Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các hợp chất cacbonyl αβ không no phân lập từ các cây thuốc dân tộc Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN NGHĨA VŨ NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC HỢP CHẤT CACBONYL αβ KHÔNG NO PHÂN LẬP TỪ CÂY THUỐC DÂN TỘC VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI - 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN NGHĨA VŨ NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC HỢP CHẤT CACBONYL αβ KHÔNG NO PHÂN LẬP TỪ CÂY THUỐC DÂN TỘC VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 60 44 27 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Văn Ngọc Hƣớng HÀ NỘI - 2014 MỤC LỤC Trang CHƢƠNG I 1.1 Nhóm chức cacbonyl αβ khơng no 1.1.1 Đặc điểm cấu tạo nhóm chức cacbonyl α β không no 1.1.2 Hoạt tính sinh học nhóm cacbonyl αβ khơng no 1.1.3 Các hợp chất cacbonyl αβ không no số thuốc Việt Nam 1.3Vài nét bệnh ung thƣ nguyên nhân gây bệnh 15 1.3.1 Khái niệm ung thư 15 1.3.2 Nguyên nhân gây bệnh 15 1.3.3 Phát chuẩn đoán ung thư 16 1.4 Bệnh dày vi khuẩn Helicobacter pylori 17 CHƢƠNG TÊN ĐỀ TÀI, MỤC TIÊU, NỘI DUNG PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 20 2.1 Tên đề tài 20 2.2 Mục tiêu đề tài 20 2.3 Nội dung nghiên cứu 20 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 21 2.5 Các phƣơng tiện nghiên cứu 21 2.5.1 Các thiết bị nghiên cứu 21 2.5.2 Các hóa chất dung mơi 21 2.5.3 Dòng ung thư 21 2.5.4 Helicobacter pylori 21 2.6 Thực nghiệm 21 2.6.1.Phân lập Tonkinin từ khổ sâm Bắc Bộ 21 2.6.2 Phân lập Zerumbone từ gừng gió 22 2.6.3 Phân lập Curcumin I (Bis feruloylmetan) 23 2.6.4 Phân lập Rutin từ hoa hòe (Sophora Japonica L) 24 2.7 Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ gan ung thƣ vú 25 2.7.1.Phương pháp phân tích 25 2.7.2.Dòng tế bào 25 2.7.3.Môi trường nuôi cấy 25 2.7.4.Các dụng cụ dùng lần 25 2.7.5.Chất chuẩn chứng dương tính 25 2.7.6.Tính kết 25 2.8.Thử nghiệm hoạt tính chống HP hợp chất phân lập đƣợc 26 2.8.1.Phương pháp 26 2.8.2.Hóa chất mơi trường 26 2.8.3.Chuẩn bị mơi trường ni cấy có mẫu cần thử tính diệt khuẩn 26 2.8.4.Chuẩn bị canh khuẩn thử nghiệm 27 2.8.5.Pha loãng mẫu để thử nghiệm: đạt nồng độ 10mg/1ml 27 2.8.6.Nuôi cấy chủng vi khuẩn 27 2.8.7.Kiểm tra tính diệt khuẩn 27 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29 3.1.Đề tài mục tiêu 29 3.2.Phân lập hợp chất cacbonyl αβ không no thuốc dân tộc chọn 33 3.2.1.Phân lập Tonkinin từ khổ sâm Bắc Bộ 33 3.2.2.Phân lập Zerumbone từ củ gừng gió 35 3.2.3.Phân lập Curcumin từ củ nghệ vàng 37 3.2.4.Phân lập Rutin từ hoa hòe 39 3.3.Khảo sát hoạt tính sinh học chất phân lập đƣợc 40 3.3.1.Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư chất phân lập 41 3.3.2.Khảo sát hoạt tính diệt vi khuẩn Helicobacter Pylori (HP) chất phân lập 44 KẾT LUẬN 46 Danh mục bảng biểu Bảng 1.1: Hằng số vật lý 13 dẫn suất ent kauran 10 Bảng 3.1: Số liệu phổ 1H & 13C-NMR Tonkinin 34 Bảng 3.2: Số liệu phổ 1H & 13C -NMR Zerumbone 36 Bảng 3.3: Số liệu phổ 1H & 13C -NRM hợp chất Của Curcumin I 38 Bảng 3.4: Hàm lượng % tế bào ung thư sống sót sau phép thử 41 Bảng 3.5: Nồng độ ức chế tối thiểu chất thử tế bào ung thư 42 Bảng 3.6: Kết thử tiêu diệt HP chất phân lập 45 LỜI CẢM ƠN Trong thời gian nghiên cứu thực luận văn này, nhận giúp đỡ nhiệt tình quan, tổ chức cá nhân Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới tất tập thể, cá nhân tạo điều kiện giúp đỡ suốt trình thực nghiên cứu luận văn Trước hết xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Khoa Hóa, Phòng Đào tạo Khoa Sau đại học nhà trường thầy cô giáo, người trang bị kiến thức cho tơi suốt q trình học tập Với lòng biết ơn chân thành sâu sắc nhất, xin trân trọng cảm ơn thầy giáo- PGS.TS Văn Ngọc Hướng, người thầy trực tiếp bảo, hướng dẫn khoa học giúp đỡ suốt q trình nghiên cứu, hồn thành luận văn Tơi xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến đồng chí, đồng nghiệp Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất Vắc xin Sinh phẩm Y tế tạo điều kiện thuận lợi cho học tập nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn tất bạn bè, đồng nghiệp động viên, giúp đỡ nhiệt tình đóng góp nhiều ý kiến q báu để tơi hồn thành luận văn Do thời gian nghiên cứu có hạn, luận văn hẳn tránh khỏi sơ suất, thiếu sót, tơi mong nhận đuợc đóng góp thầy giáo toàn thể bạn đọc Xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 25 tháng 12 năm 2014 TÁC GIẢ LUẬN VĂN Nguyễn Nghĩa Vũ Đặt vấn đề Với diện tích 33 vạn km2và 1/3 rừng núi lại nằm vùng nhiệt đới gió mùa độ ẩm cao, mưa nắng nhiều, thảm thực vật nước ta vơ phong phú đa dạng Theo thống kê nhất,hiện nước ta có 12 nghìn lồi thực vật khác nhau, đặc biệt có 320 lồi thực vật dùng y học dân tộc để chữa bệnh[1] Đây nguồn tài nguyên phong phú đất nước Nghiên cứu hoạt chất thuốc dân tộc để chữa bệnh cho người không nhiệm vụ chiến lược lâu dài mà nguồn cảm hứng thú vị Nghiên cứu khơng có ý nghĩa khoa học với việc tìm kiếm chất mới, chất có tác dụng sinh học q giá chữa bệnh hiểm nghèo, mơ hình chất chữa bệnh cho tổng hợp hóa học mà cịn góp phần làm đại hóa y học dân tộc đất nước Trong năm gần đây, hợp chất có nhóm cacbonyl αβ khơng no nhà khoa học giới đặc biệt quan tâm Hàng năm có hàng chục cơng trình cơng bố hoạt tính chống ung thư, chống viêm…của loại hợp chất Theo hướng này, quan tâm đặc biệt loại hợp chất cacbonyl αβ không no số thuốc y học cổ truyền dân tộc với đề tài: “Nghiên cứu hoạt tính sinh học hợp chất cacbonyl α β không no phân lập từ thuốc dân tộc Việt Nam” CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Nhóm chức cacbonyl αβ khơng no 1.1.1 Đặc điểm cấu tạo nhóm chức cacbonyl αβ khơng no Khung sở nhóm chức có nguyên tử oxy nguyên tử cacbon R2 R3  C  C R4 O C R1 Hình 1.1 Đáng ý, nguyên tử cacbon có lai hóa sp2 Ở nhóm cacbonyl, liên kết σ tạo thành xen phủ orbital py của2 oxi orbital lai hóa sp2 nguyên tử cacbon1; liên kết π tạo hành do xen phủ orbital pz oxi với orbital khơng lai hóa ngun tử cacbon Ở liên kết đơi α β, liên kết hình thành xen phủ orbital lai hóa sp2 nguyên tử cabon cacbon 2; Còn liên kết hình thành xen phủ orbital pz khơng lai hóa ngun tử cacbon Mô tả spin điện tử π, hình 1.2 Hình 1.2 Nếu nhóm ngun tử cacbon khơng có hiệu ứng khơng gian mặt phẳng điện tử π song song với cách tuyệt đối liên kết π liên hợp với thành orbital π phân tử Như hình 1.3 R1 R2 O R3 R4 Hình 1.3 Nhưng đây, oxi có độ âm điện lớn nên hút đơi điện tử π với cabon lệch phía kèm theo đơi điện tử π Cα Cβ lệch phía Cα Kết lơi kéo làm xuất điện tích dương phần ngun tử Cβ (Hình 1.4) Chính phân cực liên kết đơi αβ nhóm cacbonyl gây làm nên khác biệt liên kết đôi với liên kết đôi hợp chất nhóm cacbonyl liên hợp    O  Hình 1.4 1.1.2 Hoạt tính sinh học nhóm cacbonyl αβ khơng no Chính cấu trúc đặc biệt mà ngồi tính chất hóa học thơng thường liên kết đơi cộng hợp điện tử, oxy hóa, khử hóa, nhóm cacbonyl khơng no cịn xuất phản ứng đặc biệt gọi phản ứng Michael; Đó phản ứng cộng hợp nhân vào liên kết đôi αβ cacbon β hợp chất cacbonyl αβ khơng no[2] xuất phản ứng mà hợp chất có nhóm cacbonyl αβ khơng no có hoạt tính sinh học q hợp chất có liên kết đơi khác khơng có, đáng ý hoạt tính chống ung thư chống viêm Minh chứng cho vấn đề này, chúng tơi lấy Zerumbone Humulene làm ví dụ Zerumbone Sesquiterpenxeton vịng lớn αβ khơng no, có cơng thức cấu tạo hình 1.5a tên hóa học 2,6,9,9- Tetramethyl-E,E,E-cycloundecatri-2,6,9-ene-1-one Phụ lục 18 65 Phụ lục 19 66 Curcumin từ nghệ vàng Phụ lục 20 67 Phụ lục 21 68 Phụ lục 22 69 Phụ lục 23 70 Phụ lục 24 71 Phụ lục 25 72 Phụ lục 26 73 Phụ lục 27 74 Phụ lục 28 75 Rutin từ hoa hòe Phụ lục 29 76 Phụ lục 30 77 Tài liệu tham khảo Võ Văn Chi; 1997 Từ điền công thức thuốc Việt Nam, NXB Y học, trang 335-338 Michael Reaction Wikipedia org/Wiki/Michael Reaction Dev 1960,Serquiterpene in the oil of Zingber zerumbet Sm in India, Tetrahedron 8,171-180, Heshu Sulaiman Rahman et al; 2014,Biomeidicinal properties of a Natural dietary plant metabolite, Zerumbone in cancers therapy and chemoprevention trials Biomed Research international 10,20711-20722, Sharifath Sakynah SA et al; 2007,Zerumbone induced apoptosis in liver cancer cells via modulation of Bax/Bel-2 ratio Cancer cell Intermational 7:4, 1186-1200 Siddig Ibrahim Abdelwahab et al; 2010, Zerumbone induce apoptosis in T-acute lympro- blastie leukemia cells Leukemia Research 35, 268-271 Bolyung Sung et al 2009, Zerumbone abolishes RANKL-Inducel NF-kB actiration Inhibits Osteoclastogenesis and Suppresses Human Breast cancer Inducel Bone loss in Athymic Nude Mice Cancer Res 69, 1477-1484, Abdul et al 2009,United States Patent Application Publication Pub N0 US 2009/ 0239953A1, Sep 24 Yasunori Takada et al 2005, Zerumbone abolishes NF-kB and I-kB kinase activation leading to suppression of antiapoptotic and metastatic gene expression, upregulation of apoptosis, and downregulation of invasion Oncegene 24, 6957-6969- 78 10.Akira Murakami et al 2002, Zerumbone, a Southeast Asian ginger sesquiterpene, markedly suppresses free radical generation, proinflammatory protein production, and cancer cell proliferation accompanied by apoptosis: the alpha,betaunsaturated carbonyl group is a prerequisite Carcinogenesis 23;795-802; 11.Văn Ngọc Hướng cộng 2004, Gừng gió (Zingiber Zerumbet Sm) vùng Tam Đảo nguyên liệu quí cho tiền chế Zerumbone Tạp chí khoa học Cơng nghệ 44-65-69; 12.Murakami A et al 1999, Identification of zerumbone in Zingiber zerumbet Smith as a potent inhibitor of 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate-induced Epstein-Barr virus activation Biosci.Biotechnol Biochem 63,1811-1822 13.Đỗ Tất Lợi 1991, Những thuốc vị thuốc Việt Nam NXB KH-KT 14.Phan Tống Sơn, Văn Ngọc Hướng, Phạm Minh Giang, Taylor W.C 1999, Đóng góp vào việc nghiên cứu hoạt chất sinh học từ khổ sâm cho ( Croton Tonkinensis Gagnep Tạp chí Hóa học 27, 1-3 15.Geofrey N.Roth et al 1998, Novel Bioactivities of Curcuma longa constituents J.Nac.Prod 61; 542-545 16.Trần Cơng Khanh 1998, Tìm hiểu phân loại hịe Việt Nam Tạp chí Dược học 6; 127-130 17-VI Wikipedia org/wiki/ung thư Wikipedia tiếng việt 18- VI Wikipedia org/viêm loét Wikipedia tiếng việt 79