ADN trong gel

• Trong gel agarose: ADN trong gel được nhuộm bằng

• Trong gel polyacrilamide: gel được ngâm trong dung dịch

nitrat bạc, ADN sẽ tương tác khi bổ sung formaldehyt ở pH kiềm, ion bạc chuyển thành nguyên tử bạc (Ag) tạo kết tụ ==> hạt bạc mầu xám ==> phát hiện băng ADN.

• Bổ sung chất phụ gia Potassium permanganet, potassium frrriayamid ==> tăng độ nét.

Phương pháp định tính, định lượng ADN

– A260nm=1,0 OD=50 microg/ml ADN sợi đôi– A260nm=1,0 OD=33 microg/ml ADN sợi đơn– A260nm=1,0 OD=40 microg/ml ARN

• Phương pháp điện di

• Bản chất của kỹ thuật PCR (phản

ứng chuỗi trùng hợp, phản ứng chuỗi nhờ polymerase) là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo các đoạn ADN với tốc độ

nhanh chưa từng thấy và độ chính xác cao được thực hiện trong máy chu kỳ nhiệt (máy PCR)

• Kỹ thuật PCR được Karry Mullis

phát minh 1985

Phân tích PCR

(Polymerase Chain Reaction)

Các yêu cầu cần thiết cho PCR

• 2 mồi tổng hợp oligonucleotide (20-30 nucleotide) có trình tự

bổ sung với trình tự của đoạn ADN cần nhân dòng

• ADN khuôn (đoạn ADN cần nhân dòng)

• ADN polymerase chịu nhiệt (Taq-polymerase)• 4 loại nucleotide (dATP, dGTP, dCTP, dTTP )• Mg++, dung dịch đệm thích hợp, pH,

Khuôn ADN được biến đổi thành 2 sợi đơn (94 0C, 5 phút)

Gắn primer vào đầu đoạn ADN (55 0C, 30 giây)

Tổng hợp chuỗi ADN mới (65-75 0C, 2-5 phút)

Biến đổi để tách sợi ADN mới thành 2 đơn (94 0C, 30 giây)

Chu trình PCR

Các yếu tố khác ảnh hưởng đến hiệu quả PCR

• Độ tinh sạch của ADN khuôn

• Hoạt động của Enzym ADN polymerase

• Nồng độ các loại nucleotid

• Nồng độ các dung dịch đệm, Mg++,

Ưu điểm nổi bật của kỹ thuật PCR

• Có thể sử dụng trực tiếp ADN vừa tách chiết, không cần

tinh sạch.

• Đoạn ADN làm khuôn không cần tách chính xác, tính đặc

hiệu của phản ứng do các oligo nucleotid làm mồi quyết định.

• Lượng ADN dùng làm khuôn ít (1µg)

• Tốc độ nhân dòng cao: N=2(A-2)

+A số chu kỳ PCR

+N số đoạn ADN nhân được

Các ứng dụng của PCR

• Giúp tách nhanh và chính xác từng gen hoặc từng đoạn ADN

riêng biệt.

• Chẩn đoán nhanh, nhạy tất cả các bệnh di truyền và nhiễm trùng

(ung thư, virus, vi khuẩn, nấm )

• Xác định nhanh với độ chính xác cao các thủ phạm hỡnh sự, quan

hệ di truyền từ những dấu vết rất nhỏ: giọt máu, nước bọt, sợi tóc

• Xác định trinh tự ADN tự động

• Khôi phục các gen của nhiều loài sinh vật tồn tại cách đây hàng

chục triệu năm.

CÁC BƯỚC CƠ BẢN CỦA PCR

PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại của 3 bước cơ bản:

1 Biến tính hay tách sợi ADN kép thành sợi đơn (denaturing) Nhiệt độ: 94-95oC

Thời gian: vài chục giây đến 1 phút2 Gắn mồi vào sợi ADN (annealing) Nhiệt độ tuỳ thuộc Tm của mồi Thời gian: 30 - 60 giây

3 Kéo dài chuỗi mới (extending)

Nhiệt độ: 72oC (sau khi có Taq ADN Polymerase) Thời gian: 30 giây đến vài phút.

Một số bước phụ: Khởi động nóng (hot start)

Kéo dài thời gian tổng hợp chuỗi

Nồng độ các thành phần chính của PCR sử dụng Taq ADN polymerase

Tính nghiêm ngặt (stringency) của PCR

K thu t lai ADN (Southern hybridization)ỹậ(mang tên Southern E.M phát minh ra)

Nguyên tắc: Dựa vào sự ghép cặp Watson-Crick đặc hiệu giữa

hai đoạn ADN có trình tự bổ sung để nhận biết các (mẫu) ADN đích.

Nếu một oligo có chiều dài n nucleotit thì khả năng lai đặc hiệu (trong điều kiện khắt khe) là A/4n

Trong đó A là kích thước của hệ gen đối tượng cần lai tính bằng bp

Các bước tiến hành:

1 Thiết kế mẫu dò (oligo đặc hiệu/suy biến, số mẫu, độ dài)2 Lựa chọn phương pháp đánh đấu (phóng xạ hay

huỳnh quang)

Các bước lai ADN

a) Phân tách các đoạn ADN bằng điện di trên gel agarose

b) Làm biến tính ADN bằng kiềm và chuyển hay thẩm tách các băng lên màng nylon hay nitrocellulose

c) Cố định ADN sợi đơn trên màng bằng nhiệt hay UV

d) Tiền lai màng với ADN không đặc hiệu, sau đó rửa bỏ các ADN dư thừa

e) Lai màng với mẫu dò đặc hiệu, rửa bỏ các mẫu dò gắn không đặc hiệu

f) Phát hiện các mẫu lai bằng tự chụp phóng xạ hay huỳnh quang.

g) Đối chiếu kết quả trên bản film để tìm ra các băng ADN laiđặc hiệu với mẫu dò.

Phân tách ADN b ng i n di v lai v i m u dòằ đ ệ à ớ ẫ

A Sau khi i n diđ ệ B Sau khi lai v hi n nhà ệ ả

1 2 3 1 2 3

Lai ADN ( DNA Hybridisation)

5’ GGGAGAGGATGTAGCCTGCTTCGT…3’ ||||||||||||||||||||||||

3’ CCCTCTCCTACATCGGACGAAGCA…5’ Target5’ GGGAGAGGATGTAGCCTGCTTCGT…3’ Probe

+

5’ GGGAGAGGATGTAGCCTGCTTCGT…3’

3’ CCCTCTCCTACATCGGACGAAGCA…5’ Target5’ GGGAGAGGATGTAGCCTGCTTCGT…3’ Probe

denatured

5’ GGGAGAGGATGTAGCCTGCTTCGT…3’

3’ CCCTCTCCTACATCGGACGAAGCA…5’ Target5’ GGGAGAGGATGTAGCCTGCTTCGT…3’ Probe

||||||||||||||||||||||||

annealed

Hybridisation can label one molecule out of a complex mixture

DNA mix

Annealed mix

Detection

DNA tổng số các dòng ngô chuyển gen

được cắt bằng BamHI

DNA được thẩm tách lên màng nylon và lai với mẫu dò

Kết quả lai DNA của các dòng ngô chuyển gen

Phân tích đánh giá cây chuyển gen bằng Southern blot

K thu t th m tách mi n d ch/Western blottingỹậẩễị

Cơ chất

Sản phẩm có màu

❖ Tách protein hay kháng nguyên và gây kháng thể ở trên động vật A

trên màng

kháng lại KN tương ứng) Rửa bỏ các KT dư

để kháng lại phần Fc trên IgG của động vật A) Rửa bỏ KT thứ cấp dư

❖ Ủ màng với hỗn hợp cơ chất của enzym tương ứng (HRP

hay AP) đã được gắn sẵn trên phân tử KT thứ cấp

Các bướ ơ ảc c b n c a th m tách mi n d chủẩễị

M D7( LM) D2(SP) D5(LG) D9(LG) D16(LG) M D7( LM) D2(SP) D5 (LG) D9(LG) D13(LG)